The coding sequence for the bovine

The coding sequence for the bovine pancreatic ribonuclease (RNase) precursor has been cloned and produced in Escherichia coli using the polymerase chain reaction (PCR) technique. A PCR amplification has been carried out utilizing as template the recombinant plasmid, pQR138, which contains the coding sequence for the RNase precursor, and primers that allow for the addition of new sequences at the 5' and 3' ends of the coding sequence. The resultant fragment contains two coding sequences, one for a hexapeptide and the other for pre-RNase. This fragment has been cloned into the expression vector, pKK223.3, under the control of the tac promoter, to form a two-cistron vector. Upon induction with IPTG, E. coli cells harboring this construct generate a bicistronic mRNA which upon translation produces a hexapeptide and pre-RNase. The RNase precursor is efficiently translocated into the periplasmic space of E. coli. Upon translocation, the signal sequence is removed generating mature RNase. Formation of the disulfide bridges in RNase is facilitated by the oxidative environment of the periplasm and a fully active protein is obtained. RNase produced in E. coli has been purified to homogeneity by cation-exchange chromatography, and the removal of the signal sequence has been verified by N-terminal sequencing. The total process from inoculation of media to obtaining pure and fully active recombinant RNase is achieved in 48 h

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ลำดับที่รหัสสำหรับสารตั้งต้นวัวตับอ่อน ribonuclease (RNase) ถูกโคลน และผลิตใน Escherichia coli โดยใช้เทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) การพอลิเมอเรส ขยาย PCR มีการดำเนินการใช้เป็นแม่แบบ recombinant plasmid, pQR138 ซึ่งประกอบด้วยลำดับรหัสสำหรับสารตั้งต้น RNase และไพรเมอร์ที่ช่วยให้สามารถเพิ่มลำดับใหม่ที่ปลาย 5' และ 3' ของลำดับรหัส ส่วนผลแก่ประกอบด้วยสองรหัสลำดับ หนึ่ง hexapeptide ที่และอื่น ๆ สำหรับ RNase ก่อน ส่วนนี้มีการโคลนเป็นเวกเตอร์นิพจน์ pKK223.3 ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์มาตรวัด แบบเวกเตอร์สอง cistron เมื่อเหนี่ยวนำด้วย IPTG เซลล์ E. coli harboring โครงสร้างนี้สร้างแบบ bicistronic mRNA ซึ่งเมื่อแปล hexapeptide และ RNase ก่อน มีประสิทธิภาพมี translocated สารตั้งต้น RNase ใน periplasmic ใน E. coli เมื่อมีการสับเปลี่ยน ลำดับสัญญาณจะเอาสร้าง RNase ผู้ใหญ่ ก่อตัวของสะพานไดซัลไฟด์ใน RNase จะอาศัยระบบ oxidative ของ periplasm และได้โปรตีนทั้งหมดใช้งานอยู่ มีการบริสุทธิ์เพื่อ homogeneity RNase ผลิตใน E. coli โดย cation exchange chromatography และกำจัดลำดับสัญญาณถูกตรวจสอบ โดยลำดับ N-เทอร์มินัล กระบวนการรวมจาก inoculation สื่อเพื่อรับ RNase recombinant บริสุทธิ์ และใช้งานอยู่ทั้งหมดทำใน 48 h

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ลำดับการเข้ารหัสสำหรับ ribonuclease ตับอ่อนวัว (RNase) ผู้นำได้รับการโคลนและผลิตใน Escherichia coli โดยใช้วิธี Polymerase chain reaction (PCR) ขยาย PCR ได้รับการดำเนินการใช้เป็นแม่แบบพลาสมิด recombinant, pQR138 ซึ่งมีลำดับการเข้ารหัสสำหรับสารตั้งต้น RNase และไพรเมอร์ที่ช่วยให้การเพิ่มของใหม่ลำดับที่ 5 'และ 3' สิ้นสุดของลำดับการเข้ารหัส ส่วนผลที่มีสองลำดับการเข้ารหัสหนึ่งสำหรับ hexapeptide และอื่น ๆ สำหรับก่อน RNase ส่วนนี้ได้รับการโคลนเป็นเวกเตอร์แสดงออก pKK223.3 ภายใต้การควบคุมของผู้ก่อการแทคในรูปแบบเวกเตอร์สอง Cistron เมื่อเหนี่ยวนำด้วย IPTG, เซล E.coli เยิ้มนี้สร้างสร้าง mRNA bicistronic ซึ่งเมื่อแปลผลิต hexapeptide และ pre-RNase ปูชนียบุคคล RNase เป็นอย่างมีประสิทธิภาพ translocated ในพื้นที่ periplasmic ของเชื้อ E. coli เมื่อการโยกย้ายลำดับสัญญาณจะถูกลบออกสร้าง RNase ผู้ใหญ่ การก่อตัวของสะพานซัลไฟด์ใน RNase อำนวยความสะดวกโดยสภาพแวดล้อมออกซิเดชันของ periplasm และโปรตีนที่ใช้งานได้อย่างเต็มที่ RNase ผลิตใน E. coli ได้รับการทำให้บริสุทธิ์จะเป็นเนื้อเดียวกันโดยโครมาแลกเปลี่ยนไอออนและการกำจัดของลำดับสัญญาณที่ได้รับการตรวจสอบโดยลำดับ n- ขั้ว กระบวนการทั้งหมดจากการฉีดวัคซีนของสื่อที่จะได้รับ RNase recombinant บริสุทธิ์และใช้งานได้อย่างเต็มที่จะประสบความสำเร็จใน 48 ชั่วโมง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รหัสลำดับสำหรับไรโบนิวคลีเตับอ่อนวัว ( เลส ) สารตั้งต้นได้ถูกโคลนและผลิตใน Escherichia coli โดยใช้เทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่ . เป็นเทคนิคแบบมีวัตถุประสงค์ใช้เป็นแม่แบบ pqr138 พลาสมิดพาหะที่ , ซึ่งมีการเข้ารหัสสำหรับสารตั้งต้นเลสดับ ,ไพรเมอร์ที่ช่วยให้เพื่อและนอกจากนี้ลำดับใหม่ที่ 5 ' และ 3 ' ปลายนะครับ ลำดับ ส่วนผลที่มีสองรหัสลำดับหนึ่งสำหรับ hexapeptide และอื่น ๆก่อนเลส . ชิ้นนี้ถูกโคลนเข้าไปในนิพจน์เวกเตอร์ pkk223.3 ภายใต้การควบคุมของ tac promoter , รูปแบบเวกเตอร์สองยีน . เมื่อเหนี่ยวนำด้วยโปรตีน เช่นเซลล์ที่สร้างนี้สร้าง bicistronic mRNA ซึ่งเมื่อแปล hexapeptide ก่อนผลิตและเลส . สารตั้งต้น translocated เลสมีประสิทธิภาพในพื้นที่ periplasmic ของ E . coli เมื่อโยกย้าย สัญญาณลำดับถูกสร้างเป็นเลส .โครงสร้างของสะพานในไดเลสจะอํานวยความสะดวกโดยสภาพแวดล้อมออกซิเดชันของโปรตีน periplasm อย่างเต็มที่และใช้งานได้ เลสที่ผลิตใน E . coli ได้บริสุทธิ์ วิธีการแลกเปลี่ยนประจุโดยวิธีโครมาโทกราฟี และกำจัดสัญญาณลำดับได้ถูกตรวจสอบ โดยลำดับของกรดอะมิโน .กระบวนการทั้งหมดจากการใช้สื่อ การใช้โปรตีนที่บริสุทธิ์และเต็มที่เลสได้ใน 48 ชม.