The SrtA isoform of the Staphylococ

The SrtA isoform of the Staphylococcus aureus sortase transpeptidase is responsible for the covalent attachment of virulence- and colonization-associated proteins to the bacterial peptidoglycan. Sortase utilizes two substrates, undecaprenol-pyrophosphoryl-
MurNAc(GlcNAc)-Ala-D-isoGlu-Lys(e-Gly5)-D-Ala-D-Ala (branched Lipid II) and secreted proteins containing a highly conserved LPXTG sequence near their C termini. SrtA simultaneously cleaves the Thr-Gly bond of the LPXTG-containing protein and forms
a new amide bond with the nucleophilic amino group of the Gly5 portion of branched Lipid II, anchoring the protein to this key intermediate that is subsequently polymerized into peptidoglycan. Here we show that reported fluorescence quenching activity assays for SrtA are subject to marked fluorescence inner filter effect quenching, resulting in prematurely hyperbolic velocity versus substrate profiles and underestimates of the true kinetic parameters kcat and Km. We therefore devised a discontinuous high-performance
liquid chromatography (HPLC)-based assay to monitor the SrtA reaction employing the same substrates used in the fluorescence quenching assay: Gly5 and Abz-LPETG-Dap(Dnp)-NH2. Fluorescence or UV detection using these substrates facilitates separate analysis of both the acylation and the transpeptidation steps of the reaction. Because HPLC was performed using fast-flow analytical columns (

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Isoform SrtA ของ Staphylococcus หมอเทศข้างลาย sortase ลทรานสเฟอเรสรับผิดชอบสำหรับการแนบ covalent ของโปรตีนสัมพันธ์ virulence และสนามเปบทิโดไกลแคนแบคทีเรีย Sortase ใช้ได้ 2, undecaprenol - pyrophosphoryl-
MurNAc (GlcNAc) -อลา - D-isoGlu-Lys (e-Gly5) - D -อลา - D -อลา (แบบแยกสาขาไขมัน II) และวิลเลียม secreted ประกอบด้วย LPXTG สูงนำลำดับใกล้เทอร์มินิของ C SrtA พร้อมแยกออกพันธบัตร Thr Gly ของโปรตีนที่ประกอบด้วย LPXTG และฟอร์ม
amide พันธบัตรใหม่ที่ มีกลุ่มอะมิโน nucleophilic ของส่วน Gly5 ของแบบแยกสาขาไขมัน II anchoring โปรตีนถึงคีย์นี้กลางที่ต่อ polymerized เป็นเปบทิโดไกลแคน ที่นี่เราแสดงว่า fluorescence รายงานปราบกิจกรรม assays สำหรับ SrtA อาจมี fluorescence เครื่องกรองภายในผลการชุบ ในไฮเพอร์โบลิก่อนกำหนดความเร็วเมื่อเทียบกับพื้นผิวโพรไฟล์และ underestimates ของ kcat พารามิเตอร์จริงเดิม ๆ และ Km เราจึงกำหนดความไม่ต่อเนื่องประสิทธิภาพสูง
เหลว chromatography (HPLC) -ใช้วิเคราะห์เพื่อตรวจสอบการใช้พื้นผิวเดียวกันที่ใช้ใน fluorescence ชุบทดสอบปฏิกิริยา SrtA: Gly5 และ Abz-LPETG-หลักสูตร Dap (Dnp) -NH2 Fluorescence หรือ UV ตรวจโดยใช้พื้นผิวเหล่านี้อำนวยความสะดวกทั้งอย่างไร acylation แยกวิเคราะห์และ transpeptidation ขั้นตอนของปฏิกิริยา เนื่องจากทำ HPLC ใช้คอลัมน์วิเคราะห์กระแสอย่างรวดเร็ว (< รัน 8 นาที), นี้วิเคราะห์สำหรับการวิเคราะห์ของ SrtA พื้นผิว specificity กลไกการเคลื่อนไหว และยับยั้งการใช้อัตราความเร็วสูงก็เป็นไปได้ เปิดเผยวิเคราะห์เดิม ๆ ที่ใช้วิเคราะห์ HPLC ที่พารามิเตอร์เดิม ๆ สำหรับ SrtA กับ Abz-LPETG-หลักสูตร Dap (Dnp) -NH2 จะมม. 5.5 กิโลเมตรและ 0.27 s 1 สำหรับ kcat กำหนดให้ 140 Km สำหรับ Gly5 lM ค่าเหล่านี้แทนการเพิ่ม 300-fold Km สำหรับพื้นผิว LPXTG และเพิ่ม 12,000-fold ใน kcat มากกว่าเอกสารประกอบการรายงานค่า แนะนำ SrtA เพิ่มเติมเอนไซม์แข็งแกร่งกว่าวิเคราะห์ก่อนหน้านี้ที่ระบุ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไอโซฟอร์ม SrtA ของ Staphylococcus aureus sortase transpeptidase เป็นผู้รับผิดชอบต่อสิ่งที่แนบมาโควาเลนต์ของโปรตีน virulence- และการล่าอาณานิคมที่เกี่ยวข้องกับ peptidoglycan แบคทีเรีย Sortase ใช้สองพื้นผิว undecaprenol-pyrophosphoryl-
MurNAc (GlcNAc) -Ala-D-isoGlu-ลิซ (E-Gly5) -D-Ala-D-Ala (แยกไขมัน II) และโปรตีนที่หลั่งที่มีลำดับ LPXTG ป่าสงวนใกล้กับพวกเขา C ปลายทาง SrtA พร้อมกันแข็งกระด้างพันธบัตร Thr-Gly ของโปรตีน LPXTG ที่มีรูปแบบและ
พันธะเอไมด์ใหม่กับกลุ่มอะมิโน nucleophilic ของส่วนของ Gly5 แยกไขมันที่สองทอดสมอโปรตีนนี้สำคัญกลางที่ polymerized ก็เป็น peptidoglycan ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่ารายงานการวิเคราะห์กิจกรรมการเรืองแสงดับสำหรับ SrtA อาจมีการเรืองแสงที่ทำเครื่องหมายผลกรองภายในดับส่งผลให้ความเร็วการผ่อนชำระก่อนเวลาอันควรเมื่อเทียบกับรูปแบบพื้นผิวและดูถูกของ kcat พารามิเตอร์ที่แท้จริงเกี่ยวกับการเคลื่อนไหวและกม ดังนั้นเราจึงวางแผนที่มีประสิทธิภาพสูงต่อเนื่อง
ของเหลว chromatography (HPLC) ในการตรวจชั่นการตรวจสอบปฏิกิริยา SrtA ใช้วัสดุเดียวกับที่ใช้ในการเรืองแสงดับทดสอบ: Gly5 และ Abz-LPETG-เบา (Dnp) -NH2 การเรืองแสงรังสียูวีหรือการตรวจสอบโดยใช้พื้นผิวเหล่านี้อำนวยความสะดวกในการวิเคราะห์แยกของทั้งสอง acylation และขั้นตอนการ transpeptidation ของการเกิดปฏิกิริยา เพราะ HPLC ได้รับการดำเนินการโดยใช้คอลัมน์วิเคราะห์อย่างรวดเร็วไหล (<8 นาที / วิ่ง), การใช้งานที่ความเร็วสูงของการทดสอบนี้สำหรับการวิเคราะห์ SrtA จำเพาะตั้งต้นกลไกการเคลื่อนไหวและการยับยั้งตอนนี้เป็นไปได้ การวิเคราะห์การเคลื่อนไหวโดยใช้วิธี HPLC พบว่าพารามิเตอร์สำหรับ SrtA กับ Abz-LPETG-เบา (Dnp) -NH2 เป็น 5.5mm สำหรับค่า Km และ 0.27 หรือไม่ 1 สำหรับ kcat ที่กมสำหรับ Gly5 มุ่งมั่นจะเป็น 140 LM ค่าเหล่านี้เป็นตัวแทนของการเพิ่มขึ้น 300 เท่าในกมสำหรับพื้นผิว LPXTG และเพิ่มขึ้น 12,000 เท่าใน kcat กว่าค่าวรรณกรรมรายงานบอกว่า SrtA เป็นเอนไซม์ที่แข็งแกร่งกว่าการวิเคราะห์ก่อนหน้านี้ที่ระบุ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การ srta ไอโซฟอร์มของ Staphylococcus aureus sortase transpeptidase รับผิดชอบสิ่งที่แนบการของโรค - และการล่าอาณานิคมที่เกี่ยวข้องโปรตีนให้กับเปปติโดไกลแคน แบคทีเรีย sortase ใช้สองพื้นผิว undecaprenol pyrophosphoryl -
murnac ชีวิต - ala-d-isoglu-lys ( e-gly5 ) - d-ala-d-ala ( ย่อยไขมัน II ) และหลั่งโปรตีนที่มีลำดับของ C ที่มีการอนุรักษ์ lpxtg ใกล้แทร์มินี่ . srta พร้อมกันคลีฟส์ช่วง GLY พันธบัตรของ lpxtg ที่มีรูปแบบโปรตีนและ
พันธบัตรและใหม่ด้วยกลุ่มอะมิโน nucleophilic ของส่วนของกิ่ง gly5 ไขมัน 2รักษาระดับโปรตีนให้กลางคีย์นี้ที่ต่อมา polymerized เป็นเปปติโดไกลแคน . ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่ามีการใช้กิจกรรมเพื่อดับ srta อาจมีเครื่องหมายเรืองแสงภายในกรองผลดับผลก่อนกำหนดค่าความเร็วเทียบกับโปรไฟล์ ( underestimates ของจริงค่าพารามิเตอร์จลน์ kcat และกม.เราจึงวางแผนไม่ต่อเนื่องที่มีประสิทธิภาพสูงของเหลว chromatography ( HPLC )
- based assay เพื่อตรวจสอบ srta ปฏิกิริยาโดยใช้พื้นผิวที่ใช้ในการชุบแบบทดสอบ : gly5 abz และ lpetg DAP ( DNP ) - nh2 . การใช้พื้นผิวหรือตรวจจับยูวีเหล่านี้ในการวิเคราะห์แยกของโพลิสไตรีน และ transpeptidation ขั้นตอนของปฏิกิริยาเพราะมีการใช้กระแสได้อย่างรวดเร็ววิเคราะห์ HPLC คอลัมน์ ( < 8 นาที / วิ่ง ) ใช้วิธีนี้ช่วยในการวิเคราะห์พื้นผิว srta ต่อการยับยั้งกลไกจลนพลศาสตร์และขณะนี้เป็นไปได้ การวิเคราะห์จลนศาสตร์โดยใช้ HPLC assay พบว่าค่าพารามิเตอร์จลน์สำหรับ srta กับ abz lpetg DAP ( DNP ) - nh2 เป็น 5.5mm สำหรับ km และ 0.27 วินาที
1 สำหรับ kcat .กิโลเมตรสำหรับ gly5 ตัดสินใจว่า 140 LM . ค่าเหล่านี้เป็นตัวแทนของ 300 พับเพิ่ม km สำหรับ lpxtg ( 12000 พับเพิ่ม kcat ผ่านวรรณกรรมรายงานค่า แนะนำว่า srta เป็นเอนไซม์ที่แข็งแกร่งกว่าเดิม
วิเคราะห์ระบุ