Molecular detection of haemosporidi

Molecular detection of haemosporidian parasites

Parasites were detected via replicated applications of a nested polymerase chain reaction (PCR) method based on Hellgren et al. [50] and Waldenström et al. [51]. Genomic DNA was extracted from whole blood stored on Whatman FTA Classic Cards using Qiagen Blood and Tissue Mini kits, following the protocol for dried blood spots (Qiagen, Valencia, CA). Parasitemia, or the quantity of parasites circulating in an individual host, can vary highly between patent and chronic stages of infection. Haemosporidian infections in birds can persist in a chronic stage for years [52], and therefore the starting quantity of parasite DNA in blood samples may be low, leading to a high occurrence of false negatives [53, 54]. We applied PCR protocols multiple times to all individual samples, which had the effect of increasing probability of detecting low-level infections that were not found in all of the multiple repeated tests. To our knowledge, our application of triplicate screens is a novel approach for improving detection of haemosporidian parasites from blood samples. For detection of Plasmodium and Haemoproteus, PCR screens targeting the mitochondrial cytochrome b gene (cyt b) were conducted three times from the extracted DNA using identical conditions, and for detection of Leucocytozoon, PCR screens targeting cyt b were conducted using each of two sets of Leucocytozoon-specific primers a single time (S1 Table). Negative controls were included in all PCR runs to control for false positives due to the high sensitivity of nested PCR (sensu Hellgren et al. [55]). PCR products identified as positive for haemosporidian infection were prepared for direct sequencing by enzymatic ExoSAP-IT (Affymetrix) or gelase b-agarose gel-digesting purification (Epicentre Technologies, Madison, Wisconsin). Purified PCR products were sequenced using ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits with AmpliTaq DNA Polymerase FS (Perkin-Elmer) and run on an ABI 3730 Automated DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, California) using both the forward and reverse primers HAEMF and HAEMR2 for Plasmodium and Haemoproteus, and either HAEMFL and HAEMR2L [50] or L545F and L825R (this study; S1 Table) for Leucocytozoon. Sequence data were edited using Sequencher v.5.0.1 (GeneCodes, Ann Arbor, Michigan) and Geneious v.6.1.6 (Biomatters).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การตรวจจับโมเลกุลของปรสิต haemosporidian ปรสิตที่ตรวจพบการใช้งานผ่านการจำลองแบบของปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ที่ซ้อนกัน (PCR) วิธีการขึ้นอยู่กับ Hellgren et al, [50] และWaldenström et al, [51] ดีเอ็นเอถูกสกัดจากเลือดที่เก็บไว้ในเบอร์เอฟทีเอคลาสสิกโดยใช้บัตร Qiagen เลือดและเนื้อเยื่อชุดมินิตามโปรโตคอลสำหรับจุดเลือดแห้ง (Qiagen, วาเลนเซีย, CA) parasitemia หรือปริมาณของปรสิตหมุนเวียนในพื้นที่ของแต่ละบุคคลที่สามารถแตกต่างกันอย่างมากระหว่างการจดสิทธิบัตรและขั้นตอนของการติดเชื้อเรื้อรัง การติดเชื้อในนก Haemosporidian สามารถคงอยู่ในขั้นตอนที่เรื้อรังมานานหลายปี [52] และดังนั้นปริมาณเริ่มต้นของดีเอ็นเอของปรสิตในตัวอย่างเลือดอาจจะต่ำนำไปสู่การเกิดสูงของเชิงลบเท็จ [53, 54] เราใช้วิธี PCR โปรโตคอลหลายครั้งตัวอย่างของแต่ละบุคคลทั้งหมดซึ่งมีผลในการเพิ่มความน่าจะเป็นของการตรวจสอบการติดเชื้อในระดับต่ำที่ไม่พบในทุกการทดสอบซ้ำแล้วซ้ำอีกหลาย ๆ ความรู้ของเราโปรแกรมของเราเพิ่มขึ้นสามเท่าของหน้าจอเป็นแนวทางใหม่สำหรับการปรับปรุงการตรวจสอบของปรสิต haemosporidian จากตัวอย่างเลือด ในการตรวจหาเชื้อและ Haemoproteus หน้าจอ PCR กำหนดเป้าหมาย cytochrome ยลขยีน (CYT ข) ได้ดำเนินการสามครั้งจากดีเอ็นเอที่สกัดโดยใช้เงื่อนไขที่เหมือนกันและการตรวจสอบของ Leucocytozoon หน้าจอ PCR กำหนดเป้าหมาย CYT ขได้ดำเนินการใช้แต่ละสองชุด ไพรเมอร์ Leucocytozoon เฉพาะเวลาเดียว (S1 ตาราง) การควบคุมเชิงลบรวมอยู่ใน PCR ทั้งหมดไปยังควบคุมบวกเท็จเนื่องจากการที่มีความไวสูงของ PCR ที่ซ้อนกัน (sensu Hellgren et al. [55]) ผลิตภัณฑ์ PCR ระบุเป็นบวกเชื้อ haemosporidian กำลังเตรียมพร้อมสำหรับการจัดลำดับโดยตรงโดยเอนไซม์ ExoSAP-IT (Affymetrix) หรือ gelase เจลฟอกย่อย B-agarose (ศูนย์กลางเทคโนโลยีเมดิสันวิสคอนซิน) ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์มีลำดับขั้นตอนการใช้ ABI ปริซึม Terminator ย้อมวงจรลำดับพร้อมชุดปฏิกิริยากับ AmpliTaq DNA Polymerase FS (เพอร์กินเอลเมอ) และทำงานบน ABI 3730 อัตโนมัติดีเอ็นเอซีเควน (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) ใช้ทั้งข้างหน้าและไพรเมอร์กลับ HAEMF และ HAEMR2 สำหรับ Plasmodium และ Haemoproteus และทั้ง HAEMFL และ HAEMR2L [50] หรือ L545F และ L825R (การศึกษานี้ S1 ตาราง) สำหรับ Leucocytozoon ข้อมูลลำดับถูกแก้ไขโดยใช้ SEQUENCHER v.5.0.1 (GeneCodes, Ann Arbor, มิชิแกน) และ Geneious v.6.1.6 (Biomatters)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การตรวจจับโมเลกุลของ haemosporidian ปรสิต

ปรสิตถูกตรวจพบผ่านการใช้งานของซ้อนกันแบบปฏิกิริยาลูกโซ่ ) ตาม hellgren et al . [ 50 ] และ waldenstr ö m et al . [ 51 ] สกัดดีเอ็นเอจากเลือดทั้งหมดเก็บไว้ใน whatman FTA คลาสสิกบัตรที่ใช้เพิ่มเลือดและเนื้อเยื่อขนาดเล็กชุด , ดังต่อไปนี้โปรโตคอลสำหรับจุดเลือดแห้ง ( เพิ่ม , Valencia , CA )เชื้อ หรือปริมาณของปรสิตที่หมุนเวียนในการเป็นเจ้าภาพของแต่ละสามารถแตกต่างกันอย่างมากระหว่างสิทธิบัตรและเรื้อรังระยะของการติดเชื้อ เชื้อ haemosporidian ในนกสามารถคงอยู่ในขั้นเรื้อรังมานานหลายปี [ 52 ] , และดังนั้นจึงเริ่มต้นปริมาณปรสิตในเลือดต่ำดีเอ็นเออาจจะนำไปสู่การเกิดสูงเชิงลบเท็จ [ 53 , 54 )เราใช้วิธี PCR โปรโตคอลหลายครั้ง ตัวอย่างบุคคลทั้งหมด ซึ่งผลของการตรวจหาระดับความน่าจะเป็นของการติดเชื้อที่พบทั้งหมดของหลายๆวัด ความรู้ของเรา โปรแกรมของเราหน้าจอทำสำเนาสามฉบับคือแนวคิดใหม่ในการปรับปรุงการตรวจหาปรสิต haemosporidian จากตัวอย่างเลือดการตรวจหาและการ haemoproteus PCR หน้าจอเล็งตัด - B ยีน ( cyt B ) จำนวน 3 ครั้งจากการสกัดดีเอ็นเอโดยใช้เงื่อนไขที่เหมือนกัน และตรวจหาได้ทํา , PCR หน้าจอเป้าหมาย cyt B การใช้แต่ละสองชุดไพรเมอร์ได้ทําเฉพาะครั้งแรก ( ตาราง S1 )ลบทั้งหมดโดยรวมอยู่ในการควบคุมจะควบคุมบวกเท็จ เนื่องจากความไวสูงด้วย PCR ( เซ็นสุ hellgren et al . [ 55 ] ) โดยผลิตภัณฑ์ระบุเป็นบวกสำหรับการติดเชื้อ haemosporidian เตรียมสำหรับการติดตามโดยตรงโดยใช้เอนไซม์ exosap ( affymetrix ) หรือ gelase b-agarose เจลฟอกย่อย ( ศูนย์กลางเทคโนโลยี เมดิสัน วิสคอนซิน )ลำดับการใช้ผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์จาก ABI ปริซึมย้อม Terminator รอบลำดับชุดปฏิกิริยาพร้อมกับ amplitaq DNA polymerase FS ( เพอร์กินเอลเมอร์ ) และเรียกใช้ในลำดับ DNA ABI 940 อัตโนมัติ ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย ) โดยใช้ทั้งไปข้างหน้าและย้อนกลับ haemf ชนิดสำหรับการ haemoproteus haemr2 และ ,และทั้ง haemfl haemr2l [ 50 ] และหรือ l545f l825r ( และการศึกษา ; ตาราง S1 ) ได้ทํา . ลำดับข้อมูลถูกแก้ไข โดยใช้ sequencher v.5.0.1 ( genecodes Ann Arbor มิชิแกน ) และ geneious v.6.1.6 ( biomatters )