2. Materials and methods2.1. Entero

2. Materials and methods
2.1. Enterococci isolation, phenotypic and genetic identification

Silverside (O. platensis) is a marine fish that inhabits the coast of South America. It is found in template or cold water ( Sampaio, 2006). It possesses meat of excellent quality. As a consequence, it represents an important resource in the Argentine market (Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca de la República, Argentina, 2015). Many LAB strains were isolated from silverside intestine sampled in the Patagonian region of Argentine according to Marguet, Vallejo, Sierralta Chichisola, and Quispe (2011). The contents from intestinal tract of silverside specimens were homogenized in 1 ml of sterile saline solution. An aliquot of the homogenates was inoculated into De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) broth (Biokar Diagnostics, Beauvais, France) and incubated at 25 °C for 6 h. Then the enrichments were plated onto MRS supplemented with nalidixic acid (20 mg/l) and cycloheximide (10 mg/l) and incubated at 25 °C for 48 h.

One strain was selected and its presumptive identification to genus level was carried out by observation of cell pigment production on Brain Heart Infusion (BHI) agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France), morphology, Gram staining, catalase and oxidase production, growth at 10 and 45 °C, growth in presence of NaCl (6.5 g/100 ml) and at pH 9.6, as well as growth and esculin hydrolysis on bile-esculin agar (BEA) (Schleifer & Kilpper-Bälz, 1984). Pyrrolidonyl aminopeptidase activity was tested using a commercial kit (Pyrrolidonyl peptidase strips; BioChemika, Sigma Aldrich, USA). To perform the identification of an Enterococcus to species level, sugar fermentation was evaluated according to the Manero and Blanch (1999) scheme.

Genomic DNA was extracted from the pellet of an overnight culture in MRS broth and purified using a purification kit (Wizard, Genomic, Promega, Wisconsin) following manufacturer's recommendations. The 16S rRNA gene sequence (corresponding to positions 27–1492 in the Escherichia coli gene) was PCR amplified as described by DeLong (1992), using a DNA thermal cycler Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Germany). Sequencing on both strands of PCR-amplified fragments was performed using the dideoxy chain termination method by the commercial services of Macrogen Inc. (Seoul, Korea). The 16S rRNA homology searches against the NCBI database were carried out using BLAST program (Altschul, Gish, Miller, Myers, & Lipman, 1990). Sequence was deposited at the GenBank database.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 แยก Enterococci, ฟีโนไทป์และบัตรประจำตัวทางพันธุกรรม

Silverside (ทุม platensis) เป็นปลาทะเลที่อาศัยอยู่ชายฝั่งของทวีปอเมริกาใต้ มันถูกพบในแม่แบบหรือน้ำเย็น (Sampaio 2006) มันมีคุณสมบัติเนื้อสัตว์ที่มีคุณภาพดี เป็นผลให้มันหมายถึงทรัพยากรที่สำคัญในตลาดอาร์เจนตินา (Ministerio de เกษตร, Ganadería Y Pesca เดอลาRepúblicaอาร์เจนตินา 2015) สายพันธุ์ LAB หลายคนถูกแยกออกจากลำไส้ Silverside ตัวอย่างในภูมิภาค Patagonian อาร์เจนตินาตาม Marguet, วัลเล Sierralta Chichisola และ Quispe (2011) เนื้อหาจากลำไส้ของตัวอย่าง Silverside ถูกปั่นใน 1 มิลลิลิตรของสารละลายน้ำเกลือปราศจากเชื้อ หารของ homogenates ถูกเชื้อเข้าไปในชายและ Rogosa ชาร์ป (MRS) น้ำซุป (วินิจฉัย Biokar, Beauvais, ฝรั่งเศส) และบ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 6 ชั่วโมง แล้ว enrichments ถูกชุบบน MRS เสริมด้วยกรด nalidixic (20 mg / l) และ cycloheximide (10 mg / l) และบ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง.

หนึ่งสายพันธุ์ที่ได้รับการคัดเลือกและบัตรประจำตัวสันนิษฐานของตนให้อยู่ในระดับสกุลได้ดำเนินการโดย การสังเกตของการผลิตเม็ดสีของเซลล์ในสมองหัวใจ Infusion (BHI) วุ้น (วินิจฉัย Biokar, Beauvais, ฝรั่งเศส) สัณฐานวิทยาแกรมการย้อมสี catalase และการผลิต oxidase การเจริญเติบโตที่ 10 และ 45 องศาเซลเซียสการเจริญเติบโตในการปรากฏตัวของโซเดียมคลอไรด์ (6.5 กรัม / 100 มล.) และที่ pH 9.6 เช่นเดียวกับการเจริญเติบโตและ esculin ย่อยสลายในน้ำดี esculin วุ้น (BEA) (Schleifer & Kilpper-BALZ, 1984) กิจกรรม aminopeptidase Pyrrolidonyl ได้รับการทดสอบโดยใช้ชุดพาณิชย์ (Pyrrolidonyl แถบ peptidase; BioChemika ซิกดิช, สหรัฐอเมริกา) เพื่อดำเนินการบัตรประจำตัวของ Enterococcus ถึงระดับชนิดหมักน้ำตาลถูกประเมินตาม Manero และ Blanch (1999) โครงการ.

จีโนมดีเอ็นเอที่สกัดจากเม็ดของวัฒนธรรมค้างคืนใน MRS น้ำซุปและบริสุทธิ์โดยใช้ชุดฟอก (ตัวช่วยสร้างจีโนม , Promega, วิสคอนซิน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ลำดับของยีน 16S rRNA (ตรงกับตำแหน่ง 27-1492 ใน coli ยีน Escherichia) คือ PCR ขยายตามที่อธิบาย DeLong (1992) โดยใช้ดีเอ็นเอ Cycler ความร้อน Mastercycler (Eppendorf, ฮัมบูร์ก, เยอรมนี) Sequencing ทั้งเส้นของเศษ PCR-amplified ถูกดำเนินการโดยใช้โซ่ dideoxy วิธีการเลิกจ้างโดยการให้บริการในเชิงพาณิชย์ของ Macrogen อิงค์ (กรุงโซลประเทศเกาหลี) การค้นหาที่คล้ายคลึงกัน 16S rRNA กับฐานข้อมูล NCBI ถูกดำเนินการโดยใช้โปรแกรม BLAST (Altschul กิชมิลเลอร์ไมเออร์และลิปแมน, 1990) ลำดับที่ถูกวางที่ฐานข้อมูลของ GenBank