Example 6: Assessment of the deple

Example 6: Assessment of the depleting activity of H5L7BW and H5L7 by antibody dependent
cellular cytotoxicity (ADCC) in primary ฮิวเมน T cells



The donors used in these experiments were screened for re-call responses to the CD4
antigens present in Revaxis, (Diptheria, Tetanus and Poliomyelitis) and to either a CMVpp65 peptide
pool or to a CD8 peptide pool, which contained peptide เอพิโทปs to CMV, EBV and Influenza. The
antigen used to perform initial studies was the CMVpp65 peptide pool. However, due to the limited 5 number of donors that demonstrated a re-call response to this antigen, Revaxis and the CD8 peptide
pool were the antigens used to generate the majority of the potency data for the แอนติ-LAG3
antibodies.
Peripheral blood was collected from healthy ฮิวเมน volunteers on day 0 (25mL) and day 5
(75mL) of the experiment and was used to prepare mononuclear cells by ficollplaque density
10 gradient centrifugation. The PBMCs prepared on day 0 were labeled using the CellTrace" Violet Cell
Proliferation Kit, in accordance with the manufacturer's instructions, after which they were washed,
seeded in 24-well flat bottomed tissue culture plates at a density of 2x106/mL in medium and
stimulated with antigen (Revaxis and the CD8 peptide pool were used at a dilution of 1 in 1000; the
CMVpp65 peptide was used at a dilution of 1 in 100). The PBMCs were incubated for 5 days at 37°C
15 in a 5% CO2 humidified incubator.
Autologous donor NK cells were purified from the PBMCs prepared on day 5 of the
experiment by negative selection using kits from either Invitrogen or Miltenyi Biotec in accordance with the specific instructions of each manufacturer. The purified NK cells were counted and diluted to a density of 1.3x106/mL in medium.
20 The cells that had been stimulated with antigen for 5 days were washed, counted and
diluted to a density of 2x106/viable cells/mL in medium.
Autologous donor NK cells (80pL) and antigen activated cells (100pL) were pipetted into
round-bottomed 5mL polystyrene FACS tubes with test antibody or medium (20pL). The final
concentrations of the anti LAG-3 antibodies tested ranged from 1000 to 0.015ng/mL. The samples 25 were incubated for 18 h at 37°C in a 5% CO2 humidified incubator. After 18 h the ADCC assay
samples were analysed for the presence of antigen specific LAG-3 positive T cells using flow
cytometry. Briefly, the samples were washed in FACS buffer, blocked with ฮิวเมน IgG (3pg/tube),
and incubated with mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4, CD8, CD337, CD25 and LAG-3 flurochrpme คอนจูเกตed
antibodies for 30 minutes in the dark at room temperature. After a further wash step in PBS the 30 cells were incubated in the presence of a fixable green dead cell for 30 minutes in the dark at room
temperature. The samples were finally washed with PBS, fixed and analysed by flow cytometry
using a 60 second acquisition time at a flow rate of 1pL per second.
All sample data were acquired using the BD FACSCanto II Flow Cytometer with FACS Diva
software version 6.1.3 (BD BioSciences). The Live/Dead fixable green dead cell stain was used as a 35 dead cell exclusion marker and appropriate ไอโซไทป์ and FMO-1 controls were used to define
negative populations. Briefly dead cells were omitted from the analysis using a plot of forward
scatter (FSC-A) against fluorescence in FL1 (Green dead cell stain). Doublets were then excluded
from the analysis by using a plot of FSC-W against FSC-H. Viable single lymphocytes were
33





subsequently identified and gated using a plot of forward scatter (FSC-A) against side scatter (SSC-
A). CD4 antigen specific T cells were identified from this gated population of cells using plots of CD4
fl uorescence against SSC-A and Violet Dye fluorescence against CD4 fluorescence respectively.
Antigen specific CD4 T cells were identified by a reduction of Violet Dye fluorescence. A further plot 5 of CD25 fluorescence against LAG-3 fluorescence was drawn to confirm the activation state of this
population of cells and that they expressed LAG-3. Similar plots were drawn to identify antigen
specific CD8 T cells.
The percentages of antigen specific CD4 and CD8 T cells present in each sample (as a
percentage of the viable lymphocyte population) were recorded. Nonlinear variable slope curve-fits 10 of these data were plotted and EC50 values were generated using GraphPad Prism software (v5.03).
To calculate the maximum level of การลดปริมาณ observed in an assay, at the highest
concentration of antibody tested, the following formula was used: (1-(% Antigen specific T cells remaining after antibody treatment )/(% Antigen specific T cells remaining in the absence of antibody))*100.
15 Potency data for the การลดปริมาณ of LAG3 positive antigen specific CD8 and CD4 T cells by
H5L7BW and H5L7 was generated using the in vitro assay system detailed above. H5L7BW induced การลดปริมาณ of LAG3 positive antigen specific CD4 and CD8 T cells by ADCC in six of the seven donors studied for disappearance of the respective cell types. The potency of H5L7BW in antigen specific CD4 T cells, as quantified by EC50 values, ranged from 14pg/mL to 3.4ng/mL with maximum levels
20 of การลดปริมาณ ranging from 44 to 78%. The potency of this antibody in antigen specific LAG-3 positive
CD8 T cells ranged from 122pg/mL to 17.5ng/mL, with maximum levels of การลดปริมาณ ranging from
39 to 87%. H5L7 mediated low levels of การลดปริมาณ, or was inactive, in the donors studied.


Example 7: Assessment of the depleting activity of H5L7BW and H5L7 in an in-vivo ฮิวเมน
25 PBMC/mouse SCID xenograft model

This assay describes the use of a ฮิวเมน PBMC/mouse SCID xenograft model to assess in
vivo การลดปริมาณ efficacy of the โมโนโคลนอล, fully ฮิวเมไนซ์, อะฟิวโคซิเลตเตด LAG-3 depleting antibody
H5L7BW on activated ฮิวเมน T cells. Healthy volunteer peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) 30 were isolated and stimulated overnight (แอนติ-CD3, IL-12) to induce LAG-3 expression prior to
injection into the peritoneum of immuno-compromised SCID mice. LAG-3 depleting or control
antibodies were either co-administered into the peritoneum or injected intravenously.
การลดปริมาณ of LAG-3 positive cells was assessed by flow cytometry in peritoneal lavage samples 5 or 24 hours after cell injection.
35 Mice were injected with activated huPBMCs (4 x 106- 2 x 107cells in 0.4ml of PBS) by the
intraperitoneal route. Depending on the particular study route, LAG-3 antibodies or huIgG1 BioWa controls were either co-administered i.p. with the huPBMCs or mice were pre-treated intravenously 18h prior to huPBMC injection. 5 or 24 hours post-cell injection, mice were euthanized, a peritoneal
34





lavage was performed and the cellular content of the lavage buffer analysed by flow cytometry. Briefly, peritoneal lavage involved 3 x 5m1 washes of the intact peritoneal cavity using cold PBS containing 3mM EDTA.
All sample data were acquired using the BD FACSCanto II Flow Cytometer with FACS Diva 5 software version 6.1.3 (BD BioSciences). Approximately 1 x 106 cells (where possible) were added
per FACS tube, the cell suspensions centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, and the pellet then re-
suspended in 3m1 PBS. The supernatants were then carefully decanted and the cell pellets re-
suspended in 100p1 cold FACS wash buffer. 15p1 FcR Blocking Reagent was then added per tube
and the cells incubated for 10 minutes at room temperature. 5p1 of each staining antibody (10p1 of 10 1:100 pre-diluted แอนติ-LAG-3 blocking/detection antibody 17B4-PE) or ไอโซไทป์ control were then
added respectively and incubated for 20 minutes at room temperature protected from light. The
cells were subsequently washed by addition of 4 ml FACS buffer per tube and centrifugation at 1500
rpm for 5 minutes after which the supernatant was carefully decanted. This washing step was
repeated. Finally the cells were re-suspended in 300p1 FACS buffer and analysed by flow cytometry. 15 In addition to LAG-3 detection by use of the fluorescently labeled LAG-3 blocking antibody 17B4-PE,
the following T cell and activation markers were used for T cell phenotyping: CD45, CD4, CD8, and
CD25. Percentages of CD4 and CD8 .T cells were expressed as percentage of CD45 positive cells.
LAG-3 positive T cell populations were expressed as percentages of their parent populations CD4
and CD8.
20 FACS Diva software version 6.1.3 was used to generate batch analyses of individual cell
counts/events and cell population percentages. Data were analysed with SAS version 9.2.2 software using a generalized linear model for binomial data. This analysis directly models the cell count as a proportion of the parent population. In this way, the size of the parent population is taken into
account during the analysis. Means were calculated for proportions of target cell type for each 25 treatment, along with 95% confidence intervals. These were expressed as percentages.
Planned comparisons of treatments versus Control were made using odds ratios. This
expresses the odds of having a target cell type in one treatment as a ratio to the odds of having the
target cell type on control treatment. An odds ratio < 1 would indicate a reduced odds of having the
cell type in the treatment of interest compared to the control. An odds ratio < 1 would indicate a 30 reduced odds of having the cell type in the treatment of interest compared to the control.
All experiments were performed using PBMCs from individual healthy blood donors and due
to the large blood volumes required per experiment, no donor was used more than once. LAG-3
expression levels after overnight stimulation varied greatly between donors (ranging from 2-73%
cell surface expression) but thes

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างที่ 6: การประเมินกิจกรรมที่พึ่งของ H5L7BW และ H5L7 โดยแอนติบอดีขึ้นเซลลูลาร์ cytotoxicity (ADCC) ในเซลล์หลักฮิวเมน Tผู้บริจาคที่ใช้ในการทดลองนี้ถูกฉายสำหรับเรียกอีกคำตอบ CD4antigens แสดง ใน Revaxis, (Diptheria บาดทะยัก และโรคโปลิโอ) และทั้งเปป CMVpp65 สระว่ายน้ำ หรือสระว่ายน้ำเพปไทด์ CD8 ซึ่งมีอยู่ เอพิโทปs เพปไทด์ EBV, CMV และไข้หวัดใหญ่ ที่ ตรวจหาใช้การศึกษาเริ่มต้นสระเปป CMVpp65 อย่างไรก็ตาม เนื่องจากจำนวนผู้บริจาคที่แสดงการตอบสนองการเรียกนี้ตรวจหา Revaxis และเพปไทด์ CD8 จำกัดที่ 5 สระว่ายน้ำมี antigens ที่ใช้สร้างส่วนใหญ่ของข้อมูลการรู้จักแอนติ-LAG3 แอนตี้กันรวบรวมเลือดที่ต่อพ่วงจากอาสาสมัครสุขภาพฮิวเมนในวันที่ 0 (25 มล.) และวันที่ 5 (75 มล.) ของการทดลอง และใช้ในการเตรียมเซลล์ mononuclear โดยความหนาแน่น ficollplaque 10 centrifugation ไล่โทนสี PBMCs ที่เตรียมในวันที่ 0 ได้ชื่อ CellTrace ใช้"เซลล์ม่วง แพร่หลายชุด ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ที่พวกเขามีเครื่องซักผ้า seeded ในดี 24 bottomed เยื่อแผ่นที่ความหนาแน่นของ 2 x 106/มิลลิลิตร ในกลาง และ ถูกกระตุ้น ด้วยตรวจหา (ใช้ Revaxis และ CD8 เพปไทด์สระว่ายน้ำที่เจือจาง 1 ใน 1000 การ เพปไทด์ CMVpp65 ใช้ในการเจือจางของ 1 ใน 100) PBMCs ถูก incubated 5 วันที่ 37° C15 5% CO2 humidified บ่มเพาะวิสาหกิจผู้บริจาค autologous NK เซลล์ที่บริสุทธิ์จาก PBMCs ที่เตรียมในวันที่ 5 ของการทดลอง โดยลบส่วนที่เลือกใช้ชุดจาก Invitrogen หรือไบโอเทค Miltenyi ตามคำแนะนำของผู้ผลิตแต่ละ เซลล์ NK บริสุทธิ์ถูกนับ และผสมกับความหนาแน่นของ 1.3x106/mL ใน20 นับเซลล์ที่มีการถูกกระตุ้น ด้วยตรวจหาสำหรับ 5 วันถูกล้าง และผสมกับความหนาแน่นของเซลล์ทำ งาน/2 x 106 mL ในผู้บริจาค autologous NK เซลล์ (80pL) และเรียกใช้การตรวจหาเซลล์ (100pL) มี pipetted เป็น ยนที่กลม 5mL โฟม FACS ท่อทดสอบแอนติบอดีหรือปานกลาง (20pL) สุดท้าย ความเข้มข้นของแอนตี้ความล่าช้า-3 ต่อต้านที่ทดสอบอยู่ในช่วงจาก 1000 ไป 0.015ng / mL ตัวอย่าง 25 ถูก incubated สำหรับ h 18 ที่ 37° C ใน incubator humidified CO2 5% หลังจาก h 18 ทดสอบ ADCC ตัวอย่างที่ analysed สำหรับตรวจหาเฉพาะความล่าช้า 3 บวก T เซลล์โดยใช้ขั้นตอนของ เซลล์ ตัวอย่างสั้น ๆ ถูกล้างในบัฟเฟอร์ FACS บล็อกกับฮิวเมน IgG (3pg/หลอด), และ incubated กับเมาส์แอนติฮิวเมน CD4, CD8, CD337, CD25 และความล่าช้า 3 flurochrpme คอนจูเกตed แอนตี้ 30 นาทีในมืดที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างเพิ่มเติมขั้นตอนใน PBS มี incubated เซลล์ 30 ในต่อหน้าของเซลล์ตายสีเขียวแน่นอน 30 นาทีในห้องมืด อุณหภูมิ ตัวอย่างสุดท้ายล้าง ด้วย PBS ถาวร และ analysed โดยเซลล์กระแส ใช้เวลา 60 วินาทีมาที่อัตราการไหลของ 1pL ต่อวินาทีข้อมูลตัวอย่างทั้งหมดได้รับมาด้วย BD FACSCanto II ไหล Cytometer FACS Diva ซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 6.1.3 (เวลาออก BD) ใช้เป็นเครื่องหมายแยกเซลล์ที่ตายแล้วและไอโซไทป์ที่เหมาะสม 35 คราบเซลล์ตายแน่นอนสีเขียวสด/ตาย และควบคุม FMO-1 ถูกใช้ในการกำหนด ประชากรเป็นค่าลบ สั้น ๆ เซลล์ตายถูกตัดออกจากการวิเคราะห์โดยใช้แผนแบบไปข้างหน้า กระจาย (FSC-A) กับ fluorescence ใน FL1 (เซลล์ตายเขียวคราบ) Doublets ถูกแยกออกแล้ว จากการวิเคราะห์โดยใช้แผนของ FSC-W กับ FSC H. Lymphocytes เดียวทำงานได้33 ต่อมามีระบุ และ gated ใช้แผนการกระจายไปข้างหน้า (FSC-A) กับด้านกระจาย (SSC-A) ระบุจากประชากรนี้รั้วใช้ผืน CD4 เซลล์ CD4 ตรวจหา T เซลล์ที่ระบุ fl uorescence กับ SSC A และไวโอเลท fluorescence ย้อมกับ CD4 fluorescence ตามลำดับ ตรวจหาเซลล์ CD4 T เฉพาะที่ระบุ โดยลดการ fluorescence สีม่วง แผนเพิ่มเติม 5 ของ fluorescence CD25 กับความล่าช้า 3 fluorescence ออกเพื่อยืนยันสถานะการเปิดใช้งานนี้ ประชากรของเซลล์และการที่พวกเขาแสดงความล่าช้า 3 ผืนคล้ายถูกออกเพื่อระบุการตรวจหา เซลล์ CD8 T ที่ระบุแสดงเปอร์เซ็นต์ของการตรวจหา CD4 และ CD8 T เซลล์ที่ระบุในแต่ละตัวอย่าง (เป็นการเปอร์เซ็นต์ของประชากรได้ lymphocyte) ถูกบันทึกไว้ ไม่เชิงเส้นตัวแปรลาดโค้งพอดีกับ 10 ข้อมูลเหล่านี้ถูกพล็อต และค่า EC50 สร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad ปริซึม (v5.03) การคำนวณระดับสูงสุดของการลดปริมาณในการทดสอบ ที่สูงสุดทดสอบความเข้มข้นของแอนติบอดี ต่อไปนี้ใช้สูตร: (1- (% T การตรวจหาเซลล์ที่เหลืออยู่หลังจากแอนติบอดีรักษา) / (% T การตรวจหาเซลล์ที่เหลืออยู่ของแอนติบอดี)) * 100ข้อมูลศักยภาพ 15 การลดปริมาณ LAG3 บวกตรวจหาเฉพาะ CD4 T และ CD8 เซลล์โดยH5L7BW และ H5L7 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ระบบวิเคราะห์ในรายละเอียดข้างต้น H5L7BW เกิดการลดปริมาณของ LAG3 บวกการตรวจหา CD4 และ CD8 T เซลล์ที่ระบุ โดย ADCC ในหกของผู้บริจาค 7 ศึกษาหายตัวไปของชนิดเซลล์ที่เกี่ยวข้อง จำนวน H5L7BW ในการตรวจหา CD4 T เซลล์ที่ระบุ เป็น quantified โดยค่า EC50 อยู่ในช่วงจาก 14pg/mL การ 3.4ng / mL กับระดับสูงสุด20 ของการลดปริมาณตั้งแต่ 44 ถึง 78% จำนวนนี้แอนติบอดีในตรวจหาเฉพาะความล่าช้า 3 บวกเซลล์ CD8 T อยู่ในช่วงจาก 122pg/mL การ 17.5ng / mL ระดับสูงสุดของการลดปริมาณตั้งแต่39-87% ด้วย H5L7 mediated ระดับต่ำของการลดปริมาณ หรือถูกใช้งาน ในผู้บริจาคที่ศึกษาตัวอย่างที่ 7: วัดกิจกรรมที่พึ่งของ H5L7BW และ H5L7 ในการฮิวเมนใน vivoรุ่น xenograft เมาส์ PBMC วทคร 25ทดสอบนี้อธิบายการใช้แบบจำลอง xenograft PBMC วทครเมาส์ฮิวเมนเพื่อประเมินใน vivo การลดปริมาณประสิทธิภาพของโมโนโคลนอล ทั้งหมดฮิวเมไนซ์ อะฟิวโคซิเลตเตดความล่าช้า 3 พึ่งแอนติบอดี H5L7BW บนเซลล์เปิดฮิวเมน T เลือดต่อพ่วงในอาสาสมัครสุขภาพ mononuclear เซลล์ (PBMCs) 30 แยกต่างหาก และถูกกระตุ้นแอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์ (แอนติ-CD3, IL 12) เพื่อก่อให้เกิดความล่าช้า 3 นิพจน์ก่อนหน้า ฉีดเข้า peritoneum ของหนูวทคร immuno สมบูรณ์ ความล่าช้า 3 พึ่งหรือควบคุม แอนตี้ได้ร่วมจัดการในการ peritoneum หรือฉีด intravenouslyการลดปริมาณของความล่าช้า 3 บวกเซลล์ถูกประเมิน โดยเซลล์ไหลใน peritoneal lavage ตัวอย่าง 5 หรือ 24 ชั่วโมงหลังจากฉีดเซลล์หนู 35 ถูกฉีด ด้วย huPBMCs ที่เปิดใช้งาน (2 4 x 106 x 107cells ใน 0.4ml ของ PBS) โดยทาง intraperitoneal ขึ้นอยู่กับกระบวนการผลิตศึกษาเฉพาะ แอนตี้ความล่าช้า-3 หรือ huIgG1 BioWa ควบคุมมี i.p. การปกครองร่วมกับ huPBMCs หรือหนูถูกบำบัดก่อน intravenously h 18 ก่อนฉีด huPBMC 5 หรือ 24 ชั่วโมงเซลล์หลังฉีด หนูมี euthanized การ peritoneal34 ทำ lavage และเนื้อหาของบัฟเฟอร์ lavage เซล analysed โดยเซลล์กระแส สั้น ๆ peritoneal lavage เกี่ยวข้อง washes 3 x 5 เมตร 1 ของช่อง peritoneal เหมือนเดิมใช้ PBS เย็นประกอบด้วย 3mM EDTAข้อมูลตัวอย่างทั้งหมดได้รับมาใช้ใน BD FACSCanto II ไหล Cytometer FACS ร้อง 5 ซอฟต์แวร์รุ่น 6.1.3 (เวลาออก BD) ประมาณ 1 x 106 เซลล์ (สุด) ถูกเพิ่ม ต่อท่อ FACS บริการเซลล์ centrifuged ที่ 1500 rpm สำหรับ 10 นาที และเม็ด แล้ว re- หยุดชั่วคราวใน PBS 3m 1 Supernatants ถูกแล้วอย่างรอบคอบ decanted และเซลล์ขี้ re- หยุดชั่วคราวใน 1 p 100 เย็น FACS ล้างบัฟเฟอร์ 1 p 15 FcR บล็อกรีเอเจนต์ถูกเพิ่มต่อหลอด และเซลล์ incubated 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง 5p 1 ย้อมสีแอนติบอดี (10p 1 ของ 10 1: 100 แตกออกก่อนแอนติ-ความล่าช้า-3 บล็อก/ตรวจหาแอนติบอดี 17B4-PE) หรือไอโซไทป์ควบคุมแต่ละถูกแล้วเพิ่มตามลำดับ และ incubated สำหรับ 20 นาทีที่อุณหภูมิห้องได้รับการป้องกันจากแสง ที่เซลล์ถูกล้างในเวลาต่อมา โดยเพิ่มบัฟเฟอร์ FACS 4 ml ต่อหลอดและ centrifugation 1500 rpm 5 นาทีหลังจาก supernatant ถูก decanted อย่างระมัดระวัง ขั้นตอนการล้างนี้ได้ ซ้ำ ในที่สุด เซลล์ถูกหยุดชั่วคราวอีกครั้งในบัฟเฟอร์ FACS 300 p 1 และ analysed โดยเซลล์กระแส 15 นอกจากการตรวจสอบความล่าช้า-3 โดยใช้การ fluorescently ป้ายความล่าช้า 3 บล็อกแอนติบอดี 17B4-PE ใช้สำหรับ phenotyping T เซลล์เซลล์ T ต่อไปนี้และเครื่องหมายเปิดใช้งาน: CD45, CD4, CD8 และ CD25 เปอร์เซ็นต์ของ CD4 และ CD8 T เซลล์ที่แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของเซลล์บวก CD45 ความล่าช้า 3 บวก T เซลล์ประชากรที่แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของประชากรหลักของ CD4 และ CD8รุ่นซอฟต์แวร์ FACS Diva 20 6.1.3 ถูกใช้เพื่อสร้างชุดวิเคราะห์ของแต่ละเซลล์กิจกรรม/จำนวน และเปอร์เซ็นต์ของประชากรของเซลล์ ข้อมูลได้ analysed กับซอฟต์แวร์รุ่น 9.2.2 SAS โดยใช้แบบจำลองเชิงเส้นเมจแบบทั่วไปสำหรับข้อมูลทวินาม วิเคราะห์นี้รุ่นการนับจำนวนเซลล์ตามสัดส่วนของประชากรหลักโดยตรง ด้วยวิธีนี้ จำนวนประชากรหลักถูกนำมาเป็นบัญชีระหว่างการวิเคราะห์ หมายถึงมีคำนวณสำหรับสัดส่วนของชนิดของเซลล์เป้าหมายสำหรับแต่ละ 25 พร้อมกับช่วงความเชื่อมั่น 95% เหล่านี้ถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ เปรียบเทียบแผนการรักษาและควบคุมทำโดยใช้อัตราส่วนราคาต่อรอง นี้แสดงความพิมพ์ราคาของเซลล์เป้าหมายรักษาหนึ่งเป็นอัตราส่วนที่ราคาที่มีการ ชนิดเซลล์เป้าหมายในการรักษาควบคุม อัตรา < 1 ราคาจะแสดงราคาที่ลดลงมีการ ชนิดของเซลล์ในการรักษาที่น่าสนใจเมื่อเทียบกับตัวควบคุม อัตรา < 1 ราคาจะแสดงราคาลดลง 30 มีเซลล์ชนิดในการบำบัดรักษาที่น่าสนใจเมื่อเทียบกับตัวควบคุม ดำเนินการทดลองทั้งหมดใช้ PBMCs จากผู้บริจาคเลือดเพื่อสุขภาพแต่ละ และครบกำหนดให้ปริมาณเลือดมากต่อการทดลอง ผู้บริจาคไม่ใช้มากกว่าหนึ่งครั้ง ความล่าช้า 3 ระดับนิพจน์หลังกระตุ้นค้างคืนที่แตกต่างกันมากระหว่างผู้บริจาค (ตั้งแต่ 2-73% เซลล์ผิวนิพจน์) แต่สิ่งนี้หรือ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างที่ 6: การประเมินของกิจกรรมพึ่งพาของ H5L7BW และ H5L7
โดยแอนติบอดีขึ้นอยู่กับพิษโทรศัพท์มือถือ(ADCC) ในเบื้องต้นฮิวเมนทีเซลล์ผู้บริจาคที่ใช้ในการทดลองเหล่านี้ถูกคัดกรองสำหรับการตอบสนองกลับมาเรียกร้องให้CD4 แอนติเจนในปัจจุบัน Revaxis (Diptheria บาดทะยักและโปลิโอ) และเปปไทด์ทั้ง CMVpp65 สระว่ายน้ำหรือสระว่ายน้ำเปปไทด์ CD8 ซึ่งประกอบด้วยเปปไทด์เอพิโทปที่จะ CMV, EBV และไข้หวัดใหญ่ แอนติเจนใช้ในการดำเนินการศึกษาเริ่มต้นเป็นสระว่ายน้ำเปปไทด์ CMVpp65 แต่เนื่องจากการ จำกัด จำนวน 5 ของผู้บริจาคที่แสดงให้เห็นถึงการตอบสนองกลับมาเรียกร้องให้แอนติเจนนี้ Revaxis และเปปไทด์ CD8 สระว่ายน้ำมีแอนติเจนที่ใช้ในการสร้างส่วนใหญ่ของข้อมูลความแรงสำหรับแอนติ -LAG3 แอนติบอดี. เลือดอุปกรณ์ต่อพ่วง ถูกเก็บรวบรวมจากการมีสุขภาพดีฮิวเมนอาสาสมัครในวันที่ 0 (25ml) และวันที่ 5 (75ml) ของการทดลองและใช้ในการเตรียมเซลล์โมโนนิวเคลียร์โดยความหนาแน่นของ ficollplaque 10 ปั่นแยกลาด PBMCs เตรียมในวันที่ 0 มีป้ายใช้ CellTrace "ม่วงเซลล์ขยายชุดตามคำแนะนำของผู้ผลิตหลังจากที่พวกเขาได้รับการล้างเมล็ดใน24 หลุมแบนจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจุดต่ำสุดที่อัตราความหนาแน่น 2x106 / มิลลิลิตรในขนาดกลางและกระตุ้นด้วยแอนติเจน (Revaxis และสระว่ายน้ำเปปไทด์ CD8 ถูกนำมาใช้ในการลดสัดส่วนของ 1 ใน 1000 นั้นเปปไทด์CMVpp65 ถูกนำมาใช้ในการลดสัดส่วนของ 1 ใน 100). โดย PBMCs ถูกบ่มเป็นเวลา 5 วันที่ 37 ° C 15 ใน 5% CO2 ความชื้นศูนย์บ่มเพาะ. Autologous ผู้บริจาคเซลล์ NK ถูกบริสุทธิ์จาก PBMCs ที่จัดทำขึ้นในวันที่ 5 ของการทดลองโดยการเลือกเชิงลบโดยใช้ชุดจากทั้งInvitrogen หรือ Miltenyi Biotec สอดคล้องกับคำแนะนำของผู้ผลิตแต่ละราย. โดยบริสุทธิ์เซลล์ NK นับและลดลง ความหนาแน่นของ 1.3x106 / มิลลิลิตรในสื่อก. 20 เซลล์ที่ได้รับการกระตุ้นด้วยแอนติเจนเป็นเวลา 5 วันถูกล้างนับและเจือจางความหนาแน่นของ2x106 / เซลล์ / มิลลิลิตรในระดับปานกลาง. Autologous ผู้บริจาคเซลล์ NK (80pL) และแอนติเจน เปิดใช้งานเซลล์ (100pL) เป็นปิเปตเข้ามาในรอบต่ำสุดหลอดไตรีนมาซึ่ง5ml กับแอนติบอดีทดสอบหรือขนาดกลาง (20pL) สุดท้ายความเข้มข้นของการต่อต้าน LAG-3 แอนติบอดีทดสอบตั้งแต่ 1000 ถึง 0.015ng / มิลลิลิตร กลุ่มตัวอย่าง 25 ถูกบ่มเป็นเวลา 18 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสใน CO2 5% ความชื้นศูนย์บ่มเพาะ หลังจาก 18 ชั่วโมงการทดสอบ ADCC ตัวอย่างวิเคราะห์การปรากฏตัวของแอนติเจน LAG-3 เฉพาะเซลล์บวก T ใช้ไหลภูมิคุ้มกัน สั้น ๆ ตัวอย่างถูกล้างในบัฟเฟอร์มาซึ่งถูกปิดกั้นด้วยฮิวเมน IgG (3PG / หลอด) และบ่มด้วยเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD4, CD8, CD337, CD25 และ LAG-3 flurochrpme คอนจูเกตเอ็ดแอนติบอดีเป็นเวลา 30 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง หลังจากขั้นตอนต่อไปในการล้างพีบีเอส 30 เซลล์ถูกบ่มในการปรากฏตัวของเซลล์ที่ตายแล้วแน่นอนสีเขียวเป็นเวลา 30 นาทีในที่มืดที่ห้องอุณหภูมิ กลุ่มตัวอย่างเป็นที่สุดกับการล้างพีบีเอสคงที่และ Analysed โดยการไหล cytometry ใช้ 60 สองการเข้าซื้อกิจการครั้งที่ไหลอัตรา 1PL ต่อวินาที. ทั้งหมดตัวอย่างข้อมูลที่ได้มาใช้BD FACSCanto ครั้งที่สองที่มีการไหล cytometer Diva มาซึ่งซอฟแวร์เวอร์ชั่น6.1.3 ( BD ชีววิทยาศาสตร์) สด / ตายแน่นอนสีเขียวคราบเซลล์ที่ตายแล้วถูกใช้เป็นเครื่องหมาย 35 ยกเว้นเซลล์ที่ตายแล้วและเหมาะสมไอโซไทป์และ FMO-1 ตัวถูกนำมาใช้ในการกำหนดประชากรเชิงลบ สั้น ๆ เซลล์ที่ตายแล้วถูกตัดออกจากการวิเคราะห์โดยใช้พล็อตไปข้างหน้ากระจาย(FSC-A) กับการเรืองแสงใน FL1 (สีเขียวคราบเซลล์ที่ตายแล้ว) doublets แล้วได้รับการยกเว้นจากการวิเคราะห์โดยใช้พล็อตของFSC-W กับ FSC-H เซลล์เม็ดเลือดขาวทำงานได้เพียงครั้งเดียวเป็น33 ระบุภายหลังรั้วรอบขอบชิดและใช้พล็อตที่กระจายไปข้างหน้า (FSC-A) กับด้านกระจาย (SSC- A) แอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD4 T เซลล์ที่ถูกระบุจากประชาชนในรั้วรอบขอบชิดของเซลล์โดยใช้แปลงของ CD4 ชั้น uorescence กับ SSC-A และเรืองแสงสีม่วงกับสีย้อมเรืองแสง CD4 ตามลำดับ. Antigen เซลล์เฉพาะ CD4 T โดยระบุว่าการลดลงของการเรืองแสงสีย้อมม่วง พล็อตอีก 5 ของการเรืองแสงเรืองแสงกับ CD25 LAG-3 ถูกดึงออกมาเพื่อยืนยันการเปิดใช้งานรัฐนี้ประชากรของเซลล์และที่พวกเขาแสดงความLAG-3 แปลงที่คล้ายกันถูกดึงไประบุแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD8 T เซลล์. เปอร์เซ็นต์ของแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD4 และเซลล์ CD8 T อยู่ในแต่ละตัวอย่าง (เป็นอัตราร้อยละของประชากรเม็ดเลือดขาวทำงานได้) ที่ถูกบันทึกไว้ ลาดตัวแปรเชิงเส้นโค้งพอดี 10 ของข้อมูลเหล่านี้ได้รับการพล็อตและค่า EC50 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟแวร์ปริซึม GraphPad (v5.03). การคำนวณในระดับสูงสุดของการลดปริมาณการปฏิบัติในการทดสอบเป็นที่สูงสุดความเข้มข้นของแอนติบอดีทดสอบที่สูตรต่อไปนี้ถูกนำมาใช้ (1 - (% Antigen เฉพาะ T เซลล์ที่เหลืออยู่หลังการรักษาแอนติบอดี) / (% Antigen เฉพาะ T เซลล์ที่เหลืออยู่ในตัวตนของแอนติบอดี)) * 100. 15 ข้อมูลศักยภาพสำหรับการลดปริมาณของแอนติเจน LAG3 บวกที่เฉพาะเจาะจง และ CD8 CD4 ทีเซลล์โดยH5L7BW และ H5L7 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ระบบการทดสอบในหลอดทดลองรายละเอียดข้างต้น H5L7BW เหนี่ยวนำให้เกิดการลดปริมาณของแอนติเจน LAG3 บวก CD4 และ CD8 เฉพาะ T เซลล์โดย ADCC ในหกเจ็ดบริจาคศึกษาการหายตัวไปของเซลล์ชนิดนั้น ความแรงของ H5L7BW ในเซลล์แอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD4 T เป็นวัดโดย EC50 ค่าตั้งแต่ 14pg / มิลลิลิตรเพื่อ 3.4ng / มิลลิลิตรที่มีระดับสูงสุดที่20 ของการลดปริมาณตั้งแต่ 44-78% ความแรงของแอนติบอดีในแอนติเจน LAG-3 ที่เฉพาะเจาะจงในเชิงบวกเซลล์CD8 T ตั้งแต่ 122pg / มิลลิลิตรเพื่อ 17.5ng / mL มีระดับสูงสุดของการลดปริมาณตั้งแต่39 ไป 87% H5L7 พึ่งระดับต่ำของการลดปริมาณหรือเป็นงานในผู้บริจาคศึกษา. ตัวอย่างที่ 7: การประเมินกิจกรรมที่พึ่งพาของ H5L7BW และ H5L7 ในในร่างกายฮิวเมน25 PBMC / เมาส์ SCID xenograft รุ่นนี้ทดสอบอธิบายการใช้งานของฮิวเมน PBMC / เมาส์ SCID xenograft รูปแบบในการประเมินในร่างกายการลดปริมาณการรับรู้ความสามารถของโมโนโคลนอลอย่างเต็มที่ฮิวเมไนซ์, อะฟิวโคซิเลตเตด LAG-3 พึ่งพาแอนติบอดีH5L7BW ในการเปิดใช้งานฮิ วเมนทีเซลล์ สุขภาพอาสาสมัครเซลล์โลหิตโมโนนิวเคลียร์ (PBMCs) 30 ที่แยกได้ในชั่วข้ามคืนและกระตุ้น (แอนติ -CD3, IL-12) ที่จะทำให้เกิดการแสดงออก LAG-3 ก่อนที่จะฉีดเข้าไปในเยื่อบุช่องท้องของภูมิคุ้มกันที่ถูกบุกรุกหนูSCID LAG-3 พึ่งพาหรือการควบคุมแอนติบอดีทั้งร่วมบริหารงานเข้าไปในเยื่อบุช่องท้องหรือฉีดเข้าเส้นเลือดดำ. การลดปริมาณของ LAG-3 เซลล์บวกได้รับการประเมินโดยการไหลภูมิคุ้มกันในตัวอย่างล้างช่องท้อง 5 หรือ 24 ชั่วโมงหลังจากการฉีดเซลล์. 35 หนูถูกฉีดด้วย huPBMCs เปิดใช้งาน (4 x 2 x 106- 107cells ใน 0.4ml ของพีบีเอส) โดยเส้นทางเข้าช่องท้อง ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับเส้นทางการศึกษาโดยเฉพาะอย่างยิ่ง LAG-3 แอนติบอดีหรือ huIgG1 ควบคุมไบโอว่ามีทั้งทรัพย์สินทางปัญญาร่วมกับยา huPBMCs หรือหนูที่ได้รับการรับการรักษาก่อนฉีดเข้าเส้นเลือดดำ 18h ก่อนที่จะมีการฉีด huPBMC 5 หรือ 24 ชั่วโมงหลังการฉีดเซลล์หนูถูก euthanized เป็นช่องท้อง34 ล้างได้รับการดำเนินการและเนื้อหาที่โทรศัพท์มือถือของบัฟเฟอร์ล้างวิเคราะห์โดย cytometry ไหล สั้น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับการล้างช่องท้อง 3 x 5m1 ล้างของช่องท้องเหมือนเดิมโดยใช้พีบีเอสที่มีความหนาวเย็น 3mm EDTA. ทุกข้อมูลตัวอย่างที่ได้มาใช้ BD FACSCanto ครั้งที่สองที่มีการไหล cytometer มาซึ่ง Diva 5 ซอฟต์แวร์รุ่น 6.1.3 (BD ชีววิทยาศาสตร์) ประมาณ 1 x 106 เซลล์ (ที่เป็นไปได้) ที่ถูกเพิ่มต่อท่อมาซึ่งแขวนลอยเซลล์หมุนเหวี่ยงที่1,500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีและเม็ดจากนั้นอีกครั้งระงับใน3M1 พีบีเอส supernatants ถูกแล้ว decanted อย่างระมัดระวังและเม็ดมือถืออีกครั้งที่ลอยอยู่ในอากาศหนาวเย็นมาซึ่ง100p1 ล้างบัฟเฟอร์ 15p1 FCR ปิดกั้นรีเอเจนถูกบันทึกแล้วต่อท่อและเซลล์บ่มเป็นเวลา10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง 5p1 ของแต่ละแอนติบอดีย้อมสี (10p1 10 1: 100 ก่อนปรับลดแอนติ -LAG-3 ปิดกั้น / การตรวจสอบแอนติบอดี 17B4-PE) หรือไอโซไทป์การควบคุมจากนั้นก็เพิ่มตามลำดับและบ่มเป็นเวลา20 นาทีที่อุณหภูมิห้องป้องกันจาก แสง เซลล์ถูกล้างภายหลังจากการเพิ่มขึ้นของ 4 มลบัฟเฟอร์มาซึ่งต่อท่อและหมุนเหวี่ยงที่ 1,500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีหลังจากที่ใสถูก decanted อย่างระมัดระวัง ขั้นตอนการซักผ้านี้ได้ซ้ำแล้วซ้ำอีก ในที่สุดเซลล์ที่ถูกระงับอีกครั้งในบัฟเฟอร์มาซึ่ง 300p1 และวิเคราะห์โดย cytometry ไหล 15 นอกจาก LAG-3 โดยการตรวจสอบการใช้งานของแอนติบอดี้ที่มีข้อความ fluorescently LAG-3 ปิดกั้น 17B4-PE, เซลล์ T ต่อไปและยืนยันการใช้งานเครื่องหมายถูกนำมาใช้สำหรับเซลล์ phenotyping T: CD45, CD4, CD8 และCD25 ร้อยละของ CD4 และ CD8 เซลล์ .T ถูกแสดงเป็นร้อยละของเซลล์ CD45 บวก. LAG-3 ประชากรเซลล์ T บวกแสดงเป็นร้อยละของประชากรผู้ปกครอง CD4 และ CD8. 20 มาซึ่งซอฟต์แวร์รุ่น Diva 6.1.3 ถูกใช้ในการสร้างชุดการวิเคราะห์ ของเซลล์แต่ละเซลล์นับ/ กิจกรรมและเซลล์เปอร์เซ็นต์ของประชากร วิเคราะห์ข้อมูลกับรุ่น SAS 9.2.2 ซอฟแวร์โดยใช้แบบจำลองเชิงเส้นทั่วไปข้อมูลทวินาม การวิเคราะห์นี้รุ่นโดยตรงจำนวนเซลล์ในขณะที่สัดส่วนของประชากรผู้ปกครอง ด้วยวิธีนี้ขนาดของประชากรที่ผู้ปกครองจะนำเข้าบัญชีในช่วงการวิเคราะห์ หมายถึงการได้รับการคำนวณสัดส่วนของชนิดเซลล์เป้าหมายสำหรับแต่ละ 25 รักษาพร้อมกับช่วงความเชื่อมั่น 95% เหล่านี้ถูกแสดงเป็นร้อยละ. การเปรียบเทียบตามแผนของการรักษาเมื่อเทียบกับการควบคุมที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้อัตราส่วนราคาต่อรอง นี้เป็นการแสดงออกถึงอัตราต่อรองของการมีเซลล์ชนิดหนึ่งในเป้าหมายของการรักษาเป็นอัตราส่วนราคาต่อรองของการมีที่ชนิดเซลล์เป้าหมายเกี่ยวกับการรักษาควบคุม อัตราส่วนราคาต่อรอง <1 จะบ่งชี้ถึงอัตราต่อรองลดลงของการมีเซลล์ชนิดในการรักษาที่น่าสนใจเมื่อเทียบกับการควบคุม อัตราส่วนราคาต่อรอง <1 จะแสดงให้เห็น 30 อัตราต่อรองลดลงของการมีเซลล์ชนิดในการรักษาที่น่าสนใจเมื่อเทียบกับการควบคุม. การทดลองทั้งหมดถูกดำเนินการโดยใช้ PBMCs จากบุคคลผู้บริจาคโลหิตที่มีสุขภาพดีและเนื่องจากการปริมาณเลือดขนาดใหญ่ที่จำเป็นต่อการทดลองไม่มีผู้บริจาคถูกนำมาใช้มากกว่าหนึ่งครั้ง LAG 3 ระดับการแสดงออกหลังจากการกระตุ้นในชั่วข้ามคืนที่แตกต่างกันอย่างมากระหว่างผู้บริจาค (ตั้งแต่ 2-73% การแสดงออกของเซลล์ผิว) แต่เหล่า

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวอย่างที่ 6 : การประเมิน depleting และกิจกรรมของ h5l7bw h5l7 โดยแอนติบอดีต่อเซลล์ (
( adcc ) ในหลักฮิวเมนเซลล์ T



ให้ใช้ในการทดลองเหล่านี้คัดกรองจะเรียกการตอบสนองต่อแอนติเจน CD4
ปัจจุบันใน revaxis ( คอตีบ บาดทะยัก และโปลิโอ ) และทั้ง cmvpp65 เปปไทด์
Pool หรือไปสำหรับเปปไทด์สระซึ่งประกอบด้วยเปปไทด์เอพิโทป S ซีเ มวีอีบีวี , และไข้หวัดใหญ่ .
แอนติเจนที่ใช้ศึกษาเริ่มต้นเป็น cmvpp65 เปปไทด์สระ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากการจำกัดที่ 5 จำนวนผู้บริจาคที่แสดง จะเรียกการตอบสนองแอนติเจนนี้ revaxis และ CD8 เปปไทด์
พูลเป็นแอนติเจนที่ใช้ในการสร้างส่วนใหญ่ของศักยภาพข้อมูลสำหรับแอนติ lag3

- แอนติบอดีกระแสเลือด รวบรวมข้อมูลจากอาสาสมัครสุขภาพดีฮิวเมนในวันที่ 0 ( รอบ ) และวันที่ 5
( 75ml ) การทดลองใช้เตรียมเซลล์ปกติ ficollplaque ความหนาแน่น
10 การปั่นเหวี่ยง ที่เตรียมนำไปตรวจในวันที่ 0 คือ ข้อความที่ใช้ celltrace สีม่วง
proliferation เซลล์ชุด ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจากที่พวกเขาล้าง
เมล็ดใน 24 ดีแบน bottomed แผ่นเนื้อเยื่อที่ความหนาแน่นของ 2x106 / ml ในระดับปานกลางและ
กระตุ้นด้วยแอนติเจน ( revaxis และเปปไทด์ที่ใช้สำหรับสระว่ายน้ำที่เจือจาง 1 ใน 1000 ;
cmvpp65 เปปไทด์ถูกใช้ที่เจือจาง 1 ใน 100 ) ที่นำไปตรวจถูกบ่มเป็นเวลา 5 วัน ที่อุณหภูมิ 37 องศา C
15 ใน 5% CO2 humidified
ตู้ฟักไข่ผู้บริจาคของ ? NK cells มีความบริสุทธิ์จาก PBMCs ไว้ 5 วันของการทดลอง โดยเลือกใช้ชนิดติดตั้งอิสระ
ลบจาก Invitrogen หรือ miltenyi ชีวภาพตามคำแนะนำเฉพาะของแต่ละผู้ผลิต และ NK cells นับและเพื่อลดความหนาแน่นของ 1.3x106/ml ปานกลาง .
20 เซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วยแอนติเจนสำหรับ 5 วันล้างนับและ
เพื่อลดความหนาแน่นของ 2x106 / วางเซลล์ / มล. ในกลาง .
ของผู้บริจาค NK เซลล์ ( 80pl ) และแอนติเจนกระตุ้นเซลล์ ( 100pl ) pipetted เข้าสู่รอบสุด facs หลอด 5ml
พอลิสไตรีนกับการทดสอบแอนติบอดีหรือขนาดกลาง ( 20pl ) ความเข้มข้นสุดท้าย
ของ anti lag-3 แอนติบอดีการทดสอบระหว่าง 1000 ถึง 0.015ng/ml .ตัวอย่าง 25 ถูกบ่มที่ 37 ° C 18 H ใน 5% CO2 humidified ตู้ฟักไข่ หลังจาก 18 H (
adcc วิเคราะห์สำหรับการปรากฏตัวของแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง lag-3 บวก T เซลล์ โดยใช้เซลล์ไหล

สั้น , ตัวอย่าง facs ล้างบัฟเฟอร์ บล็อกฮิวเมน IgG ( 3pg / หลอด )
บ่มด้วยเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD4 , CD8 cd337 , ,และ cd25 lag-3 flurochrpme คอนจูเกตเอ็ด
แอนติบอดีสำหรับ 30 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง หลังจากที่อีกซักก้าวใน PBS 30 เซลล์ถูกบ่มในการแสดงตนของซ่อมได้สีเขียวเซลล์ที่ตายเป็นเวลา 30 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง

ตัวอย่างสุดท้ายล้างด้วย pbs , คงที่และวิเคราะห์การไหล (
โดยใช้ 60 วินาที ซึ่งเวลาที่อัตราการ ไหลของ 1pl ต่อวินาที .
ข้อมูลตัวอย่างทั้งหมดได้มาใช้ BD facscanto II การใช้โมโนกับ facs Diva
ซอฟแวร์รุ่น 6.1.3 ( BD BIOSCIENCES ) คอนเสิร์ต / ตายแน่นอน เขียวคราบเซลล์ที่ตายถูกใช้เป็นเครื่องหมาย และไอโซไทป์ 35 เซลล์ที่ตายออกที่เหมาะสมและการควบคุม fmo-1 ถูกใช้เพื่อกำหนด
ประชากรติดลบเซลล์ตายตัดสั้น ๆจากการวิเคราะห์โดยใช้พล็อตไปข้างหน้า
กระจาย ( fsc-a ) กับการเรืองแสงใน fl1 ( เขียวคราบเซลล์ที่ตาย ) คู่นั้นแยกออก
จากการวิเคราะห์โดยใช้แปลง fsc-w กับสายเดี่ยว fsc-h. เม็ดเลือดขาวมี 33






ระบุในภายหลังและรั้วที่ใช้พล็อตไปข้างหน้ากระจาย ( fsc-a ) กับด้านกระจาย ( SSC -
)แอนติเจนเฉพาะเซลล์ที CD4 ถูกระบุจาก gated ประชากรเซลล์โดยใช้แปลง CD4
FL uorescence กับ ssc-a และสีม่วงเรืองแสงสีเรืองแสงกับ CD4 ตามลำดับ
t แอนติเจนเฉพาะ CD4 cells ที่ระบุโดยลดการย้อมสีม่วงอีกแปลงที่ 5 ของการ cd25 กับ lag-3 เรืองแสงวาดเพื่อยืนยันการเปิดใช้งานของรัฐนี้
ประชากรของเซลล์และพวกเขาแสดง lag-3 . แปลงที่คล้ายกันวาดเพื่อระบุเฉพาะ CD8 T เซลล์แอนติเจน
.
ค่า CD4 CD8 T เซลล์แอนติเจนที่เฉพาะเจาะจงและปัจจุบันในแต่ละตัวอย่าง ( เป็น
เปอร์เซ็นต์ของประชากร lymphocyte ได้ ) ถูกบันทึกไว้เชิงเส้นตัวแปรทางลาดโค้งพอดี 10 ข้อมูลเหล่านี้ถูกวางแผน ec50 และค่าถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ปริซึม graphpad ( v5.03 )
คำนวณระดับสูงสุดของการลดปริมาณสังเกตใน assay ที่ความเข้มข้นสูงสุด
แอนติบอดีทดสอบ สูตรต่อไปนี้ที่ถูกใช้ :( 1 - ( % เฉพาะ antigen แอนติบอดี T เซลล์ที่เหลือหลังการรักษา ) / ( % เฉพาะ antigen T เซลล์ที่เหลืออยู่ในการขาดของแอนติบอดี ) ) * 100 .
15 ข้อมูลศักยภาพสำหรับการลดปริมาณของ lag3 บวกแอนติเจนเฉพาะ CD8 ด้วย
h5l7bw h5l7 เซลล์ที CD4 ถูกสร้างขึ้นและใช้ในการการทดสอบของระบบข้างต้น .h5l7bw ชักนำการลดปริมาณของ lag3 บวกแอนติเจนเฉพาะ CD4 CD8 T และเซลล์ adcc ในหกเจ็ดของผู้บริจาคเพื่อการหายตัวไปของชนิดของเซลล์นั้นๆ ความแรงของ h5l7bw ในแอนติเจนเฉพาะ CD4 เซลล์ T , quantified โดย ec50 ค่า ตั้งแต่ 14pg / ml เพื่อ 3.4ng/ml มีระดับสูงสุด
20 การลดปริมาณตั้งแต่ 44 78 %ความแรงของแอนติบอดีนี้ในแอนติเจนเฉพาะ lag-3 บวก
T เซลล์ CD8 มีค่า 122pg / ml เพื่อ 17.5ng/ml มีระดับสูงสุดของการลดปริมาณตั้งแต่
39 ร้อยละ 87 h5l7 ) ในระดับต่ำการลดปริมาณ หรือถูกใช้งานในผู้บริจาคเรียน


ตัวอย่างที่ 7 : การประเมิน depleting และกิจกรรมของ h5l7bw h5l7 ในปี 2544 ฮิวเมน