radial canal and the body wall, were dissected from
both males and females. The fragments that corresponded
to the ovarian tubules and testicular tubules
were dissected under a dissection microscope. They
were washed twice with filtered seawater (FSW), and
excess seawater was wiped away with paper towel.
The tubules were then cut into 5 mm-long pieces on
ice using a razor blade. Oocytes with follicle cells were
squeezed out gently from fecund tubules of the ovary
through ruptures that had been made using fine-tipped
forceps, transferred to 15 mL test tubes, and then
spun down using a hand centrifuge. The follicular inner
epithelium (FIE) was separated from the oocytes by
incubating the mixture of cells in artificial seawater that
lacked calcium and magnesium for 10 min and gently
agitating with a pipette. Then the mixture was stood
still in the 15 mL test tubes for 10 min at ambient temperature
(AT). During this period, heavy oocytes sunk
on the bottom of tubes, while light FIE floated in the
supernatant. The FIE in supernatant was collected and
transferred to fresh tubes, pelleted in a hand centrifuge
and washed once with fresh FSW. The tissue fragments
were suspended in 3 mL of lysis buffer (6 mol ⁄ L
urea, 1% Nonidet P-40, 10 mmol⁄ L Tris–HCl, pH 7.6),
and homogenized with a glass homogenizer at
500 rpm for 10 min. The sample was precipitated by
adding cold ethanol to a final concentration of 75%
(v ⁄ v) and stored at )20C overnight. The precipitates
were centrifuged at 1500 g for 10 min, washed twice
with 100% cold ethanol, freeze-dried by using a
VD-800F Vacuum Freeze Dryer (lyophilized sample;
TAITEC, Koshigaya, Japan), and stored at )80C until
use.
คลองยางเรเดียลและร่างกายถูกตัดจากผนังทั้งชายและหญิง ชิ้นส่วนของกับท่อ ท่อรังไข่ และอัณฑะถูกผ่าชำแหละภายใต้กล้องจุลทรรศน์ พวกเขาเคยล้างสองครั้งกับกรองน้ำทะเล ( fsw )น้ำทะเลส่วนเกินถูกเช็ดออกไปด้วยผ้าขนหนูกระดาษท่อนี้ แล้วหั่นเป็นชิ้นยาว 5 มม. บนน้ำแข็งที่ใช้มีดโกนใบมีด ไข่ ( follicle ) เซลล์บีบออกเบา ๆจากอุดมสมบูรณ์ ) ส่วนของรังไข่ผ่านแตกตัวที่ได้ใช้ดีก้นคีม , โอน 15 ml หลอดทดลองแล้วปั่นลง ใช้มือหมุนแล้ว . วันปัจฉิม ภายในเยื่อบุผิว ( ฟี ) ถูกแยกออกจากเซลล์โดยไข่ส่วนผสมของเซลล์ในน้ำทะเลเทียมว่าขาดแคลเซียมและแมกนีเซียม ใน 10 นาที และค่อย ๆก่อกวนด้วยหลอด จากนั้นผสมยืนอยู่ใน 15 ml หลอดทดลองสำหรับ 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง( ที่ ) ในระหว่างนี้ ไข่จมหนักที่ด้านล่างของหลอด ในขณะที่ไปในแสงลอยน่าน . การรวบรวมและนำไปในโอนไปยังหลอดสด , อัดเม็ดในมือเหวี่ยงและล้างอีกครั้งกับ fsw สด เศษเนื้อเยื่อหยุดชั่วคราวใน 3 มล. ของการสลายบัฟเฟอร์ ( 6 โมล ⁄ lurea 1% nonidet p-40 10 mmol l บริษัท⁄– HCl , pH 7.6 )บดด้วยเครื่องปั่นและแก้วที่500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่างมันตกตะกอนโดยเพิ่มความเย็นเอทานอลความเข้มข้นสุดท้าย 75%( 5 ) ⁄ V ) เก็บที่อุณหภูมิ 20C ค้างคืน และตะกอนอยู่ที่ระดับ 1 , 500 กรัมต่อ 10 นาที ล้าง 2 ครั้ง100% เย็นแห้งโดยการใช้เอทานอลvd-800f แช่แข็งสุญญากาศ เครื่องเป่าแห้ง ตัวอย่างtaitec Koshigaya , ญี่ปุ่น ) , และเก็บไว้ที่ ) 80c จนกว่าใช้
การแปล กรุณารอสักครู่..
