compared to full-length peptide (Fi

compared to full-length peptide (Fig. 2, compare lane 16 with
18e19). Furthermore, the overall activity compared to the SplBCON
and SplB-COM was significantly enhanced (compare lanes
18e19 and 20e21).
We next applied the principle to TEV protease, one of the most
ubiquitous enzymes used to remove affinity tags that optimally
cleaves the consensus sequence ENLYFQYS [13,14].We constructed
a fusion substrate wherein this sequence was truncated to ENLYFQ,
and placed between the ePDZ-b and OFP components. TEV is able to
cleave when serine at P1’ position is replaced by methionine with
marginal loss of activity [15]. However, steric constraints due to the
tightly folded N-terminal region of OFP could impact negatively on
cleavage. The results show clearly improved cleavage when TEV is
fused to the optimised 4-amino acid truncated ARVCF peptide
(TEV-AP4) (Fig. 3A). Notable cleavage was observed after only
30 min incubation with majority of substrate beng cleaved after
2.5 h. In comparison, TEV protease only showed significant cleavage
after 24 h incubation. Note that both the TEV-AP4 and TEV proteins
used comprise the S219A mutation introduced to reduce autolysis
[8]. A control experiment using a fusion substrate comprising the
full TEV consensus sequence (ENLYFQS) led to equivalent cleavage
by both wild-type TEV and TEV-AP4 (Fig. 3B). The endogenous TEV
protease (minus the S219V mutation) showed even poorer cleavage
when compared to TEV-AP4 for the same substrate (Fig. S1). We
next assayed TEV-AP4 on a fusion substrate where OFP was
replaced with the fibronectin 10Fn3 domain (ePDZ-b-ENLYFQY-
10Fn3). As before, significantly enhanced cleavage was obtained in
very short times when using TEV-AP4 compared to TEV (Fig. 4A).
Given the highly compact 10Fn3 fold [16], it is likely that steric
constraints inhibit cleavage by TEV. Introduction of GGS or GGSGGS
linkers (to yield ePDZ-b-ENLYFQYMGGS-10Fn3 and ePDZ-b-
ENLYFQYMGGSGGS-10Fn3 respectively) resulted in improved
cleavage by TEV, yet this was still considerably less than for TEVAP4
(Fig. 4B,C). As before, endogenous TEV also performed poorly
using this substrate set (Fig. S2).
We next explored whether the enforced-proximity concept was
applicable to conventional on-column cleavage and purification
protocols using histidine tagged proteins. Complete immobilisation
of protease via its histidine tag could reduce turnover during oncolumn
cleavage of a co-immobilised substrate, necessitating use
of increased amounts for efficient cleavage. Addition of 30 mM
imidazole alleviated this constraint, resulting in improved cleavage
efficiencies using histidine tagged ePDZ-b -WELQ-OFP and SplB-AP
proteins (Fig. S3). These conditions were used for the on-column

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เมื่อเทียบกับเปปไทด์แบบเต็มตัว (รูป 2 เปรียบเทียบเลน 16 ด้วย18e19) . นอกจากนี้ กิจกรรมโดยรวมเมื่อเทียบกับ SplBCONและ SplB COM ถูกพัฒนาขึ้นอย่างมาก (เทียบกับเลน18e19 และ 20e21)เราใช้หลักการให้น้ำย่อย TEV หนึ่งในสุดเอนไซม์ที่ใช้ในการลบความสัมพันธ์แพร่หลายแท็กที่เหมาะสมที่สุดพลังฉันทามติลำดับ ENLYFQYS [13,14] เราสร้างกับพื้นผิวของฟิวชั่นนั้นลำดับนี้ถูกตัดทอนไป ENLYFQและอยู่ระหว่าง ePDZ-b และคอมโพเนนต์ OFP TEV จะสามารถกระจายเมื่อรอบเส้นใยประสาทที่ P1' ตำแหน่งถูกแทนที่ ด้วยเมไทโอนีนด้วยขาดทุนกำไรของกิจกรรม [15] อย่างไรก็ตาม steric ข้อจำกัดเนื่องจากการN-เทอร์มินัลพับแน่นแคว้น OFP ส่งผลกระทบต่อในทางลบความแตกแยก ผลลัพธ์แสดงความแตกแยกชัดเจนขึ้นเมื่อ TEVหลอมรวมกับการปรับ 4-อะมิโนกรดตัด ARVCF เปปไทด์(TEV AP4) (รูปที่ 3A) พบว่า หลังจากที่โดดเด่นความแตกแยกเท่านั้นกกไข่ประมาณ 30 นาที ด้วยส่วนใหญ่ของพื้นผิวเบ็งแหวกหลัง2.5 h ในการเปรียบเทียบ โปรติเอส TEV เท่าแสดงให้เห็นว่าความแตกแยกที่สำคัญหลังจากบ่ม 24 ชม หมายเหตุที่โปรตีนทั้ง TEV AP4 และ TEVใช้ประกอบ S219A กลายพันธุ์นำไปลด autolysis[8] ทดลองควบคุมที่ใช้พื้นผิวฟิวชั่นประกอบด้วยการลำดับฉันทามติ TEV เต็ม (ENLYFQS) นำไปสู่ความแตกแยกที่เทียบเท่าทั้งป่าชนิด TEV และ TEV AP4 (รูปที่ 3B) TEV ภายนอกโปรติเอส (ลบกลายพันธุ์ S219V) แสดงให้เห็นความแตกแยกย่อมได้เมื่อเทียบกับ TEV AP4 สำหรับพื้นผิว (รูปเดียวกัน S1) เราถัดไป assayed TEV-AP4 บนพื้นผิวฟิวชั่น OFP อยู่ที่ไหนแทน ด้วยโดเมน 10Fn3 fibronectin (ePDZ-b - ENLYFQY -10Fn3) เป็นมาก่อน ความแตกแยกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเวลาสั้นมากเมื่อใช้ TEV AP4 เทียบกับ TEV (รูปที่ 4A)รับพับขนาดกะทัดรัดสูง 10Fn3 [16], มีแนวโน้มที่ stericข้อจำกัดยับยั้งความแตกแยก โดย TEV แนะนำของ GGS หรือ GGSGGSลิงก์ (ให้ผล ePDZ b ENLYFQYMGGS 10Fn3 และ ePDZ - b-ENLYFQYMGGSGGS-10Fn3 ตามลำดับ) ส่งผลให้ดีขึ้นความแตกแยก โดย TEV ยังนี้ก็มากน้อยกว่า สำหรับ TEVAP4(รูป 4B, C) เป็นก่อน TEV ภายนอกยังทำได้ไม่ดีใช้พื้นผิวนี้ตั้ง (มะเดื่อ S2)เราสำรวจต่อไปว่าใกล้บังคับถูกความแตกแยกในคอลัมน์ทั่วไปและทำให้บริสุทธิ์โปรโตคอลที่ใช้ histidine แท็กโปรตีน สมบูรณ์ immobilisationโปรติเอสผ่าน histidine ของ แท็กสามารถลดการหมุนเวียนในระหว่าง oncolumnความแตกแยกของพื้นผิว immobilised ร่วม จำเป็นต้องใช้ของยอดเงินที่เพิ่มขึ้นสำหรับประสิทธิภาพความแตกแยก เพิ่ม 30 มม.อิมิดาโซลบรรเทาข้อจำกัดนี้ เป็นผลในการปรับปรุงความแตกแยกประสิทธิภาพใช้ histidine แท็ก ePDZ b - WELQ-OFP และ SplB APโปรตีน (มะเดื่อ S3) เงื่อนไขเหล่านี้ใช้สำหรับบนคอลัมน์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เมื่อเทียบกับความยาวเต็มเปปไทด์ (รูปที่ 2. การเปรียบเทียบกับเลน 16
18e19) นอกจากนี้กิจกรรมโดยรวมเมื่อเทียบกับ SplBCON
และ SplB-COM ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญ (เทียบเลน
18e19 และ 20e21).
ต่อไปเราใช้หลักการเพื่อ TeV น้ำย่อยมากที่สุดแห่งหนึ่ง
เอนไซม์แพร่หลายใช้ในการลบแท็กความสัมพันธ์ที่ดีที่สุด
แข็งกระด้างลำดับฉันทามติ ENLYFQYS [13,14] เราสร้าง
พื้นผิวฟิวชั่นนั้นลำดับนี้ถูกตัดออกไป ENLYFQ,
และวางอยู่ระหว่างส่วนประกอบ ePDZ-B และ OFP TEV สามารถ
แล่งเมื่อซีรีนในตำแหน่ง P1 'จะถูกแทนที่ด้วย methionine กับ
การสูญเสียส่วนเพิ่มของกิจกรรม [15] อย่างไรก็ตามข้อ จำกัด steric เนื่องจากการ
พับแน่นภูมิภาค n- ขั้วของ OFP อาจส่งผลกระทบในเชิงลบเกี่ยวกับ
ความแตกแยก ผลที่ได้แสดงดีขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเมื่อความแตกแยก TEV จะ
หลอมรวมกับการเพิ่มประสิทธิภาพกรดตัดทอน 4 อะมิโนเปปไทด์ ARVCF
(TEV-AP4) (รูป. 3A) ความแตกแยกที่น่าสังเกตคือข้อสังเกตหลังจากนั้นเพียง
30 นาทีบ่มด้วยเสียงส่วนใหญ่ของพื้นผิว Beng ผ่าหลัง
2.5 ชั่วโมง ในการเปรียบเทียบ TEV น้ำย่อยเท่านั้นแสดงให้เห็นความแตกแยกอย่างมีนัยสำคัญ
หลังจากการบ่ม 24 ชั่วโมง โปรดทราบว่าทั้ง TEV-AP4 และ TEV โปรตีน
ที่ใช้ประกอบด้วยการกลายพันธุ์ S219A แนะนำเพื่อลดการย่อยตัวเอง
[8] การทดลองควบคุมการใช้สารตั้งต้นฟิวชั่นที่ประกอบไปด้วย
TEV เต็มรูปแบบฉันทามติลำดับ (ENLYFQS) นำไปสู่ความแตกแยกเทียบเท่า
โดยทั้งสองชนิดป่าและ TEV TEV-AP4 (รูป. 3B) TEV ภายนอก
น้ำย่อย (ลบการกลายพันธุ์ S219V) แสดงให้เห็นความแตกแยกแม้ยากจน
เมื่อเทียบกับ TEV-AP4 สำหรับพื้นผิวเดียวกัน (รูป. S1) เรา
ต่อไป assayed TEV-AP4 บนพื้นผิวฟิวชั่นที่ OFP ถูก
แทนที่ด้วยโดเมน fibronectin 10Fn3 (ePDZ-B-ENLYFQY-
10Fn3) เมื่อก่อนที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ได้รับความแตกแยกใน
เวลาที่สั้นมากเมื่อใช้ TEV-AP4 เมื่อเทียบกับ TEV (รูป. 4A).
ได้รับการอัดสูง 10Fn3 พับ [16] มันเป็นไปได้ว่า steric
จำกัด ยับยั้งความแตกแยกโดย TEV บทนำของ GGS หรือ GGSGGS
Linkers (ให้ผลผลิต ePDZ-B-ENLYFQYMGGS-10Fn3 และ ePDZ-B-
ENLYFQYMGGSGGS-10Fn3 ตามลำดับ) มีผลในการปรับปรุง
ความแตกแยกโดย TEV แต่นี้ก็ยังคงมีมากน้อยกว่าสำหรับ TEVAP4
(รูป. 4B, C) เมื่อก่อน TEV ภายนอกยังดำเนินการได้ไม่ดี
โดยใช้สารตั้งต้นชุดนี้ (รูป. S2).
ต่อไปเราสำรวจว่าแนวคิดการบังคับใช้-ใกล้ชิดเป็น
ที่ใช้บังคับกับการชุมนุมในคอลัมน์ความแตกแยกและการทำให้บริสุทธิ์
โปรโตคอลที่สามารถใช้แท็กฮิสติดีนโปรตีน ตรึงสมบูรณ์
ของน้ำย่อยผ่านทางแท็กฮิสติดีนของมันสามารถลดผลประกอบการในช่วง oncolumn
ความแตกแยกของพื้นผิวร่วมตรึงทั้งนี้การใช้
ในปริมาณที่เพิ่มขึ้นสำหรับความแตกแยกที่มีประสิทธิภาพ นอกเหนือจาก 30 มิลลิเมตร
imidazole บรรเทา จำกัด นี้ทำให้เกิดความแตกแยกในการปรับปรุง
ประสิทธิภาพการใช้แท็กฮิสติดีน ePDZ-B--WELQ OFP และ SplB-AP
โปรตีน (รูป. S3) เงื่อนไขเหล่านี้ถูกนำมาใช้ในคอลัมน์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เมื่อเทียบกับแบบเต็มตัว เปปไทด์ ( รูปที่ 2 เปรียบเทียบกับเลน 1618e19 ) นอกจากนี้ กิจกรรมโดยรวมเมื่อเทียบกับ splbconsplb com และเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ( เปรียบเทียบเลนและ 18e19 20e21 )คราวหน้าใช้หลักการที วีโปร หนึ่งในที่สุดUbiquitous เอนไซม์ที่ใช้ลบติดแท็กที่เหมาะสมคลีฟส์ลำดับเอกฉันท์ enlyfqys [ 13,14 ] เราสร้างขึ้นการหลอมรวมฐานรองซึ่งลำดับนี้ enlyfq สั้นไป ,และอยู่ระหว่าง epdz-b และส่วนประกอบ p . ที วี สามารถตัดเมื่อเอนไซม์ที่ตำแหน่ง P1 " จะถูกแทนที่ด้วยละกับการสูญเสียค่าใช้จ่ายกิจกรรม [ 15 ] อย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดเอ เนื่องจากการแน่นพับถูกภาคปัจจุบันอาจส่งผลกระทบในทางลบต่อความแตกแยก แสดงผลชัดเจนขึ้นเมื่อมีรอยปริแยก ที วีผสมกับกรด - 4-amino ตัดทอน arvcf เปปไทด์( tev-ap4 ) ( รูปที่ 3 ) เด่นรองสังเกตหลังเท่านั้น30 นาทีกับส่วนใหญ่ของพื้นผิวฟักเป็นหลังจากเบ็ง2.5 ชั่วโมงในการเปรียบเทียบ ที วีเอสอย่างมีนัยสำคัญการเท่านั้นหลังจากบ่ม 24 H . ทราบว่า ทั้ง tev-ap4 tev โปรตีนและใช้ประกอบ s219a การกลายพันธุ์แนะนำให้ลดการย่อย[ 8 ] ควบคุมการทดลองใช้ฟิวชั่นหลากหลายประกอบด้วยเต็มที วี เอกฉันท์ ลำดับ ( enlyfqs ) นำไปสู่ความแตกแยก เทียบเท่าทั้งยา และ tev-ap4 tev ( รูปที่ 3B ) ส่วนโครงสร้างที วีโปรติเอส ( ลบ s219v การกลายพันธุ์ ) พบจนแตกแยกเมื่อเทียบกับ tev-ap4 สำหรับพื้นผิวเดียวกัน ( รูปที่ S1 ) เราซีรั่มหน้า tev-ap4 บนพื้นผิวที่ปัจจุบันเป็นฟิวชั่นแทนที่ด้วยไฟโบรเนกติน 10fn3 ( epdz-b-enlyfqy - โดเมน10fn3 ) ก่อนที่ความแตกแยกได้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในสั้นมากเมื่อเทียบกับการใช้ tev-ap4 ครั้งที วี ( รูปที่ 4 )ให้มีขนาดกะทัดรัด 10fn3 พับ [ 16 ] ดูเหมือนว่าเอข้อจำกัดขัดขวางความแตกแยกโดย tev . แนะนำ ggsggs Group G หรือlinkers ( ผลผลิต epdz-b-enlyfqymggs-10fn3 epdz-b - และenlyfqymggsggs-10fn3 ตามลำดับ ) ผลในการปรับปรุงแนวแตกเรียบโดย ที วี ยังนี้ยังมากน้อยกว่าสำหรับ tevap4( ภาพที่ 4B , C ) เป็นก่อนพบ tev ยังแสดงไม่ดีใช้แผ่นชุดนี้ ( รูป S2 )เราต่อไปสำรวจว่ามีแนวคิด เช่นใช้กับตัวปกติในคอลัมน์ และบำบัดน้ำเสียโปรโตคอลที่ใช้เมื่อแท็กโปรตีน immobilisation สมบูรณ์โปรตีเอสผ่านแท็กีนสามารถลดอัตราการหมุนเวียนของ oncolumn ในระหว่างความแตกแยกของ Co ตรึง necessitating ใช้ตั้งต้นของปริมาณที่เพิ่มขึ้นในประสิทธิภาพของความแตกแยก เพิ่ม 30 มม.จิบะ มาโมรุ ทั้งข้อจำกัดนี้ ส่งผลให้เพิ่มความแตกแยกประสิทธิภาพการใช้ epdz-b ีน - welq-ofp splb AP และติดแท็กโปรตีน ( ภาพที่ S3 ) เงื่อนไขเหล่านี้ถูกใช้ในคอลัมน์