AbstractHere we describe a versatil

Abstract
Here we describe a versatile high-throughput expression system that permits genome-wide screening of type 1 membrane and secreted proteins for interactions with glycans and proteins using both cell-expressed and soluble forms of the expressed proteins. Based on Gateway cloning methodology, we have engineered a destination vector that directs expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-tagged proteins at the cell surface via a glycosylphosphatidylinositol tail. The EGFP fusion proteins can then be cleaved with PreScission protease to release soluble forms of proteins that can be optionally biotinylated. We demonstrate the utility of this cloning and expression system for selected low-affinity membrane lectins from the siglec family of sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins, for the glycosaminoglycan-binding proteins FGF-1 and BACE, and for the heterotypic adhesion molecules JAM-B and JAM-C. Cell-expressed proteins can be evaluated for glycan interactions using polyvalent soluble glycan probes and for protein interactions using either cells or soluble proteins. Following cleavage from the cell surface, proteins were complexed in solution and sufficient avidity was achieved to measure weak protein–glycan and weak protein–protein interactions using glycan arrays and surface plasmon resonance, respectively.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

นามธรรม
นี่เราอธิบายระบบอเนกประสงค์นิพจน์อัตราความเร็วสูงที่อนุญาตให้มีการคัดกรองทั้งจีโนมของเมมเบรนชนิด 1 และโปรตีน secreted สำหรับการโต้ตอบกับ glycans และโปรตีนโดยใช้รูปแบบโปรตีนแสดง แสดงเซลล์ และละลายน้ำ ตามวิธีการโคลนเกตเวย์ เราได้สร้างขึ้นได้โดยปลายทางเวกเตอร์ที่กำหนดนิพจน์เพิ่มโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (EGFP) -แท็กโปรตีนที่ผิวเซลล์ผ่านหาง glycosylphosphatidylinositol EGFP อาหารโปรตีนแล้วจะแหวกกับรติเอส PreScission ปล่อยรูปแบบละลายน้ำของโปรตีนที่สามารถเลือก biotinylated เราเห็นถึงอรรถประโยชน์ของระบบนี้โคลนและเลือกความสัมพันธ์ต่ำเยื่อ lectins จากครอบครัว siglec lectins immunoglobulin เหมือนกรด sialic ผูก โปรตีนรวม glycosaminoglycan FGF-1 และ BACE และโมเลกุลยึดเกาะ heterotypic แยม-บีและซีแยม แสดงเซลล์โปรตีนสามารถประเมินโต้ glycan ใช้คลิปปากตะเข้ glycan polyvalent ละลาย และโต้ตอบโปรตีนโดยใช้เซลล์หรือโปรตีนที่ละลายน้ำได้ ต่อปริจากผิวเซลล์ โปรตีนถูก complexed ในโซลูชัน และ avidity พอสำเร็จวัดโปรตีน – glycan อ่อนแอและโต้ตอบอ่อนโปรตีน – โปรตีนโดยใช้อาร์เรย์ glycan และพื้นผิวการสั่นพ้อง plasmon ตามลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

นามธรรม
ที่นี่เราอธิบายระบบที่หลากหลายผ่านการแสดงออกสูงที่อนุญาตให้คัดกรองจีโนมกว้างของเมมเบรนชนิดที่ 1 และโปรตีนหลั่งสำหรับการติดต่อกับ glycans และโปรตีนโดยใช้รูปแบบเซลล์แสดงและละลายน้ำได้ทั้งโปรตีน ขึ้นอยู่กับวิธีการโคลนเกตเวย์เราได้ออกแบบเวกเตอร์หัวข้อที่นำการแสดงออกของการปรับปรุงสีเขียวเรืองโปรตีน (EGFP) โปรตีน -tagged ที่ผิวเซลล์ผ่านทางหาง glycosylphosphatidylinositol EGFP โปรตีนฟิวชั่นนั้นจะสามารถตัดกับ PreScission โปรติเอสที่จะปล่อยรูปแบบที่ละลายน้ำได้ของโปรตีนที่สามารถ biotinylated เลือก เราแสดงให้เห็นถึงประโยชน์ของการโคลนและการแสดงออกนี้ระบบสำหรับการเลือกต่ำสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดเลกตินเมมเบรนจากครอบครัว siglec ของอิมมูโนเหมือนเลกตินกรดเซียลิผูกพันสำหรับโปรตีน glycosaminoglycan ผูกพัน FGF-1 และ BACE และสำหรับ heterotypic โมเลกุลยึดเกาะ JAM -B และ JAM-C โปรตีนเซลล์แสดงความสามารถได้รับการประเมินสำหรับการติดต่อไกลแคนใช้แมวเซา probes ไกลแคนที่ละลายน้ำและโปรตีนโดยใช้เซลล์หรือโปรตีนที่ละลายน้ำได้ ต่อไปนี้ความแตกแยกจากเซลล์ผิวโปรตีนถูก complexed ในการแก้ปัญหาและความโลภที่เพียงพอก็ประสบความสำเร็จในการวัดความอ่อนแอโปรตีนไกลแคนและอ่อนแอปฏิสัมพันธ์โปรตีนใช้อาร์เรย์ไกลแคนและพื้นผิว PLASMON เสียงตามลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

นามธรรม
ที่นี่เราจะอธิบายอเนกประสงค์ช่วยการแสดงออกระบบที่อนุญาตให้ genome-wide การหลั่งโปรตีนเมมเบรนชนิดที่ 1 และการปฏิสัมพันธ์กับ glycans และโปรตีนโดยใช้ทั้งเซลล์ที่แสดงและรูปแบบของการแสดงออกโปรตีน ขึ้นอยู่กับวิธีการโคลนนิ่ง เกตเวย์ปลายทางเราต้องเวกเตอร์ที่นําการแสดงออกของโปรตีนเรืองแสงสีเขียวได้เพิ่มขึ้น ( egfp ) - แท็กโปรตีนที่ผิวเซลล์ผ่านทาง glycosylphosphatidylinositol หาง การ egfp ฟิวชันโปรตีนสามารถของ prescission โปรปล่อยรูปแบบปริมาณของโปรตีนที่สามารถเลือกไล .เราแสดงให้เห็นถึงประโยชน์ของการโคลนและการแสดงออกของระบบสำหรับเลือกต่ำต่อเยื่อเลคตินจาก siglec ครอบครัวของอิมมูโนโกลบูลิน เช่น กรดผูกพันเลกตินโปรตีนที่จับกับโชว์มียัวร์เลิฟและ fgf-1 bace และสำหรับ Heterotypic โมเลกุลและการ jam-b jam-c.เซลล์มีโปรตีนสามารถพบได้ในการไกลแคนปฏิสัมพันธ์ต่อไกลแคนและโปรตีนปฏิสัมพันธ์โดยใช้ทั้งเซลล์หรือโปรตีนที่ละลายน้ำได้ ต่อไปนี้การแยกออกจากผิวเซลล์โปรตีนที่ซับซ้อนอยู่ในสารละลาย avidity เพียงพอสําเร็จ วัดอ่อนแอโปรตีนโปรตีนโปรตีนและไกลแคนและอ่อนแอและปฏิสัมพันธ์โดยใช้อาร์เรย์ไกลแคนและสะท้อนพื้นผิว PLASMON , ตามลำดับ