MATERIALS AND METHODSFish. Pearl go

MATERIALS AND METHODS
Fish. Pearl gourami Trichogaster leeri (mean body mass 4.0 ± 1.0 g) and rock bream Oplegnathus fascia- tus (6.0 ± 1.0 g) were obtained from an ornamental fish shop and a marine fish farm, respectively, in Korea. The fish were kept in 40 l tanks filled with freshwater or seawater at 25°C; the water was changed 3 times per day. After 3 wk, we removed spleens from 10 fish of both species and confirmed that they were free of iridovirus by 2-step PCR using the SP1F/SP1R and SP2F/SP2R primer sets (Table 1) as described below. Virus preparation. PGIV-SP was obtained from pearl gourami (4.0 ± 1.0 g) showing signs of mass mor- tality 14 d after arriving in Korea from Singapore in 2005. Histopathological analyses revealed enlarged cells in the spleen, and PCR amplification of the ORF (Open Reading Frame)-1 gene using the SP1F/SP1R primer set (Table 1) was used to diagnose all cases of iridovirus infection. Infection of rock bream (100 ± 10 g) with IVS-1 was determined as previously described (Jeong et al. 2006b). Homogenates were prepared from the spleens of pearl gourami and rock bream experimentally infected by intraperitoneal (IP) injection with PGIV-SP and IVS-1, respectively. Briefly, splenic tissue was removed from 10 fish at the moribund stage and ground in 20 volumes of phos- phate-buffered saline (PBS) (0.1 M [pH 7.2]) in a tube with a fitted pestle (Sigma-Aldrich) and then cen- trifuged at 300 × g for 5 min. The supernatant was then filtered through a membrane (0.45 µm pore size) to create 50 µl aliquots, which were stored at –80°C until use. PCR. Total genomic DNA was extracted from the spleens of infected fish using an AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer) and dissolved in distilled water (100 µg ml–1). Single-step PCR was carried out in a 50 µl reaction mixture containing 0.5 µl of genomic DNA, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.001% w/v gelatin, 0.5% Tween-20, 200 µM each dNTP, 1 µM each single-step PCR primer (Table 1), and 1.25 U of AmpliTaq DNA Polymerase (PE Applied Biosystems) using a Perkin-Elmer 2400 thermal cycler. After 2 min of predenaturation at 95°C, the mixtures were incubated for 30 cycles at 95°C for

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการปลา ปลากระดี่มุก Trichogaster leeri (หมายถึงร่างกายมวล 4.0 ± 1.0 g) และหินทรายแดง Oplegnathus รับทั้งการบำบัด-tus (6.0 ± 1.0 g) ได้รับจากร้านขายปลาฟาร์มปลาทะเล ตามลำดับ ในเกาหลี ปลาที่ถูกเก็บไว้ในถัง 40 l ที่เต็มไปด้วยน้ำจืด หรือน้ำทะเลที่ 25° C น้ำมีการเปลี่ยนแปลง 3 ครั้งต่อวัน หลังจาก 3 wk เราเอา spleens จากปลา 10 ทั้งสองพันธุ์ และยืนยันว่า พวกเขาฟรี iridovirus โดย PCR 2 ขั้นตอนโดยใช้ SP1F/SP1R และรองพื้น SP2F/SP2R ชุด (ตาราง 1) ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง การเตรียมไวรัส PGIV SP ได้รับจากปลากระดี่มุก (4.0 ± 1.0 g) แสดงสัญญาณของมวล mor-tality 14 d หลังจากมาถึงเกาหลีจากสิงคโปร์ในปี 2005 Histopathological วิเคราะห์เปิดเผยขยายเซลล์ในม้าม และขยาย PCR ของ ORF (เปิดอ่านเฟรม) ยีน-1 โดยใช้การตั้งพื้น SP1F/SP1R (ตารางที่ 1) ใช้ในการวินิจฉัยกรณีทั้งหมดติดเชื้อ iridovirus ติดหินทรายแดง (100 ± 10 กรัม) กับ IVS ที่ถูกกำหนดเป็นการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (จอง et al. 2006b) Homogenates ถูกเตรียมจาก spleens ของปลากระดี่มุกและหินทรายแดง experimentally เชื้อ intraperitoneal (IP) ฉีด PGIV SP และ IVS-1 ตามลำดับ สั้น ๆ เนื้อเยื่อ splenic ถูกลบออกจาก 10 ปลาที่ moribund stage และพื้นดินในปริมาณ 20 phos-phate-buffered น้ำเกลือ (PBS) (0.1 M [pH 7.2]) ในหลอดกับ pestle ผ่อน (ซิก-Aldrich) แล้ว cen-trifuged ที่ 300 × g สำหรับ 5 นาที แล้วถูกกรอง supernatant ที่ผ่านมีเยื่อ (0.45 µm รูขุมขนขนาด) สร้าง 50 µl aliquots ซึ่งถูกเก็บไว้ที่ –80 ° C จนกว่าจะใช้ PCR รวม genomic DNA ที่สกัดจาก spleens ของปลาที่ติดเชื้อโดยใช้การ AccuPrep Genomic DNA แยกชุด (Bioneer) และละลายในน้ำกลั่น (100 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง ml – 1) PCR ขั้นตอนเดียวที่ดำเนินการในส่วนผสมปฏิกิริยา 50 µl ประกอบด้วย 0.5 µl ของ genomic DNA, 10 มม. (ค่า pH 8.3), ตรี-HCl 50 mM KCl, MgCl2, 0.001% w/v ตุ๋น 1.5 มม. 0.5% Tween-20, 200 µM dNTP พื้น PCR ขั้นตอนเดียว 1 µM (ตารางที่ 1), และ 1.25 U ของ AmpliTaq ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (PE ใช้ Biosystems) ใช้ cycler ร้อนที่เอลเมอเพอร์ 2400 หลังจากนาทีที่ 2 ของ predenaturation ที่ 95° C น้ำยาผสมถูก incubated สำหรับวงจร 30 ที่ 95° C สำหรับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ
ปลา สายรัดข้อมือ 1 leeri ( หมายถึงร่างกายมวล 4.0 ± 1.0 กรัม ) และหินแดง oplegnathus พังผืด - ทัส ( 6.0 ± 1.0 กรัม ) ที่ได้รับจากร้านปลาสวยงามและสัตว์น้ำ ฟาร์ม ตามลำดับ ในเกาหลี ปลาที่ถูกเก็บไว้ในถัง 40 ลิตร เติมน้ำจืดหรือน้ำทะเลที่ 25 ° C ; น้ำเปลี่ยน 3 ครั้งต่อวัน 3 สัปดาห์หลัง ,เราเอาม้ามจาก 10 ปลาทั้งสองชนิด และยืนยันว่า พวกเขาถูกฟรีของอิริโดไวรัสด้วยวิธี PCR 2 ขั้นตอนและใช้ sp1f / sp1r sp2f / sp2r ชุดไพรเมอร์ ( ตารางที่ 1 ) ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง การเตรียมไวรัส pgiv-sp ได้จากสายรัดข้อมือ ( 4.0 ± 1.0 กรัม ) แสดงสัญญาณของมวลมอร์ - tality 14 D หลังจากมาถึงในเกาหลี จากสิงคโปร์ ในปี 2005การวิเคราะห์การศึกษาพบการขยายเซลล์ในม้าม และวิธี PCR ( ของ ORF ( กรอบเปิดอ่าน ) - 1 ยีนโดยใช้ sp1f / sp1r primer ชุด ( โต๊ะ 1 ) คือใช้ในการวินิจฉัยกรณีของการติดเชื้ออิริโดไวรัส . การติดเชื้อของหินแดง ( 100 ± 10 กรัม ) กับ ivs-1 ตั้งใจตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( จอง et al . 2006b )homogenates เตรียมจากม้ามของปลากระดี่มุกและหินแดงนี้ติดเชื้อในลำไส้ ( IP ) และฉีดด้วย pgiv-sp ivs-1 ตามลำดับ สั้นเนื้อเยื่อม้ามถูกลบออกจาก 10 ปลาในขั้นตอนที่ย่ำแย่และพื้นดินใน 20 เล่มของ phos - เฟตในน้ำเกลือ ( PBS ) ( 0.1 M [ pH 72 ) ในหลอดด้วยเข็มขัดสาก ( ซิกม่า Aldrich ) และศูนย์ trifuged 300 × G สำหรับ 5 นาทีแล้วนำกรองผ่านเยื่อ ( 0.45 µ M ขนาดรูพรุน ) สร้าง 50 µผมเฉยๆ ซึ่งเก็บรักษาที่อุณหภูมิ– 80 องศา C จนใช้ PCRรวมจีโนมดีเอ็นเอจากม้ามของปลาที่ติดเชื้อโดยใช้การสกัดดีเอ็นเอ accuprep Kit ( bioneer ) และละลายในน้ำกลั่น 100 มิลลิลิตรµกรัม ( 1 ) ซึ่งได้ดำเนินการในขั้นตอนเดียว 50 µ L ปฏิกิริยาผสมที่มี 0.5 µ L ของ genomic DNA HCL 10 มม. , บริษัท ( pH 8.3 ) . 50 มม. 1.5 มม. ชุด 0.001 % W / V เจลาติน , 0.5% tween-20 200 เมตรแต่ละ dntp µ ,