- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
1. IntroductionWhite asparagus (Asp
1. Introduction
White asparagus (Asparagus officinalis L.) is a highly valuable vegetable, especially in Germany. From botanical point of view, they are “developmentally immature” and retain their high physiological activity in postharvest. Its popularity is mainly due to its unique flavour and its high content of health promoting secondary plant compounds such as flavonoids and phenolic acids. Due to air pollution-induced stratospheric ozone depletion, total UV-B (280–315 nm) radiation drastically increased in recent years.
Though only a small portion of the total solar spectrum, UV-B provokes a variety of photo-biological. There are many reports on potential consequences of an increased UV-B radiation on plants; however, understanding of its effect on biosynthesis of secondary plant metabolites and the underlying mechanisms is rather limited. At present, ultraviolet irradiation(UV-C 200–280 nm; UV-B 280–315 nm) is applied during postharvest for fruits and vegetables to eliminate food-borne pathogens or to delay postharvest ripening and senescence processes. Recent studies reported elicitor effects of low UV-B radiation,
triggering distinct changes in the secondary plant metabolism.This response particularly results in an accumulation of phenoliccompounds. Based on their chemical structure, phenolic compounds act as scavengers of free radicals such as reactive oxygen species (ROS) being overproduced under oxidative stress. Moreover, they may protect plants against high irradiation, especially in case of UV exposure. In postharvest, synthesis of phenolic compounds may be specifically stimulated by low dosages of UV radiation.This effect was exemplarily reported for flavonols in onion,for anthocyanins in peach , strawberry, and apple , as well as for flavonoids in brassica sprouts and black currant. In the biosynthesis of phenolic compounds, several enzymes play an important role. The phenylpropanoid pathway is initiated by the key enzyme phenylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.5). As an essential enzyme in plant defence, PAL can be activated by various stressors, triggering biosynthesis of phenolic compounds. UV-B triggered PAL synthesis was shown, e. g. in rice Arabidopsis, or Betula pendula leaves. Peroxidases (POD, EC 1.11.1.7) are enzymes that either degrade phenolic compounds or activate phenolic precursors for cross-linking or rigidifying cell walls. Furthermore, they are assumed to have free radical scavenging properties, a feature that is influenced by stress, such as UV irradiation. found that an increased peroxidase activity highly correlatedwith increased tolerance to UV radiation. Yannarelli, Gallego, and Tomaro (2006), Lu, Duan, Zhang, Korpelainen, and Li (2009), and Ren, Duan, Zhang, Korpelainen, and Li (2010) supported this assumption and reported the ability of peroxidases to scavenge free radicals and, thus, alleviate UV stress. UV irradiation-induced changes in polyphenol metabolism depend on dosage and duration of stress. Moreover, these changes are also effected by the physiological age of the respective tissue. All these different influences lead to a great variability in all UV-Binduced plant responses. A high gradient of physiological activities within the stemis also known for asparagus spears resulting in different
level of enzyme activities. The aim of this study was to evaluate the impact of postharvest UV-B irradiation on the enzyme activities of PAL and POD, and the mediated flavonoid profile of asparagus spears in morphological different sections (apical and base). For this purpose, different radiation fluence rates and adaptation times were applied. Hence, this study focuses on the age dependence of UV-B effects in physiologically immature and in fully developed tissue of asparagus spears. Furthermore, targeted low-dosage UV-B treatment in postharvest may serve as a useful tool to generate vegetables enriched with functional healthpromoting properties
2. Materials and methods
2.1. Plant material and UV-B treatments
Freshly harvested white asparagus spears of the cultivar ‘Gijnlim’, directly obtained from the “Erzeugergruppe Beelitz” (Beelitz, Germany), were carefully hand-washed, cut to a length of 22 cm and randomly separated into batches (250 g with three repetitions). To apply low to moderate UV-stress and to evaluate temporal dynamics of plants' stress reactions, UV-B dosages and duration of adaptation times were chosen according to various preliminary experiments. Hence, samples were subjected to UV-B irradiation (average fluence rate of 8.2 Ws m−2 at a mean distance of 30 cm) at dosages of either 0.54 kJ m−2 (Low=L) or 1.08 kJ m−2 (Medium=M) using a UV-B fluorescence light source (FL-20SE, 305–310 nm; Philips GmbH, Hamburg, Germany), while control spears were kept untreated. After adaptation times (i.e. time to react on given treatments) of 2 h (indicating fast reactions of primary plant compounds) or 22 h (slower reactions of secondary metabolites), controls and UV-B treated spearswere severed into two morphologically different sections, i.e. the base (0–11 cm) and the apical (11–22 cm) sections. For the determination of PAL and POD activities fresh material was used and stored at−80 °C until analysis. For the determination of the phenolic compound profile, spear sections were lyophilised (Christ Alpha 1–4, Christ, Osterode, Germany) and ground for subsequent extraction and analysis.
2.2. Enzyme activity
Phenylalanine ammonia-lyase (PAL; EC 4.3.1.5.) was determined according. Extraction of the enzyme was carried out by grinding frozen samples with sterile sea sand and a borate buffer solution (pH 8.8) at 4 °C and, thereafter, centrifuged at 11000 rpm at 4 °C for 15 min. For determination of PAL activity, the enzyme substrate phenylalanine was added to the enzyme extract and the solution was incubated at 37 °C for 30 min. Afterwards, the degradation of phenylalanine to hydroxycinnamic acid was measured spectrophotometrically (LKB-Novaspek II, Pharmacia, Freiburg,Germany) at a wavelength of 290 nm for 60min. PAL activity was expressed as pkat mg−1 protein. Protein assay was conducted according to. Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7) activity was determined according to using guaiacol as substrate. Samples were extracted by grinding frozen samples with sterile sea sand in PBS buffer (pH 7.2) at 4 °C. After adding the respective substrate, enzyme solution reacted immediately in presence of hydrogen peroxide and changes in optical density were measured spectrophotometrically (LKB-Novaspek II, Pharmacia, Freiburg, Germany) at 436 nm for 1 min. POD activity was expressed as nkat mg−1 protein. Protein assay was conducted according to.
2.3. Extraction of flavonoids
For the analysis of flavonoids, a modified extraction according to was conducted by using acidified methanol (0.1% hydrochloric acid). Aliquots of 0.5 g ground sample were vigorously mixed with 3 mL of acidified methanol and centrifuged at 3000 rpm for 15 min. The supernatant was collected in a 10 mL volumetric flask. The residue was washed twice with 3 mL acidified methanol and subsequently centrifuged for 15 min. Supernatants were collected and brought to a final volume of 10 mL. These extracts were used for the determination of the phenolic compound profiles.
2.4. Analysis of the flavonoids using HPLC–DAD
Concentrations of selected flavonoids (rutin, kaempferol, quercetin and its derivatives- see Fig. 1)were determined byHPLC–DAD (analytical HPLC, Shimadzu Scientific Instrument, Inc. Columbia,MD, USA; equipped with an autosampler, quaternary HPLC pump and diode array detector). Flavonoids were separated on a Prodigy column (150 mm×3.0 mm, ODS 3, 5 μm, 100 A; Phenomex Ltd., Aschaffenburg, Germany) with a two solvent mobile phase gradient (eluent A=water/acetic acid/acetonitrile [94.5/0.5/5; v/v/v]; eluent B=acetic acid/ acetonitrile [5/95; v/v]). The eluent gradient used for all extracts was described as follows: 0–5 min, 0% B; 5–9 min, 0–4% B; 9–15 min, 4% B; 15–30 min, 4–8% B; 30–
45 min, 8–22% B; 45–50 min, 22–28% B; 50–55 min, 28% B; 55–65 min, 28–45% B. Aliquots (2 mL) of the extract were dried under a stream of nitrogen and then re-dissolved in 0.5 mLmethanol. The resulting extract was purified by solid-phase extraction (SPE) using Polyamid 6–Chromabond cartridges (6 mL, 500 mg; Machery & Nagel, Düren, Germany) pre-conditioned with 2×5 mL of 70% methanol and 2×5 mL of water.
(กราฟ)
Fig. 1. HPLC–DAD chromatogramof asparagus at awavelength of 370 nm (1=quercetin-3,4′-O-diglucoside; 2=rutin; 3=quercetin-4′-O-monoglucoside; 4=quercetin; 5=kaempferol).
Interfering compoundswere elutedwith 2×5 mL of water,while the flavonoids were obtained by elution with 2×5 mL ofmethanol/acetic acid/ watermixture (90/5/5, v/v/v). Samples were dried by a rotary evaporator at reduced pressure and re-dissolved in 0.5 mL methanol (HPLC grade). The injection volume for HPLC–DAD was 20 μL, and the flow rate sets at 1 mL min−1. Quercetin and its derivatives were determined at wavelengths of 325 nm and 370 nm, respectively. Compounds were quantified as quercetin, quercetin-4′-O-monoglucoside (QMG), and quercetin-3,4′-O-diglucoside (QDG). Total concentration of flavonoids (quercetin and its derivatives) was calculated from a calibration curve obtained from a diluted 1mM standard solution of the respective reference compound. Results were expressed as milligrammes per gramme dry weight (mg g−1 DW).
2.5. Statistical calculations
Data were evaluated with SPSS 13.0 (SPSS Inc., USA). Treatment means were statistically compared using the Tukey test (pb0.05). In figures, mean variability of data was indicated by the standard deviation. The experiment was conducted with three replicates per UV-B treatment and adaptation time. Non-treated spears were used as control.
White asparagus (Asparagus officinalis L.) is a highly valuable vegetable, especially in Germany. From botanical point of view, they are “developmentally immature” and retain their high physiological activity in postharvest. Its popularity is mainly due to its unique flavour and its high content of health promoting secondary plant compounds such as flavonoids and phenolic acids. Due to air pollution-induced stratospheric ozone depletion, total UV-B (280–315 nm) radiation drastically increased in recent years.
Though only a small portion of the total solar spectrum, UV-B provokes a variety of photo-biological. There are many reports on potential consequences of an increased UV-B radiation on plants; however, understanding of its effect on biosynthesis of secondary plant metabolites and the underlying mechanisms is rather limited. At present, ultraviolet irradiation(UV-C 200–280 nm; UV-B 280–315 nm) is applied during postharvest for fruits and vegetables to eliminate food-borne pathogens or to delay postharvest ripening and senescence processes. Recent studies reported elicitor effects of low UV-B radiation,
triggering distinct changes in the secondary plant metabolism.This response particularly results in an accumulation of phenoliccompounds. Based on their chemical structure, phenolic compounds act as scavengers of free radicals such as reactive oxygen species (ROS) being overproduced under oxidative stress. Moreover, they may protect plants against high irradiation, especially in case of UV exposure. In postharvest, synthesis of phenolic compounds may be specifically stimulated by low dosages of UV radiation.This effect was exemplarily reported for flavonols in onion,for anthocyanins in peach , strawberry, and apple , as well as for flavonoids in brassica sprouts and black currant. In the biosynthesis of phenolic compounds, several enzymes play an important role. The phenylpropanoid pathway is initiated by the key enzyme phenylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.5). As an essential enzyme in plant defence, PAL can be activated by various stressors, triggering biosynthesis of phenolic compounds. UV-B triggered PAL synthesis was shown, e. g. in rice Arabidopsis, or Betula pendula leaves. Peroxidases (POD, EC 1.11.1.7) are enzymes that either degrade phenolic compounds or activate phenolic precursors for cross-linking or rigidifying cell walls. Furthermore, they are assumed to have free radical scavenging properties, a feature that is influenced by stress, such as UV irradiation. found that an increased peroxidase activity highly correlatedwith increased tolerance to UV radiation. Yannarelli, Gallego, and Tomaro (2006), Lu, Duan, Zhang, Korpelainen, and Li (2009), and Ren, Duan, Zhang, Korpelainen, and Li (2010) supported this assumption and reported the ability of peroxidases to scavenge free radicals and, thus, alleviate UV stress. UV irradiation-induced changes in polyphenol metabolism depend on dosage and duration of stress. Moreover, these changes are also effected by the physiological age of the respective tissue. All these different influences lead to a great variability in all UV-Binduced plant responses. A high gradient of physiological activities within the stemis also known for asparagus spears resulting in different
level of enzyme activities. The aim of this study was to evaluate the impact of postharvest UV-B irradiation on the enzyme activities of PAL and POD, and the mediated flavonoid profile of asparagus spears in morphological different sections (apical and base). For this purpose, different radiation fluence rates and adaptation times were applied. Hence, this study focuses on the age dependence of UV-B effects in physiologically immature and in fully developed tissue of asparagus spears. Furthermore, targeted low-dosage UV-B treatment in postharvest may serve as a useful tool to generate vegetables enriched with functional healthpromoting properties
2. Materials and methods
2.1. Plant material and UV-B treatments
Freshly harvested white asparagus spears of the cultivar ‘Gijnlim’, directly obtained from the “Erzeugergruppe Beelitz” (Beelitz, Germany), were carefully hand-washed, cut to a length of 22 cm and randomly separated into batches (250 g with three repetitions). To apply low to moderate UV-stress and to evaluate temporal dynamics of plants' stress reactions, UV-B dosages and duration of adaptation times were chosen according to various preliminary experiments. Hence, samples were subjected to UV-B irradiation (average fluence rate of 8.2 Ws m−2 at a mean distance of 30 cm) at dosages of either 0.54 kJ m−2 (Low=L) or 1.08 kJ m−2 (Medium=M) using a UV-B fluorescence light source (FL-20SE, 305–310 nm; Philips GmbH, Hamburg, Germany), while control spears were kept untreated. After adaptation times (i.e. time to react on given treatments) of 2 h (indicating fast reactions of primary plant compounds) or 22 h (slower reactions of secondary metabolites), controls and UV-B treated spearswere severed into two morphologically different sections, i.e. the base (0–11 cm) and the apical (11–22 cm) sections. For the determination of PAL and POD activities fresh material was used and stored at−80 °C until analysis. For the determination of the phenolic compound profile, spear sections were lyophilised (Christ Alpha 1–4, Christ, Osterode, Germany) and ground for subsequent extraction and analysis.
2.2. Enzyme activity
Phenylalanine ammonia-lyase (PAL; EC 4.3.1.5.) was determined according. Extraction of the enzyme was carried out by grinding frozen samples with sterile sea sand and a borate buffer solution (pH 8.8) at 4 °C and, thereafter, centrifuged at 11000 rpm at 4 °C for 15 min. For determination of PAL activity, the enzyme substrate phenylalanine was added to the enzyme extract and the solution was incubated at 37 °C for 30 min. Afterwards, the degradation of phenylalanine to hydroxycinnamic acid was measured spectrophotometrically (LKB-Novaspek II, Pharmacia, Freiburg,Germany) at a wavelength of 290 nm for 60min. PAL activity was expressed as pkat mg−1 protein. Protein assay was conducted according to. Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7) activity was determined according to using guaiacol as substrate. Samples were extracted by grinding frozen samples with sterile sea sand in PBS buffer (pH 7.2) at 4 °C. After adding the respective substrate, enzyme solution reacted immediately in presence of hydrogen peroxide and changes in optical density were measured spectrophotometrically (LKB-Novaspek II, Pharmacia, Freiburg, Germany) at 436 nm for 1 min. POD activity was expressed as nkat mg−1 protein. Protein assay was conducted according to.
2.3. Extraction of flavonoids
For the analysis of flavonoids, a modified extraction according to was conducted by using acidified methanol (0.1% hydrochloric acid). Aliquots of 0.5 g ground sample were vigorously mixed with 3 mL of acidified methanol and centrifuged at 3000 rpm for 15 min. The supernatant was collected in a 10 mL volumetric flask. The residue was washed twice with 3 mL acidified methanol and subsequently centrifuged for 15 min. Supernatants were collected and brought to a final volume of 10 mL. These extracts were used for the determination of the phenolic compound profiles.
2.4. Analysis of the flavonoids using HPLC–DAD
Concentrations of selected flavonoids (rutin, kaempferol, quercetin and its derivatives- see Fig. 1)were determined byHPLC–DAD (analytical HPLC, Shimadzu Scientific Instrument, Inc. Columbia,MD, USA; equipped with an autosampler, quaternary HPLC pump and diode array detector). Flavonoids were separated on a Prodigy column (150 mm×3.0 mm, ODS 3, 5 μm, 100 A; Phenomex Ltd., Aschaffenburg, Germany) with a two solvent mobile phase gradient (eluent A=water/acetic acid/acetonitrile [94.5/0.5/5; v/v/v]; eluent B=acetic acid/ acetonitrile [5/95; v/v]). The eluent gradient used for all extracts was described as follows: 0–5 min, 0% B; 5–9 min, 0–4% B; 9–15 min, 4% B; 15–30 min, 4–8% B; 30–
45 min, 8–22% B; 45–50 min, 22–28% B; 50–55 min, 28% B; 55–65 min, 28–45% B. Aliquots (2 mL) of the extract were dried under a stream of nitrogen and then re-dissolved in 0.5 mLmethanol. The resulting extract was purified by solid-phase extraction (SPE) using Polyamid 6–Chromabond cartridges (6 mL, 500 mg; Machery & Nagel, Düren, Germany) pre-conditioned with 2×5 mL of 70% methanol and 2×5 mL of water.
(กราฟ)
Fig. 1. HPLC–DAD chromatogramof asparagus at awavelength of 370 nm (1=quercetin-3,4′-O-diglucoside; 2=rutin; 3=quercetin-4′-O-monoglucoside; 4=quercetin; 5=kaempferol).
Interfering compoundswere elutedwith 2×5 mL of water,while the flavonoids were obtained by elution with 2×5 mL ofmethanol/acetic acid/ watermixture (90/5/5, v/v/v). Samples were dried by a rotary evaporator at reduced pressure and re-dissolved in 0.5 mL methanol (HPLC grade). The injection volume for HPLC–DAD was 20 μL, and the flow rate sets at 1 mL min−1. Quercetin and its derivatives were determined at wavelengths of 325 nm and 370 nm, respectively. Compounds were quantified as quercetin, quercetin-4′-O-monoglucoside (QMG), and quercetin-3,4′-O-diglucoside (QDG). Total concentration of flavonoids (quercetin and its derivatives) was calculated from a calibration curve obtained from a diluted 1mM standard solution of the respective reference compound. Results were expressed as milligrammes per gramme dry weight (mg g−1 DW).
2.5. Statistical calculations
Data were evaluated with SPSS 13.0 (SPSS Inc., USA). Treatment means were statistically compared using the Tukey test (pb0.05). In figures, mean variability of data was indicated by the standard deviation. The experiment was conducted with three replicates per UV-B treatment and adaptation time. Non-treated spears were used as control.
0/5000
1. บทนำขาวหน่อไม้ฝรั่ง (แอสพารากัส officinalis L.) เป็นผักที่มีคุณค่าสูง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในประเทศเยอรมนี จากพฤกษศาสตร์มอง พวกเขาจะ "developmentally immature" และรักษากิจกรรมสรีรวิทยาของพวกเขาสูงในหลัง นิยมเป็นส่วนใหญ่เนื่องจากรสชาติเป็นเอกลักษณ์และเนื้อหาสูงสุขภาพส่งเสริมพืชรองสาร flavonoids และกรดฟีนอ เนื่องจากการลดลงของโอโซน stratospheric เกิดมลภาวะทางอากาศ รังสี UV-B (280-315 nm) รวมอย่างรวดเร็วเพิ่มในปีที่ผ่านมาแม้เพียงส่วนหนึ่งของสเปกตรัมแสงอาทิตย์รวม UV-B เรียกความหลากหลายทางชีวภาพภาพ มีรายงานหลายฉบับเกี่ยวกับศักยภาพผลกระทบของรังสี UV-B ที่เพิ่มขึ้นบนพืช อย่างไรก็ตาม ความเข้าใจผลของการสังเคราะห์ของพืชรอง metabolites และกลไกพื้นฐานได้ค่อนข้างจำกัด ในปัจจุบัน รังสีอัลตราไวโอเลตวิธีการฉายรังสี (UV-C 200-280 nm UV-B 280-315 nm) จะใช้ในช่วงหลังสำหรับผลไม้ และผัก เพื่อกำจัดโรคแบกรับอาหาร หรือชักช้า ripening หลังการเก็บเกี่ยว และกระบวน senescence Elicitor ผลของรังสี UV-B ต่ำ รายงานการศึกษาล่าสุดเรียกการเปลี่ยนแปลงแตกต่างกันในการเผาผลาญพืชรองโดยเฉพาะอย่างยิ่งผลตอบรับนี้ในการสะสมของ phenoliccompounds ตามโครงสร้างเคมี ม่อฮ่อมทำเป็น scavengers อนุมูลอิสระเช่นพันธุ์ปฏิกิริยาออกซิเจน (ROS) เป็น overproduced ภายใต้ความเครียด oxidative นอกจากนี้ พวกเขาอาจปกป้องพืชจากสูงวิธีการฉายรังสี โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีของรังสี ในหลัง สังเคราะห์สารฟีนออาจจะเฉพาะถูกกระตุ้น โดย dosages ต่ำของรังสีลักษณะพิเศษนี้ได้ exemplarily รายงาน สำหรับ flavonols ในหัวหอม สำหรับ anthocyanins ในพีช สตรอเบอร์รี่ แอปเปิ้ล และ สำหรับ flavonoids ในผักงอกและแบล็คเคอ ในสังเคราะห์ม่อฮ่อม เอนไซม์ต่าง ๆ มีบทบาทสำคัญ ทางเดิน phenylpropanoid เป็นผู้เริ่มต้น โดยการคีย์เอนไซม์ phenylalanine แอมโมเนีย-lyase (PAL, EC 4.3.1.5) เป็นเอนไซม์ที่สำคัญในการป้องกันพืช PAL สามารถเรียกใช้ โดยลดต่าง ๆ เรียกการสังเคราะห์ม่อฮ่อม UV-B ที่แสดงการสังเคราะห์ PAL ทริกเกอร์ อีกรัมข้าว Arabidopsis หรือ Betula pendula ใบ Peroxidases (POD, EC 1.11.1.7) เป็นเอนไซม์ที่ย่อยสลายสารประกอบฟีนอ หรือเรียกใช้ฟีนอ precursors cross-linking หรือ rigidifying ผนังเซลล์ นอกจากนี้ พวกเขาจะถือว่ามีคุณลักษณะที่มีผลต่อความเครียด เช่นวิธีการฉายรังสี UV อนุมูลอิสระคุณสมบัติ scavenging พบว่ากิจกรรม peroxidase เพิ่มสูง correlatedwith เพิ่มค่าเผื่อรังสียูวี Yannarelli, Gallego และ Tomaro (2006), ลู ด้วน จาง Korpelainen และ Li (2009), และเร็น ด้วน จาง Korpelainen และ Li (2010) สนับสนุนสมมติฐานนี้ และรายงานความสามารถของ peroxidases scavenge อนุมูลอิสระ และ จึง บรรเทาความเครียด UV เปลี่ยนแปลงเกิดวิธีการฉายรังสี UV ใน polyphenol เผาผลาญขึ้นอยู่กับปริมาณและระยะเวลาของความเครียด นอกจากนี้ เปลี่ยนแปลงเหล่านี้จะยังผลกระทบตามอายุสรีรวิทยาของเนื้อเยื่อนั้น ๆ อิทธิพลต่าง ๆ เหล่านี้นำไปสู่ความแปรผันมากในการตอบสนองของพืช UV Binduced ทั้งหมด การไล่ระดับสีสูงกิจกรรมสรีรวิทยาภายใน stemis ที่รู้จักกันสำหรับหอกหน่อไม้ฝรั่งในต่างระดับของกิจกรรมของเอนไซม์ จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือการ ประเมินผลกระทบของวิธีการฉายรังสี UV-B หลังการเก็บเกี่ยวในกิจกรรมเอนไซม์ของ PAL และ POD และโพรไฟล์ mediated flavonoid ของหอกหน่อไม้ฝรั่งในส่วนต่าง ๆ ของ (ปลายยอด และฐาน) สำหรับวัตถุประสงค์นี้ ราคา fluence รังสีแตกต่างกันและเวลาที่ปรับใช้ ดังนั้น การศึกษานี้เน้นการพึ่งพาอายุลักษณะพิเศษ UV-B ใน physiologically immature และ ในเนื้อเยื่อที่พัฒนาอย่างสมบูรณ์ของแอสพารากัส นอกจากนี้ รักษาเป้าหมายต่ำขนาด UV-B ในหลังอาจใช้เป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์เพื่อสร้างผักที่อุดมไป ด้วยคุณสมบัติการทำงาน healthpromoting2. วัสดุและวิธีการ2.1 การปลูกวัสดุและ UV-B รักษาสดเก็บเกี่ยวหน่อไม้ฝรั่งขาวหอกของ cultivar 'Gijnlim' ได้รับโดยตรงจากการ "Erzeugergruppe Beelitz" (Beelitz เยอรมนี), ได้ระมัดระวังมือล้าง ตัดความยาว 22 ซม. และสุ่มแบ่งออกเป็นชุด (มีการทำซ้ำสาม 250 กรัม) การใช้ ต่ำปานกลาง UV-ความเครียด และ เพื่อประเมินการตอบสนองต่อความเครียดของพืช แปลงขมับ dosages UV-B และระยะเวลาการปรับเวลาที่ถูกเลือกตามการทดลองเบื้องต้นต่าง ๆ ดังนั้น อย่างถูกต้องวิธีการฉายรังสี UV-B (fluence เฉลี่ยอัตรา 8.2 m−2 Ws ที่ระยะทางเฉลี่ย 30 ซม.) ที่ dosages m−2 ใด kJ 0.54 (ต่ำ = L) หรือ m−2 kJ 1.08 กก (กลาง = M) ใช้ UV-B fluorescence แสง (FL-20SE, 305-310 nm GmbH ฟิลิปส์ ฮัมบูร์ก เยอรมัน), ในขณะที่ควบคุมหอกพระราชวงศ์ไม่ถูกรักษาไว้ หลังจากปรับเวลา (เช่นเวลาตอบสนองให้รักษา) h 2 (แสดงปฏิกิริยาอย่างรวดเร็วของพืชหลักสารประกอบ) หรือ h 22 (ช้าปฏิกิริยาของ metabolites รอง), ควบคุมและ UV-B ถือ severed เป็นสองส่วน morphologically ต่าง ๆ เช่นส่วนปลายยอด (11-22 ซม.) และฐาน (0-11 ซม.) spearswere สำหรับการกำหนดของ PAL และฝัก สดวัสดุใช้ และเก็บ at−80 ° C จนถึงการวิเคราะห์ สำหรับการกำหนดโพรไฟล์ผสมฟีนอ ถูกหอกส่วน lyophilised (คริสต์แอลฟา 1-4 คริสต์ Osterode เยอรมนี) และพื้นดินต่อมาแยกและวิเคราะห์2.2. เอนไซม์Phenylalanine แอมโมเนีย-lyase (PAL EC 4.3.1.5) ได้กำหนดตาม สกัดเอนไซม์นี้ดำเนินการ โดยการบดตัวอย่างแช่แข็งใส่ทะเลทรายและโซลูชันบัฟเฟอร์ borate (pH 8.8) ที่ 4 ° C และ หลัง centrifuged ที่ 11000 รอบต่อนาทีที่ 4 ° C สำหรับ 15 นาที สำหรับการกำหนดกิจกรรม PAL, phenylalanine พื้นผิวเอนไซม์ถูกเพิ่มเพื่อสกัดเอนไซม์ และโซลูชันถูก incubated ที่ 37 ° C ใน 30 นาทีหลังจากนั้น สลายตัวของ phenylalanine จะกรด hydroxycinnamic ที่วัด spectrophotometrically (LKB Novaspek II, Pharmacia, Freiburg เยอรมนี) ที่ความยาวคลื่นของ 290 nm สำหรับกิจกรรม PAL 60 นาทีถูกแสดงเป็น pkat mg−1 โปรตีน ทดสอบโปรตีนถูกดำเนินการตาม Peroxidase (ฝัก EC 1.11.1.7) กำหนดกิจกรรมตามใช้ guaiacol เป็นพื้นผิว ตัวอย่างที่สกัด ด้วยการบดตัวอย่างแช่แข็งกับกอซทะเลทรายใน PBS บัฟเฟอร์ (pH 7.2) ที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากเพิ่มพื้นผิวเกี่ยวข้อง โซลูชั่นเอนไซม์ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นทันทีในของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ และได้เปลี่ยนแปลงความหนาแน่นออปติคัลที่วัด spectrophotometrically (LKB Novaspek II, Pharmacia, Freiburg เยอรมนี) 436 nm สำหรับกิจกรรม 1 นาทีเท่านั้นถูกแสดงเป็น nkat mg−1 โปรตีน ทดสอบโปรตีนถูกดำเนินการตาม2.3 การสกัดของ flavonoidsสำหรับการวิเคราะห์ของ flavonoids สกัดปรับเปลี่ยนตามถูกดำเนินโดย acidified เมทานอล (กรดไฮโดรคลอริก 0.1%) Aliquots ของตัวอย่างดิน 0.5 g ถูกผสมกับ 3 mL ของเมทานอล acidified โยคะ และ centrifuged ที่ 3000 รอบต่อนาทีสำหรับ 15 นาที Supernatant รวบรวมไว้ในหนาว volumetric 10 mL สารตกค้างถูกล้างสองครั้ง ด้วยเมธานอ acidified 3 mL และ centrifuged สำหรับรวบรวม และนำปริมาตรสุดท้ายของ 10 mL Supernatants 15 นาทีต่อมา สารสกัดเหล่านี้ถูกใช้สำหรับการกำหนดโพรไฟล์ผสมฟีนอ2.4 การวิเคราะห์ของ flavonoids ใช้ HPLC – พ่อ ความเข้มข้นของ flavonoids ที่เลือก (rutin, kaempferol, quercetin และของอนุพันธ์ดู Fig. 1) ได้กำหนด byHPLC – พ่อ (วิเคราะห์ HPLC, Shimadzu วิทยาศาสตร์เครื่องมือวัด Inc. โคลัมเบีย MD สหรัฐ อเมริกา พร้อมกับการ autosampler ปั๊ม HPLC quaternary และไดโอดอาร์เรย์จับ) Flavonoids แยกจากกันในคอลัมน์โพรดิจี (150 mm × 3.0 มม. ODS 3, 5 μm, 100 A Phenomex จำกัด Aschaffenburg เยอรมนี) ด้วยการไล่ระดับสีสองระยะเคลื่อนตัวทำละลาย (eluent A =กรดน้ำ/อะซิ ติก/acetonitrile [94.5/0.5/5; v/v/v]; eluent B =กรดอะซิติก / acetonitrile [5/95; v/v]) การไล่ระดับสี eluent ที่ใช้สารสกัดทั้งหมดมีอธิบายได้ดังนี้: 0-5 นาที 0% B ต่ำสุด 5-9, 0 – 4% B 9 – 15 นาที 4% B 15 – 30 นาที 4 – 8% B 30 –45 นาที 8 – 22% B 45 – 50 นาที 22 – 28% B 50-55 นาที 28% B นาที 55 – 65, 28 – 45% B. Aliquots (2 mL) ของสารสกัดที่แห้งภายใต้กระแสของไนโตรเจนแล้ว การละลายใน 0.5 mLmethanol สารสกัดจากผลที่บริสุทธิ์ โดยการแยกเฟสของแข็ง (SPE) ใช้ตลับ 6-Chromabond Polyamid (6 mL, 500 มก. Machery แอนด์ Nagel, Düren เยอรมนี) ก่อนปรับอากาศ 2 × 5 mL ของเมทานอล 70% และ 2 × 5 mL ของน้ำ(กราฟ) Fig. 1 หน่อไม้ฝรั่ง chromatogramof HPLC – พ่อที่ awavelength 370 nm (1 = quercetin-3, 4′-O-diglucoside; 2 = rutin; 3 = quercetin-4′-O-monoglucoside; 4 = quercetin; 5 = kaempferol)รบกวน compoundswere elutedwith 2 × 5 mL ของน้ำ ในขณะที่ flavonoids ได้รับ โดย elution กับ 2 × 5 mL ofmethanol/อะ ซิติก กรด/watermixture (90/5/5, v/v/v) ตัวอย่างที่แห้ง โดย evaporator โรตารี่ที่ความดันลดลง และอีกละลายในเมทานอล 0.5 mL (HPLC เกรด) ปริมาตรฉีดสำหรับ HPLC – พ่อ 20 μL และตั้งค่าอัตราการไหลที่ 1 mL min−1 Quercetin และอนุพันธ์ได้กำหนดที่ความยาวคลื่นของ 325 nm และ 370 nm ตามลำดับ สารประกอบมี quantified quercetin, quercetin-4′-O-monoglucoside (QMG), และ quercetin-3, 4′-O-diglucoside (QDG) ความเข้มข้นรวมของ flavonoids (quercetin และอนุพันธ์) ถูกคำนวณจากการเทียบเส้นโค้งที่ได้จากโซลูชันมาตรฐาน 1 มม.แตกออกของสารประกอบนั้น ๆ อ้างอิง ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็น milligrammes ต่อน้ำหนักแห้ง gramme (mg g−1 DW)2.5 การทางสถิติคำนวณข้อมูลถูกประเมินกับ 13.0 โปรแกรม (โปรแกรม Inc., USA) วิธีการรักษาถูกทางสถิติเปรียบเทียบโดยใช้การทดสอบ Tukey (pb0.05) ในตัวเลข ความแปรผันหมายถึงข้อมูลที่ระบุ โดยส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน มีดำเนินการทดลอง ด้วยเหมือนกับสามต่อ UV-B เวลารักษาและปรับ หอกถือว่าไม่ถูกใช้เป็นตัวควบคุม
การแปล กรุณารอสักครู่..
1. Introduction
White asparagus (Asparagus officinalis L.) is a highly valuable vegetable, especially in Germany. From botanical point of view, they are “developmentally immature” and retain their high physiological activity in postharvest. Its popularity is mainly due to its unique flavour and its high content of health promoting secondary plant compounds such as flavonoids and phenolic acids. Due to air pollution-induced stratospheric ozone depletion, total UV-B (280–315 nm) radiation drastically increased in recent years.
Though only a small portion of the total solar spectrum, UV-B provokes a variety of photo-biological. There are many reports on potential consequences of an increased UV-B radiation on plants; however, understanding of its effect on biosynthesis of secondary plant metabolites and the underlying mechanisms is rather limited. At present, ultraviolet irradiation(UV-C 200–280 nm; UV-B 280–315 nm) is applied during postharvest for fruits and vegetables to eliminate food-borne pathogens or to delay postharvest ripening and senescence processes. Recent studies reported elicitor effects of low UV-B radiation,
triggering distinct changes in the secondary plant metabolism.This response particularly results in an accumulation of phenoliccompounds. Based on their chemical structure, phenolic compounds act as scavengers of free radicals such as reactive oxygen species (ROS) being overproduced under oxidative stress. Moreover, they may protect plants against high irradiation, especially in case of UV exposure. In postharvest, synthesis of phenolic compounds may be specifically stimulated by low dosages of UV radiation.This effect was exemplarily reported for flavonols in onion,for anthocyanins in peach , strawberry, and apple , as well as for flavonoids in brassica sprouts and black currant. In the biosynthesis of phenolic compounds, several enzymes play an important role. The phenylpropanoid pathway is initiated by the key enzyme phenylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.5). As an essential enzyme in plant defence, PAL can be activated by various stressors, triggering biosynthesis of phenolic compounds. UV-B triggered PAL synthesis was shown, e. g. in rice Arabidopsis, or Betula pendula leaves. Peroxidases (POD, EC 1.11.1.7) are enzymes that either degrade phenolic compounds or activate phenolic precursors for cross-linking or rigidifying cell walls. Furthermore, they are assumed to have free radical scavenging properties, a feature that is influenced by stress, such as UV irradiation. found that an increased peroxidase activity highly correlatedwith increased tolerance to UV radiation. Yannarelli, Gallego, and Tomaro (2006), Lu, Duan, Zhang, Korpelainen, and Li (2009), and Ren, Duan, Zhang, Korpelainen, and Li (2010) supported this assumption and reported the ability of peroxidases to scavenge free radicals and, thus, alleviate UV stress. UV irradiation-induced changes in polyphenol metabolism depend on dosage and duration of stress. Moreover, these changes are also effected by the physiological age of the respective tissue. All these different influences lead to a great variability in all UV-Binduced plant responses. A high gradient of physiological activities within the stemis also known for asparagus spears resulting in different
level of enzyme activities. The aim of this study was to evaluate the impact of postharvest UV-B irradiation on the enzyme activities of PAL and POD, and the mediated flavonoid profile of asparagus spears in morphological different sections (apical and base). For this purpose, different radiation fluence rates and adaptation times were applied. Hence, this study focuses on the age dependence of UV-B effects in physiologically immature and in fully developed tissue of asparagus spears. Furthermore, targeted low-dosage UV-B treatment in postharvest may serve as a useful tool to generate vegetables enriched with functional healthpromoting properties
2. Materials and methods
2.1. Plant material and UV-B treatments
Freshly harvested white asparagus spears of the cultivar ‘Gijnlim’, directly obtained from the “Erzeugergruppe Beelitz” (Beelitz, Germany), were carefully hand-washed, cut to a length of 22 cm and randomly separated into batches (250 g with three repetitions). To apply low to moderate UV-stress and to evaluate temporal dynamics of plants' stress reactions, UV-B dosages and duration of adaptation times were chosen according to various preliminary experiments. Hence, samples were subjected to UV-B irradiation (average fluence rate of 8.2 Ws m−2 at a mean distance of 30 cm) at dosages of either 0.54 kJ m−2 (Low=L) or 1.08 kJ m−2 (Medium=M) using a UV-B fluorescence light source (FL-20SE, 305–310 nm; Philips GmbH, Hamburg, Germany), while control spears were kept untreated. After adaptation times (i.e. time to react on given treatments) of 2 h (indicating fast reactions of primary plant compounds) or 22 h (slower reactions of secondary metabolites), controls and UV-B treated spearswere severed into two morphologically different sections, i.e. the base (0–11 cm) and the apical (11–22 cm) sections. For the determination of PAL and POD activities fresh material was used and stored at−80 °C until analysis. For the determination of the phenolic compound profile, spear sections were lyophilised (Christ Alpha 1–4, Christ, Osterode, Germany) and ground for subsequent extraction and analysis.
2.2. Enzyme activity
Phenylalanine ammonia-lyase (PAL; EC 4.3.1.5.) was determined according. Extraction of the enzyme was carried out by grinding frozen samples with sterile sea sand and a borate buffer solution (pH 8.8) at 4 °C and, thereafter, centrifuged at 11000 rpm at 4 °C for 15 min. For determination of PAL activity, the enzyme substrate phenylalanine was added to the enzyme extract and the solution was incubated at 37 °C for 30 min. Afterwards, the degradation of phenylalanine to hydroxycinnamic acid was measured spectrophotometrically (LKB-Novaspek II, Pharmacia, Freiburg,Germany) at a wavelength of 290 nm for 60min. PAL activity was expressed as pkat mg−1 protein. Protein assay was conducted according to. Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7) activity was determined according to using guaiacol as substrate. Samples were extracted by grinding frozen samples with sterile sea sand in PBS buffer (pH 7.2) at 4 °C. After adding the respective substrate, enzyme solution reacted immediately in presence of hydrogen peroxide and changes in optical density were measured spectrophotometrically (LKB-Novaspek II, Pharmacia, Freiburg, Germany) at 436 nm for 1 min. POD activity was expressed as nkat mg−1 protein. Protein assay was conducted according to.
2.3. Extraction of flavonoids
For the analysis of flavonoids, a modified extraction according to was conducted by using acidified methanol (0.1% hydrochloric acid). Aliquots of 0.5 g ground sample were vigorously mixed with 3 mL of acidified methanol and centrifuged at 3000 rpm for 15 min. The supernatant was collected in a 10 mL volumetric flask. The residue was washed twice with 3 mL acidified methanol and subsequently centrifuged for 15 min. Supernatants were collected and brought to a final volume of 10 mL. These extracts were used for the determination of the phenolic compound profiles.
2.4. Analysis of the flavonoids using HPLC–DAD
Concentrations of selected flavonoids (rutin, kaempferol, quercetin and its derivatives- see Fig. 1)were determined byHPLC–DAD (analytical HPLC, Shimadzu Scientific Instrument, Inc. Columbia,MD, USA; equipped with an autosampler, quaternary HPLC pump and diode array detector). Flavonoids were separated on a Prodigy column (150 mm×3.0 mm, ODS 3, 5 μm, 100 A; Phenomex Ltd., Aschaffenburg, Germany) with a two solvent mobile phase gradient (eluent A=water/acetic acid/acetonitrile [94.5/0.5/5; v/v/v]; eluent B=acetic acid/ acetonitrile [5/95; v/v]). The eluent gradient used for all extracts was described as follows: 0–5 min, 0% B; 5–9 min, 0–4% B; 9–15 min, 4% B; 15–30 min, 4–8% B; 30–
45 min, 8–22% B; 45–50 min, 22–28% B; 50–55 min, 28% B; 55–65 min, 28–45% B. Aliquots (2 mL) of the extract were dried under a stream of nitrogen and then re-dissolved in 0.5 mLmethanol. The resulting extract was purified by solid-phase extraction (SPE) using Polyamid 6–Chromabond cartridges (6 mL, 500 mg; Machery & Nagel, Düren, Germany) pre-conditioned with 2×5 mL of 70% methanol and 2×5 mL of water.
(กราฟ)
Fig. 1. HPLC–DAD chromatogramof asparagus at awavelength of 370 nm (1=quercetin-3,4′-O-diglucoside; 2=rutin; 3=quercetin-4′-O-monoglucoside; 4=quercetin; 5=kaempferol).
Interfering compoundswere elutedwith 2×5 mL of water,while the flavonoids were obtained by elution with 2×5 mL ofmethanol/acetic acid/ watermixture (90/5/5, v/v/v). Samples were dried by a rotary evaporator at reduced pressure and re-dissolved in 0.5 mL methanol (HPLC grade). The injection volume for HPLC–DAD was 20 μL, and the flow rate sets at 1 mL min−1. Quercetin and its derivatives were determined at wavelengths of 325 nm and 370 nm, respectively. Compounds were quantified as quercetin, quercetin-4′-O-monoglucoside (QMG), and quercetin-3,4′-O-diglucoside (QDG). Total concentration of flavonoids (quercetin and its derivatives) was calculated from a calibration curve obtained from a diluted 1mM standard solution of the respective reference compound. Results were expressed as milligrammes per gramme dry weight (mg g−1 DW).
2.5. Statistical calculations
Data were evaluated with SPSS 13.0 (SPSS Inc., USA). Treatment means were statistically compared using the Tukey test (pb0.05). In figures, mean variability of data was indicated by the standard deviation. The experiment was conducted with three replicates per UV-B treatment and adaptation time. Non-treated spears were used as control.
White asparagus (Asparagus officinalis L.) is a highly valuable vegetable, especially in Germany. From botanical point of view, they are “developmentally immature” and retain their high physiological activity in postharvest. Its popularity is mainly due to its unique flavour and its high content of health promoting secondary plant compounds such as flavonoids and phenolic acids. Due to air pollution-induced stratospheric ozone depletion, total UV-B (280–315 nm) radiation drastically increased in recent years.
Though only a small portion of the total solar spectrum, UV-B provokes a variety of photo-biological. There are many reports on potential consequences of an increased UV-B radiation on plants; however, understanding of its effect on biosynthesis of secondary plant metabolites and the underlying mechanisms is rather limited. At present, ultraviolet irradiation(UV-C 200–280 nm; UV-B 280–315 nm) is applied during postharvest for fruits and vegetables to eliminate food-borne pathogens or to delay postharvest ripening and senescence processes. Recent studies reported elicitor effects of low UV-B radiation,
triggering distinct changes in the secondary plant metabolism.This response particularly results in an accumulation of phenoliccompounds. Based on their chemical structure, phenolic compounds act as scavengers of free radicals such as reactive oxygen species (ROS) being overproduced under oxidative stress. Moreover, they may protect plants against high irradiation, especially in case of UV exposure. In postharvest, synthesis of phenolic compounds may be specifically stimulated by low dosages of UV radiation.This effect was exemplarily reported for flavonols in onion,for anthocyanins in peach , strawberry, and apple , as well as for flavonoids in brassica sprouts and black currant. In the biosynthesis of phenolic compounds, several enzymes play an important role. The phenylpropanoid pathway is initiated by the key enzyme phenylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.5). As an essential enzyme in plant defence, PAL can be activated by various stressors, triggering biosynthesis of phenolic compounds. UV-B triggered PAL synthesis was shown, e. g. in rice Arabidopsis, or Betula pendula leaves. Peroxidases (POD, EC 1.11.1.7) are enzymes that either degrade phenolic compounds or activate phenolic precursors for cross-linking or rigidifying cell walls. Furthermore, they are assumed to have free radical scavenging properties, a feature that is influenced by stress, such as UV irradiation. found that an increased peroxidase activity highly correlatedwith increased tolerance to UV radiation. Yannarelli, Gallego, and Tomaro (2006), Lu, Duan, Zhang, Korpelainen, and Li (2009), and Ren, Duan, Zhang, Korpelainen, and Li (2010) supported this assumption and reported the ability of peroxidases to scavenge free radicals and, thus, alleviate UV stress. UV irradiation-induced changes in polyphenol metabolism depend on dosage and duration of stress. Moreover, these changes are also effected by the physiological age of the respective tissue. All these different influences lead to a great variability in all UV-Binduced plant responses. A high gradient of physiological activities within the stemis also known for asparagus spears resulting in different
level of enzyme activities. The aim of this study was to evaluate the impact of postharvest UV-B irradiation on the enzyme activities of PAL and POD, and the mediated flavonoid profile of asparagus spears in morphological different sections (apical and base). For this purpose, different radiation fluence rates and adaptation times were applied. Hence, this study focuses on the age dependence of UV-B effects in physiologically immature and in fully developed tissue of asparagus spears. Furthermore, targeted low-dosage UV-B treatment in postharvest may serve as a useful tool to generate vegetables enriched with functional healthpromoting properties
2. Materials and methods
2.1. Plant material and UV-B treatments
Freshly harvested white asparagus spears of the cultivar ‘Gijnlim’, directly obtained from the “Erzeugergruppe Beelitz” (Beelitz, Germany), were carefully hand-washed, cut to a length of 22 cm and randomly separated into batches (250 g with three repetitions). To apply low to moderate UV-stress and to evaluate temporal dynamics of plants' stress reactions, UV-B dosages and duration of adaptation times were chosen according to various preliminary experiments. Hence, samples were subjected to UV-B irradiation (average fluence rate of 8.2 Ws m−2 at a mean distance of 30 cm) at dosages of either 0.54 kJ m−2 (Low=L) or 1.08 kJ m−2 (Medium=M) using a UV-B fluorescence light source (FL-20SE, 305–310 nm; Philips GmbH, Hamburg, Germany), while control spears were kept untreated. After adaptation times (i.e. time to react on given treatments) of 2 h (indicating fast reactions of primary plant compounds) or 22 h (slower reactions of secondary metabolites), controls and UV-B treated spearswere severed into two morphologically different sections, i.e. the base (0–11 cm) and the apical (11–22 cm) sections. For the determination of PAL and POD activities fresh material was used and stored at−80 °C until analysis. For the determination of the phenolic compound profile, spear sections were lyophilised (Christ Alpha 1–4, Christ, Osterode, Germany) and ground for subsequent extraction and analysis.
2.2. Enzyme activity
Phenylalanine ammonia-lyase (PAL; EC 4.3.1.5.) was determined according. Extraction of the enzyme was carried out by grinding frozen samples with sterile sea sand and a borate buffer solution (pH 8.8) at 4 °C and, thereafter, centrifuged at 11000 rpm at 4 °C for 15 min. For determination of PAL activity, the enzyme substrate phenylalanine was added to the enzyme extract and the solution was incubated at 37 °C for 30 min. Afterwards, the degradation of phenylalanine to hydroxycinnamic acid was measured spectrophotometrically (LKB-Novaspek II, Pharmacia, Freiburg,Germany) at a wavelength of 290 nm for 60min. PAL activity was expressed as pkat mg−1 protein. Protein assay was conducted according to. Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7) activity was determined according to using guaiacol as substrate. Samples were extracted by grinding frozen samples with sterile sea sand in PBS buffer (pH 7.2) at 4 °C. After adding the respective substrate, enzyme solution reacted immediately in presence of hydrogen peroxide and changes in optical density were measured spectrophotometrically (LKB-Novaspek II, Pharmacia, Freiburg, Germany) at 436 nm for 1 min. POD activity was expressed as nkat mg−1 protein. Protein assay was conducted according to.
2.3. Extraction of flavonoids
For the analysis of flavonoids, a modified extraction according to was conducted by using acidified methanol (0.1% hydrochloric acid). Aliquots of 0.5 g ground sample were vigorously mixed with 3 mL of acidified methanol and centrifuged at 3000 rpm for 15 min. The supernatant was collected in a 10 mL volumetric flask. The residue was washed twice with 3 mL acidified methanol and subsequently centrifuged for 15 min. Supernatants were collected and brought to a final volume of 10 mL. These extracts were used for the determination of the phenolic compound profiles.
2.4. Analysis of the flavonoids using HPLC–DAD
Concentrations of selected flavonoids (rutin, kaempferol, quercetin and its derivatives- see Fig. 1)were determined byHPLC–DAD (analytical HPLC, Shimadzu Scientific Instrument, Inc. Columbia,MD, USA; equipped with an autosampler, quaternary HPLC pump and diode array detector). Flavonoids were separated on a Prodigy column (150 mm×3.0 mm, ODS 3, 5 μm, 100 A; Phenomex Ltd., Aschaffenburg, Germany) with a two solvent mobile phase gradient (eluent A=water/acetic acid/acetonitrile [94.5/0.5/5; v/v/v]; eluent B=acetic acid/ acetonitrile [5/95; v/v]). The eluent gradient used for all extracts was described as follows: 0–5 min, 0% B; 5–9 min, 0–4% B; 9–15 min, 4% B; 15–30 min, 4–8% B; 30–
45 min, 8–22% B; 45–50 min, 22–28% B; 50–55 min, 28% B; 55–65 min, 28–45% B. Aliquots (2 mL) of the extract were dried under a stream of nitrogen and then re-dissolved in 0.5 mLmethanol. The resulting extract was purified by solid-phase extraction (SPE) using Polyamid 6–Chromabond cartridges (6 mL, 500 mg; Machery & Nagel, Düren, Germany) pre-conditioned with 2×5 mL of 70% methanol and 2×5 mL of water.
(กราฟ)
Fig. 1. HPLC–DAD chromatogramof asparagus at awavelength of 370 nm (1=quercetin-3,4′-O-diglucoside; 2=rutin; 3=quercetin-4′-O-monoglucoside; 4=quercetin; 5=kaempferol).
Interfering compoundswere elutedwith 2×5 mL of water,while the flavonoids were obtained by elution with 2×5 mL ofmethanol/acetic acid/ watermixture (90/5/5, v/v/v). Samples were dried by a rotary evaporator at reduced pressure and re-dissolved in 0.5 mL methanol (HPLC grade). The injection volume for HPLC–DAD was 20 μL, and the flow rate sets at 1 mL min−1. Quercetin and its derivatives were determined at wavelengths of 325 nm and 370 nm, respectively. Compounds were quantified as quercetin, quercetin-4′-O-monoglucoside (QMG), and quercetin-3,4′-O-diglucoside (QDG). Total concentration of flavonoids (quercetin and its derivatives) was calculated from a calibration curve obtained from a diluted 1mM standard solution of the respective reference compound. Results were expressed as milligrammes per gramme dry weight (mg g−1 DW).
2.5. Statistical calculations
Data were evaluated with SPSS 13.0 (SPSS Inc., USA). Treatment means were statistically compared using the Tukey test (pb0.05). In figures, mean variability of data was indicated by the standard deviation. The experiment was conducted with three replicates per UV-B treatment and adaptation time. Non-treated spears were used as control.
การแปล กรุณารอสักครู่..
1 . บทนำ
สีขาวแอสพารากัส ( หน่อไม้ฝรั่ง officinalis L . ) เป็นพืชที่มีคุณค่าสูง โดยเฉพาะในเยอรมัน จากจุดทางพฤกษศาสตร์ของมุมมองที่พวกเขาจะ " พัฒนาการเด็ก " และรักษากิจกรรมทางสรีรวิทยาหลังการเก็บเกี่ยวของพวกเขาสูงใน . ความนิยมของมันคือเนื่องจากส่วนใหญ่ของรสชาติที่ไม่ซ้ำกันและเนื้อหาสูงของการส่งเสริมสุขภาพ เช่น สารฟลาโวนอยด์ และสารทุติยภูมิของพืชสารฟีโนลิก กรดเนื่องจากมลพิษทางอากาศ เกิดปรากฏการณ์โอโซนรังสียูวี บี ( 280 - 315 nm ) รังสีเพิ่มขึ้นอย่างมากในปีที่ผ่านมา
แม้เพียงส่วนเล็ก ๆของสเปกตรัมพลังงานแสงอาทิตย์รวม รังสียูวี บีกระตุ้นความหลากหลายของภาพทางชีวภาพ มีรายงานหลายศักยภาพผลของรังสียูวี - ขในพืชเพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตามความเข้าใจในผลกระทบต่อการสังเคราะห์สารรองพืชและกลไกที่ค่อนข้างจำกัด ปัจจุบัน การฉายรังสีอัลตร้าไวโอเลต ( รังสียูวี ซี 200 – 280 nm ; รังสียูวี บี 280 – 315 nm ) ที่ใช้ในช่วงหลังการเก็บเกี่ยวสำหรับผลไม้และผักเพื่อกำจัดจุลินทรีย์ก่อโรคในอาหารหรือเพื่อชะลอการสุกและการเสื่อมสภาพหลังกระบวนการการศึกษาล่าสุดที่รายงาน elicitor ผลของรังสียูวี - ขน้อย
เรียกการเปลี่ยนแปลงที่แตกต่างกันในการตอบสนองโดยเฉพาะอย่างยิ่งพืชเมแทบอลิซึม นี้ผลในการสะสมของ phenoliccompounds . จากโครงสร้างทางเคมีของสารประกอบฟีนอลเป็นคนเก็บขยะของอนุมูลอิสระ เช่นปฏิกิริยาชนิดออกซิเจน ( ROS ) ถูกผลิตมากเกินไปภายใต้ความเครียดออกซิเดชัน นอกจากนี้พวกเขาอาจจะป้องกันพืชจากการฉายรังสีสูง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีของแสงยูวี ในการเก็บเกี่ยว การสังเคราะห์สารประกอบฟีนอลอาจจะกระตุ้นโดยเฉพาะขนาดต่ำของรังสียูวี ผลกระทบนี้จะถูก exemplarily รายงานฟลาโวนอลในหัวหอม สำหรับแอนโธไซยานินในพีช , สตรอเบอร์รี่ , แอปเปิ้ล , รวมทั้งสารฟลาโวนอยด์ในพืชตระกูลกะหล่ำ ถั่วงอก และลูกเกดดำในการสังเคราะห์สารประกอบฟีนอลหลายเอนไซม์มีบทบาทสำคัญ เส้นทาง phenylpropanoid ริเริ่มโดยคีย์เอนไซม์ phenylalanine ammonia lyase ( PAL , EC 4.3.1.5 ) เป็นเอนไซม์ที่จำเป็นในการป้องกันพืช เพื่อนสามารถใช้งานโดยบุคคลต่างๆ ทำให้เกิดการสังเคราะห์สารประกอบฟีนอล . ยูวี - ขกระตุ้นการสังเคราะห์ PAL แสดงเช่นใน Arabidopsis ข้าว ,หรือ betula เพนดูลาใบ เพอร์ กซิเดส ( ฝัก , EC 1.11.1.7 ) เป็นเอนไซม์ที่ย่อยสลายสารประกอบฟีนอลหรือใช้งานฟีโนลิก สารตั้งต้นสำหรับการเชื่อมโยงหรือ rigidifying ผนังเซลล์ นอกจากนี้ยังสันนิษฐานว่ามีคุณสมบัติขจัดอนุมูลอิสระ , คุณลักษณะที่เป็นผลมาจากความเครียด เช่น การฉายรังสี UVพบว่าเอนไซม์มีกิจกรรมเพิ่มขึ้นอย่างมากเพิ่มขึ้น ทนทานต่อรังสี UV yannarelli Gallego , และ tomaro ( 2006 ) , Lu , ด้วน , จาง , korpelainen และ Li ( 2009 ) , เรน , ด้วน , จาง , korpelainen และ Li ( 2010 ) ได้รับการสนับสนุนสมมติฐานนี้และรายงานความสามารถของเพอร์ กซิเดสเพื่อหาอนุมูลอิสระและทำให้บรรเทาความเครียด UVการฉายรังสี UV กระตุ้นการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญปริมาณขึ้นอยู่กับปริมาณและระยะเวลาของความเครียด นอกจากนี้ การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้จะมีผลต่ออายุของร่างกาย เนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้อง อิทธิพลต่าง ๆ ทั้งหมดเหล่านี้นำไปสู่ความแปรปรวนมากในทั้งหมด binduced UV ตอบสนองของพืชสูงไล่ระดับของกิจกรรมทางสรีรวิทยาภายใน stemis รู้จักแอสพารากัส Spears เป็นผลในระดับที่แตกต่างกัน
ของกิจกรรมเอนไซม์ จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือ เพื่อศึกษาผลกระทบของรังสียูวี - ขหลังการเก็บเกี่ยวในกิจกรรมของเอนไซม์ PAL และฝัก และฟลาโวนอยด์ ( โปรไฟล์ของหน่อไม้ฝรั่งในลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่แตกต่างกัน ส่วนหอก ( ยอดและฐาน ) สำหรับวัตถุประสงค์นี้อัตรา fluence รังสีที่แตกต่างกันและปรับเวลาที่ใช้ ดังนั้น การศึกษานี้เน้นการพึ่งพา อายุของผลรังสียูวี บีเรายังไม่พัฒนาอย่างเต็มที่ในเนื้อเยื่อของหน่อไม้ฝรั่ง สเปียร์ นอกจากนี้ เป้าหมายต่ำปริมาณรังสียูวี บีในการรักษาหลังการเก็บเกี่ยวอาจเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์ในการสร้างผักอุดมไปด้วยคุณสมบัติส่งเสริมการทำงาน
2วัสดุและวิธีการ
2.1 . วัสดุโรงงานและรังสียูวี บีการรักษา
เก็บเกี่ยวสดสีขาวแอสพารากัส Spears ของพันธุ์ ' gijnlim ' โดยตรงได้จาก " erzeugergruppe Beelitz " ( Beelitz , เยอรมนี ) , อย่างมือล้าง ตัดให้มีความยาว 22 เซนติเมตร และสุ่มแบ่งออกเป็นชุด ( 250 กรัมกับสาม repetitions )ใช้น้อยความเครียด UV ปานกลางและประเมินความเครียดของพืชและพลศาสตร์ของปฏิกิริยารังสียูวี บีขนาดและระยะเวลาของการปรับตัวครั้งได้รับเลือกตามการทดลองเบื้องต้นต่างๆ ดังนั้น จำนวนภายใต้การฉายรังสียูวี บี ( อัตรา fluence เฉลี่ย 8.2 WS m − 2 ที่หมายถึงระยะ 30 ซม. ) ที่ขนาดของทั้ง 0.54 KJ m − 2 ( ต่ำ = L ) หรือ 108 KJ m − 2 ( กลาง = M ) โดยใช้รังสียูวี บีเรืองแสง ( fl-20se , 305 – 310 nm ; ฟิลิปส์ GmbH , ฮัมบูร์ก , เยอรมนี ) , ในขณะที่หอกควบคุมไว้ดีกว่า หลังจากการปรับตัวครั้ง ( เช่นเวลาตอบสนองเมื่อได้รับการรักษา ) 2 h ( แสดงการตอบสนองอย่างรวดเร็วของสารประกอบพืชหลัก ) หรือ 22 ชั่วโมง ( ปฏิกิริยาช้าของสารประกอบทุติยภูมิ )การควบคุมและรักษารังสียูวี บี spearswere ขาดออกเป็นสองส่วนที่แตกต่างกัน จาก คือ ฐาน ( 0 - 11 ซม. ) และปลาย ( 11 – 22 ซม. ) ส่วน สำหรับการหาเพื่อนและฝักสด กิจกรรม วัสดุ และใช้อุณหภูมิ− 80 ° C จนถึงการวิเคราะห์ การหาปริมาณสารประกอบฟีนอลิกโปรไฟล์ ส่วนหอกมี lyophilised ( คริสต์ อัลฟ่า 1 – 4 , คริสต์ , Osterode ,
สีขาวแอสพารากัส ( หน่อไม้ฝรั่ง officinalis L . ) เป็นพืชที่มีคุณค่าสูง โดยเฉพาะในเยอรมัน จากจุดทางพฤกษศาสตร์ของมุมมองที่พวกเขาจะ " พัฒนาการเด็ก " และรักษากิจกรรมทางสรีรวิทยาหลังการเก็บเกี่ยวของพวกเขาสูงใน . ความนิยมของมันคือเนื่องจากส่วนใหญ่ของรสชาติที่ไม่ซ้ำกันและเนื้อหาสูงของการส่งเสริมสุขภาพ เช่น สารฟลาโวนอยด์ และสารทุติยภูมิของพืชสารฟีโนลิก กรดเนื่องจากมลพิษทางอากาศ เกิดปรากฏการณ์โอโซนรังสียูวี บี ( 280 - 315 nm ) รังสีเพิ่มขึ้นอย่างมากในปีที่ผ่านมา
แม้เพียงส่วนเล็ก ๆของสเปกตรัมพลังงานแสงอาทิตย์รวม รังสียูวี บีกระตุ้นความหลากหลายของภาพทางชีวภาพ มีรายงานหลายศักยภาพผลของรังสียูวี - ขในพืชเพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตามความเข้าใจในผลกระทบต่อการสังเคราะห์สารรองพืชและกลไกที่ค่อนข้างจำกัด ปัจจุบัน การฉายรังสีอัลตร้าไวโอเลต ( รังสียูวี ซี 200 – 280 nm ; รังสียูวี บี 280 – 315 nm ) ที่ใช้ในช่วงหลังการเก็บเกี่ยวสำหรับผลไม้และผักเพื่อกำจัดจุลินทรีย์ก่อโรคในอาหารหรือเพื่อชะลอการสุกและการเสื่อมสภาพหลังกระบวนการการศึกษาล่าสุดที่รายงาน elicitor ผลของรังสียูวี - ขน้อย
เรียกการเปลี่ยนแปลงที่แตกต่างกันในการตอบสนองโดยเฉพาะอย่างยิ่งพืชเมแทบอลิซึม นี้ผลในการสะสมของ phenoliccompounds . จากโครงสร้างทางเคมีของสารประกอบฟีนอลเป็นคนเก็บขยะของอนุมูลอิสระ เช่นปฏิกิริยาชนิดออกซิเจน ( ROS ) ถูกผลิตมากเกินไปภายใต้ความเครียดออกซิเดชัน นอกจากนี้พวกเขาอาจจะป้องกันพืชจากการฉายรังสีสูง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีของแสงยูวี ในการเก็บเกี่ยว การสังเคราะห์สารประกอบฟีนอลอาจจะกระตุ้นโดยเฉพาะขนาดต่ำของรังสียูวี ผลกระทบนี้จะถูก exemplarily รายงานฟลาโวนอลในหัวหอม สำหรับแอนโธไซยานินในพีช , สตรอเบอร์รี่ , แอปเปิ้ล , รวมทั้งสารฟลาโวนอยด์ในพืชตระกูลกะหล่ำ ถั่วงอก และลูกเกดดำในการสังเคราะห์สารประกอบฟีนอลหลายเอนไซม์มีบทบาทสำคัญ เส้นทาง phenylpropanoid ริเริ่มโดยคีย์เอนไซม์ phenylalanine ammonia lyase ( PAL , EC 4.3.1.5 ) เป็นเอนไซม์ที่จำเป็นในการป้องกันพืช เพื่อนสามารถใช้งานโดยบุคคลต่างๆ ทำให้เกิดการสังเคราะห์สารประกอบฟีนอล . ยูวี - ขกระตุ้นการสังเคราะห์ PAL แสดงเช่นใน Arabidopsis ข้าว ,หรือ betula เพนดูลาใบ เพอร์ กซิเดส ( ฝัก , EC 1.11.1.7 ) เป็นเอนไซม์ที่ย่อยสลายสารประกอบฟีนอลหรือใช้งานฟีโนลิก สารตั้งต้นสำหรับการเชื่อมโยงหรือ rigidifying ผนังเซลล์ นอกจากนี้ยังสันนิษฐานว่ามีคุณสมบัติขจัดอนุมูลอิสระ , คุณลักษณะที่เป็นผลมาจากความเครียด เช่น การฉายรังสี UVพบว่าเอนไซม์มีกิจกรรมเพิ่มขึ้นอย่างมากเพิ่มขึ้น ทนทานต่อรังสี UV yannarelli Gallego , และ tomaro ( 2006 ) , Lu , ด้วน , จาง , korpelainen และ Li ( 2009 ) , เรน , ด้วน , จาง , korpelainen และ Li ( 2010 ) ได้รับการสนับสนุนสมมติฐานนี้และรายงานความสามารถของเพอร์ กซิเดสเพื่อหาอนุมูลอิสระและทำให้บรรเทาความเครียด UVการฉายรังสี UV กระตุ้นการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญปริมาณขึ้นอยู่กับปริมาณและระยะเวลาของความเครียด นอกจากนี้ การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้จะมีผลต่ออายุของร่างกาย เนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้อง อิทธิพลต่าง ๆ ทั้งหมดเหล่านี้นำไปสู่ความแปรปรวนมากในทั้งหมด binduced UV ตอบสนองของพืชสูงไล่ระดับของกิจกรรมทางสรีรวิทยาภายใน stemis รู้จักแอสพารากัส Spears เป็นผลในระดับที่แตกต่างกัน
ของกิจกรรมเอนไซม์ จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือ เพื่อศึกษาผลกระทบของรังสียูวี - ขหลังการเก็บเกี่ยวในกิจกรรมของเอนไซม์ PAL และฝัก และฟลาโวนอยด์ ( โปรไฟล์ของหน่อไม้ฝรั่งในลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่แตกต่างกัน ส่วนหอก ( ยอดและฐาน ) สำหรับวัตถุประสงค์นี้อัตรา fluence รังสีที่แตกต่างกันและปรับเวลาที่ใช้ ดังนั้น การศึกษานี้เน้นการพึ่งพา อายุของผลรังสียูวี บีเรายังไม่พัฒนาอย่างเต็มที่ในเนื้อเยื่อของหน่อไม้ฝรั่ง สเปียร์ นอกจากนี้ เป้าหมายต่ำปริมาณรังสียูวี บีในการรักษาหลังการเก็บเกี่ยวอาจเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์ในการสร้างผักอุดมไปด้วยคุณสมบัติส่งเสริมการทำงาน
2วัสดุและวิธีการ
2.1 . วัสดุโรงงานและรังสียูวี บีการรักษา
เก็บเกี่ยวสดสีขาวแอสพารากัส Spears ของพันธุ์ ' gijnlim ' โดยตรงได้จาก " erzeugergruppe Beelitz " ( Beelitz , เยอรมนี ) , อย่างมือล้าง ตัดให้มีความยาว 22 เซนติเมตร และสุ่มแบ่งออกเป็นชุด ( 250 กรัมกับสาม repetitions )ใช้น้อยความเครียด UV ปานกลางและประเมินความเครียดของพืชและพลศาสตร์ของปฏิกิริยารังสียูวี บีขนาดและระยะเวลาของการปรับตัวครั้งได้รับเลือกตามการทดลองเบื้องต้นต่างๆ ดังนั้น จำนวนภายใต้การฉายรังสียูวี บี ( อัตรา fluence เฉลี่ย 8.2 WS m − 2 ที่หมายถึงระยะ 30 ซม. ) ที่ขนาดของทั้ง 0.54 KJ m − 2 ( ต่ำ = L ) หรือ 108 KJ m − 2 ( กลาง = M ) โดยใช้รังสียูวี บีเรืองแสง ( fl-20se , 305 – 310 nm ; ฟิลิปส์ GmbH , ฮัมบูร์ก , เยอรมนี ) , ในขณะที่หอกควบคุมไว้ดีกว่า หลังจากการปรับตัวครั้ง ( เช่นเวลาตอบสนองเมื่อได้รับการรักษา ) 2 h ( แสดงการตอบสนองอย่างรวดเร็วของสารประกอบพืชหลัก ) หรือ 22 ชั่วโมง ( ปฏิกิริยาช้าของสารประกอบทุติยภูมิ )การควบคุมและรักษารังสียูวี บี spearswere ขาดออกเป็นสองส่วนที่แตกต่างกัน จาก คือ ฐาน ( 0 - 11 ซม. ) และปลาย ( 11 – 22 ซม. ) ส่วน สำหรับการหาเพื่อนและฝักสด กิจกรรม วัสดุ และใช้อุณหภูมิ− 80 ° C จนถึงการวิเคราะห์ การหาปริมาณสารประกอบฟีนอลิกโปรไฟล์ ส่วนหอกมี lyophilised ( คริสต์ อัลฟ่า 1 – 4 , คริสต์ , Osterode ,
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- น้ำซุป
- ล่าสุดฉันได้พูดคุยกับนักท่องเที่ยวต่างชา
- อย่าลืมอ่านดุอาทุกครั้งก่อนนอน
- PVS can be considered byassuming that a
- คำทักทาย
- Terrible terrible beauty, and beauty loo
- ขอโทษที่ตอบคุณช้า ยินดีที่ได้รู้จักคุณ ฉ
- คุณเก่งมาก
- How do I write a letter to a friend?Hell
- อาหารไทยก็มีหลายอย่างที่ขึ้นชื่อและอร่อย
- 2.2.1 FunctionsWarehouses are designed t
- public relations jobs
- วุ่นวาย เร่งรีบ สุดท้ายก็ได้ลงแค่2-3วิชา
- วันนั้นฉันได้ไปที่มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์ป
- ผลมีรสเปรี้ยวอมหวาน สรรพคุณช่วยแก้โรคขาด
- สถานที่ท่องเที่ยวที่น่าสนใจ
- Academics in both areas are grappling,
- และมีลูกสามคน
- taken up
- ที่มีกระบวนการในการเล่นตามชนิดของเกมแต่ล
- Dangerous pizza
- His wife knowing that he is depressed. S
- I rest my
- ขึ้นรถหน้าห้างสรรพสินค้า
