Reactions (50 ml) contained 5 ml Kl

Reactions (50 ml) contained 5 ml Klenow 10 buffer,2 ml ofdNTPsat250 mMfinalconcentration each,0.25 ml
acetylated BSA 10 mg/ml, and 1 U Klenow per mg DNA (typical
reactions contained from 0.5 to 2.0 mg of DNA). Reactions were
incubated at 25 8C for 50 min and the reaction stopped by heating to
75 8C for 10 min.Productswerepurified withPromegaWizardSVGel
and PCR Clean-up System and quantified by PicoGreen staining.
Klenow-treated PCR product (100 ng) was then digested with the
Promega restriction enzyme TaqI according to manufacturer
instructions in duplicate. Duplicate digests were pooled, ethanol
precipitated, and resuspended in 10 ml molecular grade water. Hi-Di
formamide (10 ml) and 0.5 ml of Genescan 600 LIZ size standard
(Applied Biosystems) were added to 1 ml of sample and analyzed on
an ABI3130XL capillary electrophoresis DNA fragment analyzer.
Electropherograms were processed with Peak Scanner version 1.0
software (Applied Biosystems). Trials with uncut Klenow-treated
PCR product showed no artifact peaks. Peakswere binned in T-REXTM
(Culman et al., 2008) using the algorithm developed by Smith et al.
(2005) and allowing more than one peak to be assigned to the same
terminal restriction fragment (TRF). T-RFLP data matrices were
exportedfromT-REXTMasabsolutepeakarea.Fragmentsbetween30
and600basesinlengthwereincludedintheanalysis.Foreachprimer
(341F produced yellow, Y, TRFs; 926R produced red, R, TRFs; EukA
produced blue, B, TRFs; and Euk570rev produced green, G, TRFs), the
totalpeak areaofeachsamplewas normalizedtothe sample withthe
lowesttotalpeakarea.Normalizedpeaksthatfellbelowthedetection
threshold or were found in only one profile were removed to reduce
effectsofunequal sampleloading, and the contribution ofeachTRF to
total peak area (for each color/sample combination) was calculated
for further analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ปฏิกิริยา (50 มล.) ที่มีขนาด 5 ml Klenow 10 บัฟเฟอร์ 2 มิลลิลิตร ofdNTPsat250 mMfinalconcentration แต่ละ 0.25 มล.
acetylated บีเอสเอ 10 mg / ml และ 1 U Klenow มิลลิกรัมต่อดีเอ็นเอ (ทั่วไป
ปฏิกิริยาที่มี 0.5-2.0 มิลลิกรัม DNA) ปฏิกิริยาถูก
บ่มที่ 25 8C สำหรับ 50 นาทีและหยุดปฏิกิริยาความร้อน
75 8C 10 min.Productswerepurified withPromegaWizardSVGel
PCR และระบบทำความสะอาดและปริมาณโดยการย้อมสี PicoGreen.
Klenow รับการรักษาผลิตภัณฑ์ PCR (100 นาโนกรัม) ถูกย่อยแล้วด้วย
Promega ข้อ จำกัด เอนไซม์ Taqi ตามที่ผู้ผลิต
คำแนะนำในที่ซ้ำกัน ย่อยสลายซ้ำถูกรวบรวมเอทานอล
ตกตะกอนและ resuspended ใน 10 มล. น้ำเกรดโมเลกุล Hi-Di
formamide (10 มล.) และ 0.5 มิลลิลิตร Genescan 600 มาตรฐาน LIZ ขนาด
(Applied Biosystems) ถูกเพิ่มเข้าไปใน 1 มิลลิลิตรของกลุ่มตัวอย่างและวิเคราะห์เกี่ยวกับการ
วิเคราะห์ดีเอ็นเอชิ้นส่วนอิเล็กฝอย ABI3130XL.
Electropherograms ถูกประมวลผลด้วยเครื่องสแกนเนอร์พีครุ่น 1.0
ซอฟแวร์ (ประยุกต์ Biosystems) ทดลองกับ Klenow รับการรักษาไม่ได้เจียระไน
ผลิตภัณฑ์ PCR แสดงให้เห็นว่ายอดสิ่งประดิษฐ์ไม่มี Peakswere binned ใน T-REXTM
(Culman et al., 2008) โดยใช้อัลกอริทึมที่พัฒนาโดยสมิ ธ et al.
(2005) และอนุญาตให้มากกว่าหนึ่งจุดสูงสุดที่จะได้รับมอบหมายให้เดียวกัน
ส่วนข้อ จำกัด ขั้ว (สกว) T-RFLP ข้อมูลการฝึกอบรม ผลิตสีเหลือง, Y, TRFs; ผลิต 926R สีแดง, R, TRFs; EukA ผลิตสีฟ้า, B, TRFs; และ Euk570rev ผลิตสีเขียว, G, TRFs) totalpeak areaofeachsamplewas withthe ตัวอย่าง normalizedtothe lowesttotalpeakarea.Normalizedpeaksthatfellbelowthedetection เกณฑ์หรือถูกพบอยู่ในเพียงหนึ่งรายละเอียดที่ถูกถอดออกเพื่อลดsampleloading effectsofunequal และมีส่วนร่วมในการ ofeachTRF พื้นที่สูงสุดรวม (สำหรับแต่ละสี / การรวมตัวอย่าง) ที่คำนวณได้สำหรับการวิเคราะห์ต่อ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ปฏิกิริยา ( 50 มล. ) ที่มีอยู่ 5 ml klenow 10  บัฟเฟอร์ , 2 ml ofdntpsat250 mmfinalconcentration ละ 0.25 ml
ยาวขนาด 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และ 1 u klenow ต่อมิลลิกรัม DNA ( ปฏิกิริยาทั่วไป
ที่มีอยู่จาก 0.5 ถึง 2.0 มิลลิกรัมของดีเอ็นเอ ) ปฏิกิริยา
อุณหภูมิ 25 8C 50 นาที และหยุดปฏิกิริยาความร้อน
75 8C 10 นาที productswerepurified withpromegawizardsvgel
และ PCR ทำความสะอาดระบบและ quantified โดย picogreen staining
klenow รักษาผลิตภัณฑ์ PCR ( 100 กรัม ) ถูกย่อยด้วยเอนไซม์ promega

taqi ตามผู้ผลิตคำแนะนำในที่ซ้ำกัน ย่อยซ้ำเป็นพู เอทานอล
ตกตะกอน และ resuspended 10 ml ระดับโมเลกุลน้ำ สวัสดีค่ะ ดิ
ฟอร์มาไมด์ ( 10 มล. ) และ 0.5 มิลลิลิตร ขนาดมาตรฐาน
genescan 600 ลิซ( Applied Biosystems ) เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของตัวอย่างและวิเคราะห์ในการ abi3130xl capillary electrophoresis

electropherograms ดีเอ็นเอวิเคราะห์ วิเคราะห์ด้วยยอดเครื่องสแกนเนอร์รุ่น 1.0
ซอฟต์แวร์ ( Applied Biosystems ) การทดลองกับการเจียระไน klenow
PCR ไม่พบยอด ผลิตภัณฑ์ สิ่งประดิษฐ์ peakswere binned ใน t-rextm
( culman et al . , 2008 ) โดยใช้อัลกอริทึมที่พัฒนาโดย Smith et al .
( 2005 ) และให้มากกว่าหนึ่งสูงสุดที่จะได้รับมอบหมายเหมือนกัน
เทอร์มินัลจำกัดจำเพาะ ( TRF ) t-rflp เมทริกซ์ข้อมูล
exportedfromt rextmasabsolutepeakarea . fragmentsbetween30
and600basesinlengthwereincludedintheanalysis . foreachprimer
( 341f ผลิตสีเหลือง , Y , trfs ; 926r ผลิตสีแดง , R , trfs ; euka
ผลิตสีฟ้า , B , trfs และ euk570rev ผลิตสีเขียว , g ,
trfs )totalpeak areaofeachsamplewas normalizedtothe ตัวอย่างกับ lowesttotalpeakarea
.
normalizedpeaksthatfellbelowthedetection ธรณีประตูหรือพบเพียงหนึ่งโปรไฟล์ถูกลบออกเพื่อลด
effectsofunequal sampleloading และบริจาค ofeachtrf

พื้นที่พีคทั้งหมด ( แต่ละสี / ตัวอย่างการรวมกัน ) คือคำนวณ
สำหรับการวิเคราะห์ต่อไป