2.6. Epifluorescence and phase-cont

2.6. Epifluorescence and phase-contrast microscopy
The effect of various pressures on the membrane potential and
membrane integrity of L. monocytogenes LGB was investigated on
samples specifically prepared for microscopy observations. Pasteurized
smoothies were aseptically centrifuged at 12,000  g to remove
insoluble matter, inoculated as described above and treated at the
conditions of the D and E treatments (Table 1). Cells were recovered
from the samples before and after treatments by gentle centrifugation
(400g,10 min),washed (0.1% peptonewater) and the resulting
pellet was used for staining by two fluorescent dye preparations.
The two component LIVE/DEAD BacLight kit (Molecular Probes,
Leiden, The Netherlands) was used to observe the membrane
integrity. Staining was performed on a cell pellet from a 1 mL
sample according to the manufacturer suggestions, and 5 mL of the
stained suspension was spotted onto a slide for microscopy. Untreated
and thermally inactivated L. monocytogenes cultures were
used as positive and negative controls, respectively.
The lipophilic cationic carbocyanine dye JC-1 (Molecular Probes)
exhibits a potential-dependent membrane permeation. The critical
dye concentration is achieved in the cytoplasm when membranes
are polarized, allowing the yellow/red fluorescing J aggregates to
form. In cells with depleted membrane potentials only monomers
of the dye are observed in the cytoplasm (green fluorescence)
(Cossarizza, Baccarani-Contri, Kalashnikova, & Franceschi, 1993).
Therefore, according to the potential depletion intensity, fluorescence
ranges from red to green.
JC-1 was dissolved in DMSO to a stock concentration of 10 mg/
mL (w/v) and stored in the dark until use. After JC-1 dilution (1:100
in PBS), 0.5 mL were used to suspend the cell pellet derived from
0.5 mL of sample. Then, the sample was incubated in the dark at
37 C for 15 min, washed twice and the dyed cells were suspended
in 0.3 mL of PBS before microscopy observations (5 mL).
Due to the short half-life of the stain, the digital images were
rapidly acquired using an epifluorescence microscope BX52
(Olympus Italia, Segrate, I) coupled to a ColorView II camera (SIS,
Munster, DE) and equipped with a double-band pass fluorescence
optical filter set for the simultaneous imaging of fluorescein
(485 ± 15 nm ex, 505 ± 15 nm em) and Texas red dyes (585 ± 15 nm
ex, 625 ± 15 nm em). The apparatus was also equipped with a
phase-contrast optic.
Images of each sample were acquired from 20 fields each containing
200e300 cells in order to approximately estimate the
number of cells in different physiological states.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 epifluorescence และต่างระดับจุลทรรศน์
ผลของแรงกดดันต่าง ๆ บนแผ่นเมมเบรนที่มีศักยภาพและความสมบูรณ์ของ monocytogenes lgb
L
ถูกตรวจสอบในตัวอย่างโดยเฉพาะเตรียมไว้สำหรับใช้สังเกตการณ์ พาสเจอร์ไรส์
ปั่นเป็น aseptically ระดับที่ 12 , 000  กรัมลบ
เรื่องไม่ละลายหัวเชื้อที่อธิบายข้างต้นและได้รับการรักษาที่
เงื่อนไขของ D และ E แตกต่างกัน ( ตารางที่ 1 ) เซลล์ที่พบ
จากตัวอย่างก่อนและหลังการรักษาโดย
ปั่นอ่อนโยน ( 400  กรัม , 10 นาที ) , ล้าง ( 0.1% peptonewater ) และผล
เม็ดใช้คุณสมบัติสองการเตรียมสีย้อมเรืองแสง .
2 ส่วนประกอบสด / ตาย baclight Kit ( โมเลกุล )
, ไลเดน ประเทศเนเธอร์แลนด์ ) ถูกใช้เพื่อสังเกตเยื่อ
ความซื่อสัตย์วิธีการคือใช้เม็ดเซลล์จากตัวอย่าง 1 ml
ตามที่ผู้ผลิตแนะนำ และ 5 มิลลิลิตร
เปื้อนช่วงล่างเป็นด่างบนสไลด์สำหรับกล้องจุลทรรศน์ . รักษาและยับยั้ง monocytogenes วัฒนธรรมซึ่ง
L
ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวกและลบตามลำดับ บวก carbocyanine
ลิโพฟิลิก ( โมเลกุล ) )
jc-1 ย้อมจัดแสดงเมมเบรนขึ้นอยู่กับศักยภาพ ความเข้มข้นสีย้อมผ้าวิกฤต
ได้ในไซโตปลาสซึมเมื่อ membranes
เป็นขั้วให้เหลือง / แดง fluorescing J มวลรวม

แบบฟอร์ม ในเซลล์ที่มีเยื่อมศักยภาพเพียงเมอร์
ของสีย้อมจะสังเกตได้ในไซโตปลาสซึม ( เรืองแสงสีเขียว )
( cossarizza baccarani contri kalashnikova , , , &ฟรันจี ีส , 1993 ) .
ดังนั้นตามความเข้มของศักยภาพเรืองแสง
ช่วงจากสีแดงเป็นสีเขียว .
jc-1 ละลายใน DMSO เพื่อความเข้มข้น 10 มก. / มล. หุ้น
( w / v ) และจัดเก็บไว้ในที่มืดจนกว่าจะใช้ หลังจาก jc-1 เจือจาง ( 1 : 100
ใน PBS ) , 0.5 ml ใช้ระงับเซลล์เม็ดมาจาก
0.5 ml ของกลุ่มตัวอย่าง แล้วตัวอย่างที่บ่มในที่มืดที่
37  C เป็นเวลา 15 นาทีล้างสองครั้งและย้อมเซลล์ถูกระงับใน 0.3 มิลลิลิตรก่อน
PBS กล้องจุลทรรศน์สังเกต ( 5 ml ) .
เนื่องจากครึ่งชีวิตสั้นของคราบ , ภาพดิจิตอลเป็นอย่างรวดเร็วเป็น epifluorescence
โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ bx52
( Olympus เลีย เซกราเต ผมคู่กับกล้อง colorview II ( พี่
สเตอร์ de ) พร้อมคู่วงผ่านการ
ชุดกรองแสงสำหรับการถ่ายภาพพร้อมกันี่
( 485 ± 15 nm แฟนเก่า , 505 ± 15 nm เอ็ม ) และสีแดง ( 585 ±เท็กซัส 15 nm
แฟนเก่า , 625 ± 15 nm เอ็ม ) อุปกรณ์ก็พร้อม

ต่างระดับมองเห็น ภาพของแต่ละตัวอย่างได้มาจาก 20 เขต แต่ละที่มี
200e300 เซลล์เพื่อประมาณค่า
จำนวนเซลล์ในรัฐทางสรีรวิทยาที่แตกต่างกัน