- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
3.8. Apoptosis and caspase-3/7, -8
3.8. Apoptosis and caspase-3/7, -8 and -9 activity
A family of cysteine proteases known as the caspases is believed to play a central role in mediating various apoptotic responses. Activation of the caspase cascade is an integral event in the apoptotic pathway. Apoptotic caspases can be divided into two classes: initiator and executioner caspases. Initiator caspases (caspase-2,caspase-8 and caspase-9) are the apical caspases in apoptosis signaling cascades and their activation is normally required for executioner caspase (caspase-3, caspase-6 and caspase-7) activation.
Human caspase-8 and caspase-9 are involved in initiating apoptosis through two different signalling mechanisms and are known as initiator caspases. Activation of these caspases occurs before activation of caspases-3 and -7. They cleave pro-caspases-3 and -7 to activate them and commit cells to apoptotic death. Caspase-3, -6, and -7 are thought to coordinate the execution phase of apoptosis by cleaving multiple structural and repair proteins .
Caspases-8 and -9 are considered early indicators of apoptosis. They are each involved in a specific pathway in response to stimuli to the cell that causes programmed cell death. Caspase-9 is a marker for the intrinsic or mitochondrial pathwayfor apoptosis. Caspase-8 is an indicator that the extrinsic pathway to apoptosis has been activated. Caspase-Glo-3/7 is a general indicator of apoptosis. In this study, HT-29 cells were treated with 86.68 } 0.73 lg/ml (IC50) of WTE incubated for different time periods to investigate the caspase activity and the possible mechanism of action.
The Caspase-Glo-3/7 assay targets both caspase-3 and caspase-7, as they recognize the same peptide for cleavage and the substrate in the kit is a peptide that becomes luminescent on cleavage. These caspases are both considered to be markers of when a cell is committed to apoptosis. The Caspase-Glo-8 and -9 assays were used to determine which pathway was triggered by treatment of the tumourigenic cell line, HT-29, with the white tea extract.
The activity of caspases-3/7, -8 and -9 in HT-29 cells treated with the white tea extract (hot water) is shown in Fig. 2. The activity of each of the caspases increased with respect to the number of cells undergoing apoptosis in the experiment. The extracts increased the activities of caspase-3/7, -8 and -9 activities up to 16 h incubation time and then decreased after 24 and 48 h. The expression levels of caspase-3/7, -8, and -9 in treated cells showed the highest activities at 16 h, increasing by 2.8, 2.4 and 6.08-fold, respectively, as compared to levels in untreated cells. These increases were only significant up to 24 h incubation and then decreased after 48 h, except for the activity of caspase 9, which was significantly higher than untreated cells even after 48 h incubation (p < 0.01). The diminished activity of initiator caspases-8 and -9 after 16 h treatment is possibly due to the activation of other cascades related to apoptosis.
The activity of caspase-3/7 in treated cells was highly significant when compared to the untreated cells (p < 0.01). The results showed that the extract was able to induce apoptosis by activation of caspase-3/7 (Fig. 2A). Caspases-8 (Fig. 2B) and -9 (Fig. 2C) showed significantly higher activity in treated cells when compared with the untreated cells. This suggests that the treatments induced apoptosis via death receptors through activation of caspase-8 and also the mitochondrial pathway by activating caspase-9.
Activated caspase-8 and -9 may then have resulted in the serial initiation and activation of the caspase cascade that eventually led to activation of caspase-3 that in turn cleaved cytoskeletal proteins, activated DNAse and caused cell death by apoptosis.
The cytotoxic effects and antiproliferative activity of plant compounds against HT-29 by activating caspases and inducing apoptosis have been shown in previous studies. The activation of caspase-3 and -9 in HT-29 cells treated with EGCG (epigallocatechin-3-gallate), a major component in green tea polyphenols, was detected after 12 h treatment, accompanied by mitochondrial transmembrane potential transition and cytochrome c release . It also has been reported that black tea induced tumour cell apoptosis by Bax translocation, loss in mitochondrial transmembrane potential, cytochrome c release and caspase activation. Our results were in line with other studies; our white tea extracts induced apoptosis initiated via the death receptor and also via the mitochondrial apoptotic pathway as demonstrated by increased expression levels of caspases-3, -8 and -9.
Initiator caspases (caspase-8 and caspase-9) are involved in initiating apoptosis in response to stimuli to the cell that causes programmed cell death. In this study cells treated with WTE after 16 h showed the maximum activities of the caspase-8 and caspase-9 as compared to the 24 h and 48 h treatment. Both the death receptor and the mitochondrial pathways are suggested for the mechanism of action of tea extract to induce apoptosis. It was concluded that WTE induced apoptosis via death receptors and mitochondrial pathway by activation of caspase-8 and caspase-9, respectively.
Activation of the initiator caspases lead to activation of executioner caspases (caspases-3 and -7). Activation of caspases-3 and -7 commit cells to apoptotic death. The reduction of the caspase activity after 16 h is possibly due to the increasing number of apoptotic cells on prolonged treatment (24 and 48 h) and the accumulation of dead cell debris which could interfere with the enzyme action. The results of our study suggest that the activation of the caspase pathway triggered apoptosis in HT-29 cells treated with the Silver needle white tea extract.
A family of cysteine proteases known as the caspases is believed to play a central role in mediating various apoptotic responses. Activation of the caspase cascade is an integral event in the apoptotic pathway. Apoptotic caspases can be divided into two classes: initiator and executioner caspases. Initiator caspases (caspase-2,caspase-8 and caspase-9) are the apical caspases in apoptosis signaling cascades and their activation is normally required for executioner caspase (caspase-3, caspase-6 and caspase-7) activation.
Human caspase-8 and caspase-9 are involved in initiating apoptosis through two different signalling mechanisms and are known as initiator caspases. Activation of these caspases occurs before activation of caspases-3 and -7. They cleave pro-caspases-3 and -7 to activate them and commit cells to apoptotic death. Caspase-3, -6, and -7 are thought to coordinate the execution phase of apoptosis by cleaving multiple structural and repair proteins .
Caspases-8 and -9 are considered early indicators of apoptosis. They are each involved in a specific pathway in response to stimuli to the cell that causes programmed cell death. Caspase-9 is a marker for the intrinsic or mitochondrial pathwayfor apoptosis. Caspase-8 is an indicator that the extrinsic pathway to apoptosis has been activated. Caspase-Glo-3/7 is a general indicator of apoptosis. In this study, HT-29 cells were treated with 86.68 } 0.73 lg/ml (IC50) of WTE incubated for different time periods to investigate the caspase activity and the possible mechanism of action.
The Caspase-Glo-3/7 assay targets both caspase-3 and caspase-7, as they recognize the same peptide for cleavage and the substrate in the kit is a peptide that becomes luminescent on cleavage. These caspases are both considered to be markers of when a cell is committed to apoptosis. The Caspase-Glo-8 and -9 assays were used to determine which pathway was triggered by treatment of the tumourigenic cell line, HT-29, with the white tea extract.
The activity of caspases-3/7, -8 and -9 in HT-29 cells treated with the white tea extract (hot water) is shown in Fig. 2. The activity of each of the caspases increased with respect to the number of cells undergoing apoptosis in the experiment. The extracts increased the activities of caspase-3/7, -8 and -9 activities up to 16 h incubation time and then decreased after 24 and 48 h. The expression levels of caspase-3/7, -8, and -9 in treated cells showed the highest activities at 16 h, increasing by 2.8, 2.4 and 6.08-fold, respectively, as compared to levels in untreated cells. These increases were only significant up to 24 h incubation and then decreased after 48 h, except for the activity of caspase 9, which was significantly higher than untreated cells even after 48 h incubation (p < 0.01). The diminished activity of initiator caspases-8 and -9 after 16 h treatment is possibly due to the activation of other cascades related to apoptosis.
The activity of caspase-3/7 in treated cells was highly significant when compared to the untreated cells (p < 0.01). The results showed that the extract was able to induce apoptosis by activation of caspase-3/7 (Fig. 2A). Caspases-8 (Fig. 2B) and -9 (Fig. 2C) showed significantly higher activity in treated cells when compared with the untreated cells. This suggests that the treatments induced apoptosis via death receptors through activation of caspase-8 and also the mitochondrial pathway by activating caspase-9.
Activated caspase-8 and -9 may then have resulted in the serial initiation and activation of the caspase cascade that eventually led to activation of caspase-3 that in turn cleaved cytoskeletal proteins, activated DNAse and caused cell death by apoptosis.
The cytotoxic effects and antiproliferative activity of plant compounds against HT-29 by activating caspases and inducing apoptosis have been shown in previous studies. The activation of caspase-3 and -9 in HT-29 cells treated with EGCG (epigallocatechin-3-gallate), a major component in green tea polyphenols, was detected after 12 h treatment, accompanied by mitochondrial transmembrane potential transition and cytochrome c release . It also has been reported that black tea induced tumour cell apoptosis by Bax translocation, loss in mitochondrial transmembrane potential, cytochrome c release and caspase activation. Our results were in line with other studies; our white tea extracts induced apoptosis initiated via the death receptor and also via the mitochondrial apoptotic pathway as demonstrated by increased expression levels of caspases-3, -8 and -9.
Initiator caspases (caspase-8 and caspase-9) are involved in initiating apoptosis in response to stimuli to the cell that causes programmed cell death. In this study cells treated with WTE after 16 h showed the maximum activities of the caspase-8 and caspase-9 as compared to the 24 h and 48 h treatment. Both the death receptor and the mitochondrial pathways are suggested for the mechanism of action of tea extract to induce apoptosis. It was concluded that WTE induced apoptosis via death receptors and mitochondrial pathway by activation of caspase-8 and caspase-9, respectively.
Activation of the initiator caspases lead to activation of executioner caspases (caspases-3 and -7). Activation of caspases-3 and -7 commit cells to apoptotic death. The reduction of the caspase activity after 16 h is possibly due to the increasing number of apoptotic cells on prolonged treatment (24 and 48 h) and the accumulation of dead cell debris which could interfere with the enzyme action. The results of our study suggest that the activation of the caspase pathway triggered apoptosis in HT-29 cells treated with the Silver needle white tea extract.
0/5000
3.8 การ Apoptosis และ caspase-3/7, -8 และ-9ครอบครัวของ proteases cysteine เป็น caspases เชื่อว่าบทบาทศูนย์กลางในการตอบสนองต่าง ๆ ของ apoptotic เป็นสื่อกลาง เปิดใช้งานการเรียงซ้อนของ caspase เป็นเหตุการณ์สำคัญในทางเดิน apoptotic Apoptotic caspases สามารถแบ่งออกเป็น 2 ประเภท: caspases อุปกรณและเพชฌฆาต อุปกรณ caspases (caspase-2, caspase-8 และ caspase 9) จะเรียงซ้อน caspases ปลายยอดในสัญญาณ apoptosis และการเปิดใช้งานโดยปกติจำเป็นสำหรับเพชฌฆาต caspase (caspase-3, caspase-6 และ caspase 7) เปิดใช้งานมนุษย์ caspase-8 และ caspase-9 มีส่วนร่วมในการเริ่มต้นการ apoptosis ผ่าน 2 กลไกแดงแตกต่างกัน และเป็นอุปกรณ caspases เรียกใช้ caspases เหล่านี้เกิดขึ้นก่อนเปิดใช้งาน caspases-3 และ -7 พวกเขา cleave โป-caspases-3 และ -7 เพื่อเปิดใช้ และส่งเซลล์ตาย apoptotic Caspase-3, -6 และ -7 มีความคิดที่ประสานขั้นตอนการดำเนินการของ apoptosis โดย cleaving หลายโปรตีนโครงสร้างและซ่อมแซมCaspases 8 และ-9 เป็นต้นตัวบ่งชี้ของ apoptosis พวกเขาจะเกี่ยวข้องกับทางเดินเฉพาะตอบสนองต่อสิ่งเร้าไปยังเซลล์ที่ทำให้เซลล์ตายตั้งโปรแกรมแต่ละ Caspase-9 เป็นเครื่องหมายสำหรับ apoptosis intrinsic หรือ mitochondrial pathwayfor Caspase 8 ตัวบ่งชี้ว่า ระดับการสึกหรอ apoptosis ได้ถูกเปิดใช้งานได้ ตัวบ่งชี้ที่ทั่วไปของ apoptosis Caspase-ว่า-3/7 ได้ ในการศึกษานี้ เซลล์เอชที-29 ได้รับการรักษา ด้วย 86.68 } 0.73 lg/ml (IC50) ของ WTE incubated สำหรับรอบระยะเวลาต่าง ๆ การตรวจสอบกิจกรรม caspase และกลไกที่เป็นไปได้ของการดำเนินการCaspase-ว่า-3/7 assay เป้าหมาย caspase-3 และ caspase-7 ตามที่พวกเขารู้จักเพปไทด์เดียวกันในแนวแตกเรียบ และพื้นผิวในชุดเป็นเพปไทด์ที่ luminescent บนแนวแตกเรียบ ทั้งสองถือเป็น เครื่องหมายของเมื่อเซลล์ให้ apoptosis caspases เหล่านี้ Caspase-ว่า-8 และ-9 assays ถูกใช้เพื่อกำหนดทางเดินที่ถูกทริกเกอร์ โดยการรักษารายการเซลล์ tumourigenic เอชที-29 ด้วยสารสกัดจากชาขาวกิจกรรม caspases-3/7, -8 และ-9 ในเซลล์เอชที-29 ที่รักษา ด้วยสารสกัดจากชาขาว (น้ำร้อน) จะแสดงใน Fig. 2 กิจกรรมของแต่ละ caspases เพิ่มขึ้นกับจำนวนของเซลล์ระหว่างการ apoptosis ในทดลอง สารสกัดที่เพิ่มกิจกรรมของ caspase-3/7, -8 และ-9 ได้ฟักตัว h 16 ครั้ง และลดลงแล้ว หลังจาก 24 และ 48 h ระดับนิพจน์ของ caspase-3/7, -8 และ-9 ในเซลล์บำบัดพบกิจกรรมสูงสุดที่ 16 h เพิ่ม โดย 2.8, 2.4 และ 6.08-fold ตามลำดับ เมื่อเทียบกับระดับในเซลล์ที่ไม่ถูกรักษาไว้ เพิ่มขึ้นเหล่านี้สำคัญขึ้นเพื่อฟักตัว 24 ชมแล้ว ลดลงหลังจาก h 48 ยกเว้นกิจกรรมของ caspase 9 ซึ่งเป็นอย่างมากสูงกว่าเซลล์ที่ไม่ถูกรักษาแม้หลังจากฟักตัว 48 h (p < 0.01) กิจกรรม diminished อุปกรณ caspases-8 และ-9 หลังจากรักษา 16 h อาจเนื่องจากการเรียกใช้ของน้ำตกอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับ apoptosisกิจกรรมของ caspase-3/7 ในเซลล์บำบัดสำคัญอย่างมากเมื่อเทียบกับเซลล์ไม่ถูกรักษา (p < 0.01) ผลพบว่า สารสกัดที่ได้ก่อให้เกิด apoptosis โดยเปิดใช้งานของ caspase-3/7 (Fig. 2A) Caspases-8 (Fig. 2B) และ-9 (Fig. 2C) พบว่ากิจกรรมอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ไม่ถูกรักษาบำบัดเซลล์ แนะนำว่า การรักษาทำให้เกิด apoptosis ผ่าน receptors ตายผ่านเปิดใช้งานของ caspase-8 และทางเดิน mitochondrial กำลัง caspase-9 เปิด caspase-8 และ-9 อาจแล้วทำให้เริ่มต้นลำดับการเปิดใช้งานการเรียงซ้อน caspase ที่ในที่สุดนำไปเปิดใช้งานของ caspase-3 ที่จะแหวกโปรตีน cytoskeletal เรียก DNAse และเกิดเซลล์ตาย โดย apoptosis มีการแสดงผล cytotoxic และ antiproliferative กิจกรรมพืชสารกับเอชที-29 เปิด caspases และ inducing apoptosis ในการศึกษาก่อนหน้านี้ การเรียกใช้ของ caspase-3 และ-9 ในเซลล์เอชที-29 รับ EGCG (epigallocatechin-3-gallate), เป็นองค์ประกอบสำคัญในชาเขียวโพลีฟีน ตรวจพบหลังการรักษา 12 h พร้อม ด้วย mitochondrial transmembrane อาจเปลี่ยนและ cytochrome c ปล่อย นอกจากนี้ยังมีรายงานว่า ชาดำทำให้เกิด apoptosis ของเซลล์เนื้องอก โดยการสับเปลี่ยน Bax แพ้ใน mitochondrial transmembrane ศักยภาพ cytochrome c ปล่อยและ caspase เปิดใช้งาน ผลของเราได้สอดคล้องกับการศึกษาอื่น ๆ ชาขาวของเราแยก apoptosis อาจเริ่มต้น ผ่านตัวรับความตาย และ ผ่านทางเดิน mitochondrial apoptotic เป็นโดยเพิ่มนิพจน์ระดับ caspases-3, -8 และ-9อุปกรณ caspases (caspase-8 และ caspase 9) เกี่ยวข้องใน apoptosis ในตอบสนองต่อสิ่งเร้าไปยังเซลล์ที่ทำให้โปรแกรมเซลล์ตาย ใน การศึกษาเซลล์รับ WTE หลัง 16 h พบกิจกรรมสูงสุดของ caspase 8 และ caspase-9 เมื่อเทียบกับการรักษา 24 ชมและ 48 h ออก ตัวรับความตายและมนต์ mitochondrial แนะนำสำหรับกลไกในการดำเนินการของสารสกัดใบชาเพื่อก่อให้เกิด apoptosis มีสรุปว่า WTE เหนี่ยวนำ apoptosis receptors ตายและทางเดิน mitochondrial โดยเปิดใช้งานของ caspase 8 และ caspase-9 ตามลำดับเปิดใช้งาน caspases อุปกรณนำไปเรียกใช้ caspases เพชฌฆาต (caspases-3 และ -7) เปิด caspases 3 และยืนยัน-7 เซลล์ตาย apoptotic การลดลงของกิจกรรม caspase หลัง 16 h อาจจะเนื่องจากการเพิ่มจำนวนเซลล์ apoptotic รักษานาน (h 24 และ 48) และการสะสมของเศษเซลล์ที่ตายแล้วซึ่งสามารถรบกวนการดำเนินการที่เอนไซม์ ผลการศึกษาของเราแนะนำให้ เปิดใช้งานของทางเดินของ caspase ทริกเกอร์ apoptosis ในเซลล์เอชที-29 ที่รักษา ด้วยสารสกัดจากชาขาวเข็มเงิน
การแปล กรุณารอสักครู่..
3.8. Apoptosis and caspase-3/7, -8 and -9 activity
A family of cysteine proteases known as the caspases is believed to play a central role in mediating various apoptotic responses. Activation of the caspase cascade is an integral event in the apoptotic pathway. Apoptotic caspases can be divided into two classes: initiator and executioner caspases. Initiator caspases (caspase-2,caspase-8 and caspase-9) are the apical caspases in apoptosis signaling cascades and their activation is normally required for executioner caspase (caspase-3, caspase-6 and caspase-7) activation.
Human caspase-8 and caspase-9 are involved in initiating apoptosis through two different signalling mechanisms and are known as initiator caspases. Activation of these caspases occurs before activation of caspases-3 and -7. They cleave pro-caspases-3 and -7 to activate them and commit cells to apoptotic death. Caspase-3, -6, and -7 are thought to coordinate the execution phase of apoptosis by cleaving multiple structural and repair proteins .
Caspases-8 and -9 are considered early indicators of apoptosis. They are each involved in a specific pathway in response to stimuli to the cell that causes programmed cell death. Caspase-9 is a marker for the intrinsic or mitochondrial pathwayfor apoptosis. Caspase-8 is an indicator that the extrinsic pathway to apoptosis has been activated. Caspase-Glo-3/7 is a general indicator of apoptosis. In this study, HT-29 cells were treated with 86.68 } 0.73 lg/ml (IC50) of WTE incubated for different time periods to investigate the caspase activity and the possible mechanism of action.
The Caspase-Glo-3/7 assay targets both caspase-3 and caspase-7, as they recognize the same peptide for cleavage and the substrate in the kit is a peptide that becomes luminescent on cleavage. These caspases are both considered to be markers of when a cell is committed to apoptosis. The Caspase-Glo-8 and -9 assays were used to determine which pathway was triggered by treatment of the tumourigenic cell line, HT-29, with the white tea extract.
The activity of caspases-3/7, -8 and -9 in HT-29 cells treated with the white tea extract (hot water) is shown in Fig. 2. The activity of each of the caspases increased with respect to the number of cells undergoing apoptosis in the experiment. The extracts increased the activities of caspase-3/7, -8 and -9 activities up to 16 h incubation time and then decreased after 24 and 48 h. The expression levels of caspase-3/7, -8, and -9 in treated cells showed the highest activities at 16 h, increasing by 2.8, 2.4 and 6.08-fold, respectively, as compared to levels in untreated cells. These increases were only significant up to 24 h incubation and then decreased after 48 h, except for the activity of caspase 9, which was significantly higher than untreated cells even after 48 h incubation (p < 0.01). The diminished activity of initiator caspases-8 and -9 after 16 h treatment is possibly due to the activation of other cascades related to apoptosis.
The activity of caspase-3/7 in treated cells was highly significant when compared to the untreated cells (p < 0.01). The results showed that the extract was able to induce apoptosis by activation of caspase-3/7 (Fig. 2A). Caspases-8 (Fig. 2B) and -9 (Fig. 2C) showed significantly higher activity in treated cells when compared with the untreated cells. This suggests that the treatments induced apoptosis via death receptors through activation of caspase-8 and also the mitochondrial pathway by activating caspase-9.
Activated caspase-8 and -9 may then have resulted in the serial initiation and activation of the caspase cascade that eventually led to activation of caspase-3 that in turn cleaved cytoskeletal proteins, activated DNAse and caused cell death by apoptosis.
The cytotoxic effects and antiproliferative activity of plant compounds against HT-29 by activating caspases and inducing apoptosis have been shown in previous studies. The activation of caspase-3 and -9 in HT-29 cells treated with EGCG (epigallocatechin-3-gallate), a major component in green tea polyphenols, was detected after 12 h treatment, accompanied by mitochondrial transmembrane potential transition and cytochrome c release . It also has been reported that black tea induced tumour cell apoptosis by Bax translocation, loss in mitochondrial transmembrane potential, cytochrome c release and caspase activation. Our results were in line with other studies; our white tea extracts induced apoptosis initiated via the death receptor and also via the mitochondrial apoptotic pathway as demonstrated by increased expression levels of caspases-3, -8 and -9.
Initiator caspases (caspase-8 and caspase-9) are involved in initiating apoptosis in response to stimuli to the cell that causes programmed cell death. In this study cells treated with WTE after 16 h showed the maximum activities of the caspase-8 and caspase-9 as compared to the 24 h and 48 h treatment. Both the death receptor and the mitochondrial pathways are suggested for the mechanism of action of tea extract to induce apoptosis. It was concluded that WTE induced apoptosis via death receptors and mitochondrial pathway by activation of caspase-8 and caspase-9, respectively.
Activation of the initiator caspases lead to activation of executioner caspases (caspases-3 and -7). Activation of caspases-3 and -7 commit cells to apoptotic death. The reduction of the caspase activity after 16 h is possibly due to the increasing number of apoptotic cells on prolonged treatment (24 and 48 h) and the accumulation of dead cell debris which could interfere with the enzyme action. The results of our study suggest that the activation of the caspase pathway triggered apoptosis in HT-29 cells treated with the Silver needle white tea extract.
A family of cysteine proteases known as the caspases is believed to play a central role in mediating various apoptotic responses. Activation of the caspase cascade is an integral event in the apoptotic pathway. Apoptotic caspases can be divided into two classes: initiator and executioner caspases. Initiator caspases (caspase-2,caspase-8 and caspase-9) are the apical caspases in apoptosis signaling cascades and their activation is normally required for executioner caspase (caspase-3, caspase-6 and caspase-7) activation.
Human caspase-8 and caspase-9 are involved in initiating apoptosis through two different signalling mechanisms and are known as initiator caspases. Activation of these caspases occurs before activation of caspases-3 and -7. They cleave pro-caspases-3 and -7 to activate them and commit cells to apoptotic death. Caspase-3, -6, and -7 are thought to coordinate the execution phase of apoptosis by cleaving multiple structural and repair proteins .
Caspases-8 and -9 are considered early indicators of apoptosis. They are each involved in a specific pathway in response to stimuli to the cell that causes programmed cell death. Caspase-9 is a marker for the intrinsic or mitochondrial pathwayfor apoptosis. Caspase-8 is an indicator that the extrinsic pathway to apoptosis has been activated. Caspase-Glo-3/7 is a general indicator of apoptosis. In this study, HT-29 cells were treated with 86.68 } 0.73 lg/ml (IC50) of WTE incubated for different time periods to investigate the caspase activity and the possible mechanism of action.
The Caspase-Glo-3/7 assay targets both caspase-3 and caspase-7, as they recognize the same peptide for cleavage and the substrate in the kit is a peptide that becomes luminescent on cleavage. These caspases are both considered to be markers of when a cell is committed to apoptosis. The Caspase-Glo-8 and -9 assays were used to determine which pathway was triggered by treatment of the tumourigenic cell line, HT-29, with the white tea extract.
The activity of caspases-3/7, -8 and -9 in HT-29 cells treated with the white tea extract (hot water) is shown in Fig. 2. The activity of each of the caspases increased with respect to the number of cells undergoing apoptosis in the experiment. The extracts increased the activities of caspase-3/7, -8 and -9 activities up to 16 h incubation time and then decreased after 24 and 48 h. The expression levels of caspase-3/7, -8, and -9 in treated cells showed the highest activities at 16 h, increasing by 2.8, 2.4 and 6.08-fold, respectively, as compared to levels in untreated cells. These increases were only significant up to 24 h incubation and then decreased after 48 h, except for the activity of caspase 9, which was significantly higher than untreated cells even after 48 h incubation (p < 0.01). The diminished activity of initiator caspases-8 and -9 after 16 h treatment is possibly due to the activation of other cascades related to apoptosis.
The activity of caspase-3/7 in treated cells was highly significant when compared to the untreated cells (p < 0.01). The results showed that the extract was able to induce apoptosis by activation of caspase-3/7 (Fig. 2A). Caspases-8 (Fig. 2B) and -9 (Fig. 2C) showed significantly higher activity in treated cells when compared with the untreated cells. This suggests that the treatments induced apoptosis via death receptors through activation of caspase-8 and also the mitochondrial pathway by activating caspase-9.
Activated caspase-8 and -9 may then have resulted in the serial initiation and activation of the caspase cascade that eventually led to activation of caspase-3 that in turn cleaved cytoskeletal proteins, activated DNAse and caused cell death by apoptosis.
The cytotoxic effects and antiproliferative activity of plant compounds against HT-29 by activating caspases and inducing apoptosis have been shown in previous studies. The activation of caspase-3 and -9 in HT-29 cells treated with EGCG (epigallocatechin-3-gallate), a major component in green tea polyphenols, was detected after 12 h treatment, accompanied by mitochondrial transmembrane potential transition and cytochrome c release . It also has been reported that black tea induced tumour cell apoptosis by Bax translocation, loss in mitochondrial transmembrane potential, cytochrome c release and caspase activation. Our results were in line with other studies; our white tea extracts induced apoptosis initiated via the death receptor and also via the mitochondrial apoptotic pathway as demonstrated by increased expression levels of caspases-3, -8 and -9.
Initiator caspases (caspase-8 and caspase-9) are involved in initiating apoptosis in response to stimuli to the cell that causes programmed cell death. In this study cells treated with WTE after 16 h showed the maximum activities of the caspase-8 and caspase-9 as compared to the 24 h and 48 h treatment. Both the death receptor and the mitochondrial pathways are suggested for the mechanism of action of tea extract to induce apoptosis. It was concluded that WTE induced apoptosis via death receptors and mitochondrial pathway by activation of caspase-8 and caspase-9, respectively.
Activation of the initiator caspases lead to activation of executioner caspases (caspases-3 and -7). Activation of caspases-3 and -7 commit cells to apoptotic death. The reduction of the caspase activity after 16 h is possibly due to the increasing number of apoptotic cells on prolonged treatment (24 and 48 h) and the accumulation of dead cell debris which could interfere with the enzyme action. The results of our study suggest that the activation of the caspase pathway triggered apoptosis in HT-29 cells treated with the Silver needle white tea extract.
การแปล กรุณารอสักครู่..
3.8 . การสนับสนุนการศึกษาลักษณะ / 7 - 8 - 9 กิจกรรม
ครอบครัวของซีสเตอีนโปรเตสที่เรียกว่า caspases เชื่อว่ามีบทบาทเป็นศูนย์กลางในการไกล่เกลี่ยในกลุ่มที่มีการตอบสนองต่าง ๆ การกระตุ้นของแคสเปสน้ำตกเป็นเหตุการณ์หนึ่งในเส้นทางที่กลุ่มที่มี . กลุ่มที่มี caspases สามารถแบ่งออกเป็นสองชนชั้น : ริเริ่มและดำเนินการ caspases . ( caspase-2 ริเริ่ม caspases ,และ caspase-8 caspase-9 ) เป็น caspases เกิดในเซลล์ส่งสัญญาณน้ำตกและกระตุ้นของพวกเขาเป็นปกติ เป็นเพชฌฆาตแคสเปส ( การศึกษาลักษณะและการ caspase-6 , caspase-7 ) .
caspase-8 มนุษย์และ caspase-9 เกี่ยวข้องในการเกิดผ่านกลไกที่แตกต่างกันสองสัญญาณ และจะเรียกว่าผู้ caspases .การ caspases เหล่านี้เกิดขึ้นก่อนการเปิดใช้งาน caspases-3 และ - 7 พวกเขายึด pro-caspases-3 และ - 7 เพื่อเปิดใช้งานพวกเขา และยอมรับในกลุ่มที่มีเซลล์ตาย . การศึกษาลักษณะ , - 6 และ 7 มีความคิดที่จะประสานงานการดำเนินการขั้นตอนการตายแบบ apoptosis โดยสามารถหลายโครงสร้างและซ่อมแซมโปรตีน .
caspases-8 และ - 9 ถือเป็นตัวชี้วัดแรกเกิด .พวกเขาแต่ละเกี่ยวข้องในทางที่เฉพาะเจาะจงในการกระตุ้นให้เซลล์ที่ทำให้เกิดการตายของเซลล์ . caspase-9 เป็นเครื่องหมายที่แท้จริง หรือการเกิด pathwayfor . caspase-8 เป็นตัวบ่งชี้ว่า ทางเดินภายนอกจะเกิดได้ถูกเปิดใช้งาน caspase-glo-3 / 7 เป็นตัวบ่งชี้ทั่วไปของการตาย . ในการศึกษานี้ ht-29 เซลล์จะถูกกับ 86.68 ? } 073 LG / ml ( ic50 ) ของ wte บ่มสำหรับช่วงเวลาที่แตกต่างกัน เพื่อศึกษากิจกรรมและกลไกที่เป็นไปได้ของแคสเปสา .
caspase-glo-3 / 7 การทดสอบทั้งสองและเป้าหมายการศึกษาลักษณะ caspase-7 เช่นที่พวกเขารู้จัก เปปไทด์แบบแนวแตกเรียบและพื้นผิวในชุดเป็นเปปไทด์ที่กลายเป็นเรืองแสงบนความแตกแยกcaspases ทั้งคู่ถือว่าเป็นเครื่องหมายของเมื่อเซลล์มีความมุ่งมั่นที่จะเกิด . การ caspase-glo-8 และ - 9 สามารถใช้เพื่อตรวจสอบว่าเส้นทางที่ถูกทริกเกอร์ โดยการรักษาของ tumourigenic เซลล์บรรทัด ht-29 ด้วยสารสกัดชาขาว .
กิจกรรมของ caspases-3 / 7 - 8 - 9 ใน ht-29 เซลล์รักษาด้วยสารสกัดชาขาว ( น้ำร้อน ) ที่แสดงในรูปที่ 2กิจกรรมของแต่ละ caspases เพิ่มขึ้นเกี่ยวกับจำนวนของการเกิด apoptosis ในเซลล์ การทดลอง สารสกัดเพิ่มกิจกรรมของการศึกษาลักษณะ / 7 - 8 - 9 กิจกรรม ถึงเวลาในการบ่ม 16 H แล้วลดลงหลังจาก 24 และ 48 ชั่วโมง ระดับการแสดงออกของการศึกษาลักษณะ / 7 - 8 และ - 9 ในเซลล์ถือว่าแสดงกิจกรรมสูงสุดที่ 16 H , เพิ่มขึ้น 2.8 2.4 และ 5 .08 พับตามลำดับ เมื่อเทียบกับระดับประชากรเซลล์ เพิ่มขึ้นเหล่านี้เท่านั้น ) ขึ้นเพื่อบ่ม 24 ชั่วโมง จากนั้นลดลงหลังจาก 48 ชั่วโมง ยกเว้นเอนไซม์แคสเปส 9 ซึ่งสูงกว่าเซลล์รักษาหลังจาก 48 ชั่วโมงตามลำดับ ( p < 0.01 )การลดกิจกรรมของ caspases-8 ริเริ่ม - 9 หลังจาก 16 ชั่วโมง การรักษาอาจจะเนื่องจากการกระตุ้นของน้ำตกอื่น ๆที่เกี่ยวข้องกับการตาย
กิจกรรมการศึกษาลักษณะ / 7 ในเซลล์ถือว่าสูงเมื่อเทียบกับเซลล์ดิบอย่างมีนัยสำคัญ ( p < 0.01 ) ผลการศึกษาพบว่าสารสกัดสามารถชักนำอะพอพโทซิสโดยการกระตุ้นของการศึกษาลักษณะ / 7 ( รูปที่ 2A ) caspases-8 ( ฟิค2B ) และ 9 ( รูปที่ 2 ) มีกิจกรรมสำคัญในการรักษาเมื่อเทียบกับเซลล์ เซลล์ที่ไม่ได้รับสาร นี้แสดงให้เห็นว่าการเกิด apoptosis ผ่านทางตัวรับการกระตุ้น caspase-8 ผ่านความตายและยังตัด ) โดยการเปิดใช้งาน caspase-9 .
และเปิดใช้งาน caspase-8 - 9 อาจมีผลในการกระตุ้นของแคสเปสอนุกรมและน้ำตกที่ในที่สุดนำไปสู่การกระตุ้นการศึกษาลักษณะที่ในการเปิดเป็นโปรตีนไซโตร กเลตัล , ทำงานตรวจหา ADNase และทำให้การตายของเซลล์โดยเซลล์ .
การต่อเซลล์ และการเกิดอนุมูลอิสระของสารประกอบของพืชที่มีฤทธิ์ต่อต้าน ht-29 โดยการเปิดใช้งาน caspases และกระตุ้นเซลล์ได้รับการแสดงในการศึกษาก่อนหน้านี้ . การศึกษาลักษณะการใช้และ - 9 ใน ht-29 เซลล์ที่ได้รับ EGCG ( epigallocatechin-3-gallate ) เป็นส่วนประกอบหลักในโพลีฟีนชาเขียวถูกตรวจพบหลังจาก 12 ชั่วโมง การรักษามีการเปลี่ยนหัวและศักยภาพมั่ม ปล่อย นอกจากนี้ยังได้รับรายงานว่า ชาดำทำให้เซลล์เกิดเนื้องอก โดย BAX โยกย้าย สูญเสียศักยภาพในการปล่อยยาว , แคสเปสมั่มและเปิดใช้งาน ให้ผลสอดคล้องกับการศึกษาอื่น ๆสารสกัดจากชาขาวกระตุ้น apoptosis ผ่านทางตัวรับเริ่มตายและยังผ่านการเส้นทางที่แสดงให้เห็นโดยเพิ่มขึ้นในกลุ่มที่มีระดับการแสดงออกของ caspases-3 , - 8 - 9
caspases ( caspase-8 ริเริ่ม และ caspase-9 ) มีส่วนร่วมในการเกิดในการตอบสนองต่อสิ่งเร้าให้เซลล์ที่ทำให้เกิดการตายของเซลล์ .ในการศึกษาเซลล์ที่ได้รับ wte หลังจาก 16 ชั่วโมง พบสูงสุดและกิจกรรมของ caspase-8 caspase-9 เมื่อเทียบกับ 24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมงและการรักษา ทั้งความตาย และการรับวิถีจะแนะนำสำหรับกลไกการออกฤทธิ์ของสารสกัดชาเพื่อก่อให้เกิดการตาย .สรุปได้ว่า การเกิดการตาย wte ผ่านตัวรับและทางเดินที่ตัดโดยการกระตุ้นและ caspase-8 caspase-9 ตามลำดับ
การริเริ่ม caspases นำไปสู่การกระตุ้นของเพชฌฆาต caspases ( caspases-3 และ - 7 ) การ caspases-3 และ - 7 ก่อเซลล์ตายในกลุ่มที่มี .การลดลงของแคสเปสกิจกรรมหลังจาก 16 ชั่วโมง อาจจะเนื่องจากการเพิ่มจำนวนเนื้อเยื่อในการรักษานาน 24 และ 48 ชั่วโมง ) และการสะสมของเศษเซลล์ที่ตายแล้วซึ่งอาจรบกวนกับเอนไซม์ การกระทํา ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นของ apoptosis ในเซลล์ ht-29 เรียกแคสเปสทางปฏิบัติ ด้วยสารสกัดจากใบชาขาวเข็มเงิน
ครอบครัวของซีสเตอีนโปรเตสที่เรียกว่า caspases เชื่อว่ามีบทบาทเป็นศูนย์กลางในการไกล่เกลี่ยในกลุ่มที่มีการตอบสนองต่าง ๆ การกระตุ้นของแคสเปสน้ำตกเป็นเหตุการณ์หนึ่งในเส้นทางที่กลุ่มที่มี . กลุ่มที่มี caspases สามารถแบ่งออกเป็นสองชนชั้น : ริเริ่มและดำเนินการ caspases . ( caspase-2 ริเริ่ม caspases ,และ caspase-8 caspase-9 ) เป็น caspases เกิดในเซลล์ส่งสัญญาณน้ำตกและกระตุ้นของพวกเขาเป็นปกติ เป็นเพชฌฆาตแคสเปส ( การศึกษาลักษณะและการ caspase-6 , caspase-7 ) .
caspase-8 มนุษย์และ caspase-9 เกี่ยวข้องในการเกิดผ่านกลไกที่แตกต่างกันสองสัญญาณ และจะเรียกว่าผู้ caspases .การ caspases เหล่านี้เกิดขึ้นก่อนการเปิดใช้งาน caspases-3 และ - 7 พวกเขายึด pro-caspases-3 และ - 7 เพื่อเปิดใช้งานพวกเขา และยอมรับในกลุ่มที่มีเซลล์ตาย . การศึกษาลักษณะ , - 6 และ 7 มีความคิดที่จะประสานงานการดำเนินการขั้นตอนการตายแบบ apoptosis โดยสามารถหลายโครงสร้างและซ่อมแซมโปรตีน .
caspases-8 และ - 9 ถือเป็นตัวชี้วัดแรกเกิด .พวกเขาแต่ละเกี่ยวข้องในทางที่เฉพาะเจาะจงในการกระตุ้นให้เซลล์ที่ทำให้เกิดการตายของเซลล์ . caspase-9 เป็นเครื่องหมายที่แท้จริง หรือการเกิด pathwayfor . caspase-8 เป็นตัวบ่งชี้ว่า ทางเดินภายนอกจะเกิดได้ถูกเปิดใช้งาน caspase-glo-3 / 7 เป็นตัวบ่งชี้ทั่วไปของการตาย . ในการศึกษานี้ ht-29 เซลล์จะถูกกับ 86.68 ? } 073 LG / ml ( ic50 ) ของ wte บ่มสำหรับช่วงเวลาที่แตกต่างกัน เพื่อศึกษากิจกรรมและกลไกที่เป็นไปได้ของแคสเปสา .
caspase-glo-3 / 7 การทดสอบทั้งสองและเป้าหมายการศึกษาลักษณะ caspase-7 เช่นที่พวกเขารู้จัก เปปไทด์แบบแนวแตกเรียบและพื้นผิวในชุดเป็นเปปไทด์ที่กลายเป็นเรืองแสงบนความแตกแยกcaspases ทั้งคู่ถือว่าเป็นเครื่องหมายของเมื่อเซลล์มีความมุ่งมั่นที่จะเกิด . การ caspase-glo-8 และ - 9 สามารถใช้เพื่อตรวจสอบว่าเส้นทางที่ถูกทริกเกอร์ โดยการรักษาของ tumourigenic เซลล์บรรทัด ht-29 ด้วยสารสกัดชาขาว .
กิจกรรมของ caspases-3 / 7 - 8 - 9 ใน ht-29 เซลล์รักษาด้วยสารสกัดชาขาว ( น้ำร้อน ) ที่แสดงในรูปที่ 2กิจกรรมของแต่ละ caspases เพิ่มขึ้นเกี่ยวกับจำนวนของการเกิด apoptosis ในเซลล์ การทดลอง สารสกัดเพิ่มกิจกรรมของการศึกษาลักษณะ / 7 - 8 - 9 กิจกรรม ถึงเวลาในการบ่ม 16 H แล้วลดลงหลังจาก 24 และ 48 ชั่วโมง ระดับการแสดงออกของการศึกษาลักษณะ / 7 - 8 และ - 9 ในเซลล์ถือว่าแสดงกิจกรรมสูงสุดที่ 16 H , เพิ่มขึ้น 2.8 2.4 และ 5 .08 พับตามลำดับ เมื่อเทียบกับระดับประชากรเซลล์ เพิ่มขึ้นเหล่านี้เท่านั้น ) ขึ้นเพื่อบ่ม 24 ชั่วโมง จากนั้นลดลงหลังจาก 48 ชั่วโมง ยกเว้นเอนไซม์แคสเปส 9 ซึ่งสูงกว่าเซลล์รักษาหลังจาก 48 ชั่วโมงตามลำดับ ( p < 0.01 )การลดกิจกรรมของ caspases-8 ริเริ่ม - 9 หลังจาก 16 ชั่วโมง การรักษาอาจจะเนื่องจากการกระตุ้นของน้ำตกอื่น ๆที่เกี่ยวข้องกับการตาย
กิจกรรมการศึกษาลักษณะ / 7 ในเซลล์ถือว่าสูงเมื่อเทียบกับเซลล์ดิบอย่างมีนัยสำคัญ ( p < 0.01 ) ผลการศึกษาพบว่าสารสกัดสามารถชักนำอะพอพโทซิสโดยการกระตุ้นของการศึกษาลักษณะ / 7 ( รูปที่ 2A ) caspases-8 ( ฟิค2B ) และ 9 ( รูปที่ 2 ) มีกิจกรรมสำคัญในการรักษาเมื่อเทียบกับเซลล์ เซลล์ที่ไม่ได้รับสาร นี้แสดงให้เห็นว่าการเกิด apoptosis ผ่านทางตัวรับการกระตุ้น caspase-8 ผ่านความตายและยังตัด ) โดยการเปิดใช้งาน caspase-9 .
และเปิดใช้งาน caspase-8 - 9 อาจมีผลในการกระตุ้นของแคสเปสอนุกรมและน้ำตกที่ในที่สุดนำไปสู่การกระตุ้นการศึกษาลักษณะที่ในการเปิดเป็นโปรตีนไซโตร กเลตัล , ทำงานตรวจหา ADNase และทำให้การตายของเซลล์โดยเซลล์ .
การต่อเซลล์ และการเกิดอนุมูลอิสระของสารประกอบของพืชที่มีฤทธิ์ต่อต้าน ht-29 โดยการเปิดใช้งาน caspases และกระตุ้นเซลล์ได้รับการแสดงในการศึกษาก่อนหน้านี้ . การศึกษาลักษณะการใช้และ - 9 ใน ht-29 เซลล์ที่ได้รับ EGCG ( epigallocatechin-3-gallate ) เป็นส่วนประกอบหลักในโพลีฟีนชาเขียวถูกตรวจพบหลังจาก 12 ชั่วโมง การรักษามีการเปลี่ยนหัวและศักยภาพมั่ม ปล่อย นอกจากนี้ยังได้รับรายงานว่า ชาดำทำให้เซลล์เกิดเนื้องอก โดย BAX โยกย้าย สูญเสียศักยภาพในการปล่อยยาว , แคสเปสมั่มและเปิดใช้งาน ให้ผลสอดคล้องกับการศึกษาอื่น ๆสารสกัดจากชาขาวกระตุ้น apoptosis ผ่านทางตัวรับเริ่มตายและยังผ่านการเส้นทางที่แสดงให้เห็นโดยเพิ่มขึ้นในกลุ่มที่มีระดับการแสดงออกของ caspases-3 , - 8 - 9
caspases ( caspase-8 ริเริ่ม และ caspase-9 ) มีส่วนร่วมในการเกิดในการตอบสนองต่อสิ่งเร้าให้เซลล์ที่ทำให้เกิดการตายของเซลล์ .ในการศึกษาเซลล์ที่ได้รับ wte หลังจาก 16 ชั่วโมง พบสูงสุดและกิจกรรมของ caspase-8 caspase-9 เมื่อเทียบกับ 24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมงและการรักษา ทั้งความตาย และการรับวิถีจะแนะนำสำหรับกลไกการออกฤทธิ์ของสารสกัดชาเพื่อก่อให้เกิดการตาย .สรุปได้ว่า การเกิดการตาย wte ผ่านตัวรับและทางเดินที่ตัดโดยการกระตุ้นและ caspase-8 caspase-9 ตามลำดับ
การริเริ่ม caspases นำไปสู่การกระตุ้นของเพชฌฆาต caspases ( caspases-3 และ - 7 ) การ caspases-3 และ - 7 ก่อเซลล์ตายในกลุ่มที่มี .การลดลงของแคสเปสกิจกรรมหลังจาก 16 ชั่วโมง อาจจะเนื่องจากการเพิ่มจำนวนเนื้อเยื่อในการรักษานาน 24 และ 48 ชั่วโมง ) และการสะสมของเศษเซลล์ที่ตายแล้วซึ่งอาจรบกวนกับเอนไซม์ การกระทํา ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นของ apoptosis ในเซลล์ ht-29 เรียกแคสเปสทางปฏิบัติ ด้วยสารสกัดจากใบชาขาวเข็มเงิน
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- ผู้ชายนั่งเล่นคอมพิวเตอร์กับผู้หญิงถือบั
- ฉันอยากให้คุณมาเที่ยวประเทศไทย
- Sen nasıl istersen öyle olsun
- ฉันพึ่งเลิกเรียน
- หลังจากนั้นไม่นานแดงก็ได้รู้ช่าวว่าบ้านเ
- ฉันอยากถามพวกคุณว่า ใครหรือที่ใช้ชื่อนี้
- and my homework, i make copy from the bo
- you no like face I you like AH Be Be you
- คุณชื่ออะไร
- ขออนุญาติ เชิญขึ้นห้อง
- รองเท้าผ้าใบ
- แล้วอีกตัวหนึ่งล่ะ
- ไม่มีอะไร
- Please note that the management meeting
- interesting
- 으
- Heaven voice saying tht Anne & Nino look
- I buy same medicine you are take
- Freezing Rain happens when precipitation
- supposed
- มาม่า
- 5. Development Trend
- various
- ไม่แน่ใจสำหรับคุณอาจจะรสจัดเกินไป
