2.6. Isoenzyme analysisTotal intrac

2.6. Isoenzyme analysis
Total intracellular protein was extracted from parental and hybrid strains
growing in complete medium. Mycelia were resuspended in 3mL buffer (0.1M
Trizma-base, 33mg NADP, 1.2mM EDTA). Cells were frozen using liquid nitrogen,
thawed at 37◦C, and ground in a mortar. Cell debris was removed by centrifugation
at 10,000rpm for 20min at 4 ◦C. Protein extracts were lyophilized and stored at
−20 ◦C until used. Total protein content of the lysate was determined by the Bradford
method [15]. 20g of protein were resolved on a vertical 7.5% SDS-PAGE for 4 h
at 100V. Alkaline and acid phosphatases in the gel were stained according to the
method described by Shaw and Prasad [16]. Briefly, after electrophoresis, the gels
were incubated in a staining solution for acid phosphatase [90mL Tris–HCl buffer
(pH 5.8), 1mL of 0.2MMgCl2, 100mg -naphthyl acetate, 1mL Fast Garnet GBC Base
solution], or for alkaline phosphatase staining [90mL of 0.1M Tris–HCl buffer (pH
8.1), 100mg -naphthyl phosphate sodium salt, 100mg Fast Blue RR salt, 1mL of
0.2MMgCl2, 150mg MgSO4] for 2 h at 37 ◦C. The gels were then distained in a 1:2:1
(v/v) solution of methanol:distilled water:acetic acid.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6. isoenzyme วิเคราะห์โปรตีนรวม intracellular ถูกแยกจากผู้ปกครอง และสายพันธุ์ผสมเจริญเติบโตสมบูรณ์ปานกลาง Mycelia ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ 3mL (0.1MTrizma-base, 33 มิลลิกรัม NADP, 1.2 mM EDTA) เซลล์ที่ถูกแช่แข็งโดยใช้ไนโตรเจนเหลวthawed ที่ 37◦C และพื้นในครก เศษเซลล์ถูกเอาออก โดย centrifugationที่ 10000 รอบต่อนาทีสำหรับ 20 นาทีที่ 4 ◦C สารสกัดจากโปรตีน lyophilized และเก็บไว้ที่−20 ◦C จนใช้ รวมโปรตีนของ lysate ที่ถูกตามแบรดฟอร์ดวิธี [15] 20 กรัมของโปรตีนได้รับการแก้ไขในแนวตั้ง 7.5% SDS-หน้า 4 hที่ 100V ด่าง และกรด phosphatases ในเจได้สีตามต้องการวิธีอธิบาย โดย Shaw และโกอี [16] หลังจาก electrophoresis เจสั้น ๆมี incubated ในโซลูชัน staining สำหรับกรดฟอสฟาเตส [90 มลตรี – HCl บัฟเฟอร์(pH 5.8), 1mL ของ 0.2MMgCl2, 100mg - naphthyl acetate, 1mL ฐาน GBC โกเมนอย่างรวดเร็วโซลูชัน], หรืออัลคาไลน์ฟอสฟาเตสที่ย้อมสี [90 มิลลิลิตร 0.1 M HCl – ทริสเรทติ้งบัฟเฟอร์ (pH8.1), 100 mg - naphthyl ฟอสเฟตโซเดียมเกลือ เกลือเร็วบลู RR 100 มิลลิกรัม 1 mL ของ0.2MMgCl2, MgSO4 150 mg] สำหรับ h 2 ที่ 37 ◦C เจถูกหยามแล้วใน 1:2:1โซลูชั่น (v/v) ของเมทานอล: น้ำกลั่น: กรดอะซิติก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 การวิเคราะห์ Isoenzyme
โปรตีนภายในทั้งหมดถูกสกัดจากสายพันธุ์ของผู้ปกครองและไฮบริด
ที่เพิ่มขึ้นในระยะกลางที่สมบูรณ์ เส้นใยถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ 3 mL (0.1M
Trizma ฐาน NADP 33mg, 1.2 มม EDTA) เซลล์ที่ถูกแช่แข็งโดยใช้ไนโตรเจนเหลว
ละลายที่37◦Cและพื้นดินในครก เศษของเซลล์ถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยง
ที่ 10000 สำหรับ 20 นาทีที่ 4 ◦C สารสกัดจากโปรตีนถูกแห้งและเก็บไว้ที่
-20 ◦Cจนกว่าจะใช้ ปริมาณโปรตีนรวม lysate ถูกกำหนดโดย Bradford
วิธี [15] 20? กรัมของโปรตีนที่มีการแก้ไขในแนวดิ่ง 7.5% SDS-PAGE 4 ชั่วโมง
ที่ 100V อัลคาไลน์และ phosphatases กรดในเจลมีการย้อมให้เป็นไปตาม
วิธีการอธิบายโดยชอว์และปรา [16] สั้น ๆ หลังจาก electrophoresis เจล
ถูกบ่มในการแก้ปัญหาการย้อมสีสำหรับ phosphatase กรด [90mL บัฟเฟอร์ Tris-HCl
(pH 5.8) 1 มลของ 0.2MMgCl2, 100mg? acetate -naphthyl, โกเมน 1 มลรวดเร็ว GBC ฐาน
แก้ปัญหา] หรือด่าง phosphatase การย้อมสี [90mL ของ 0.1M บัฟเฟอร์ Tris-HCl (pH
8.1) 100mg? เกลือโซเดียมฟอสเฟต -naphthyl, 100mg รวดเร็วเกลือ RR สีฟ้า 1 มลของ
0.2MMgCl2, 150mg MgSO4] เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ◦C เจลถูก distained แล้วใน 1: 2: 1
(v / v) การแก้ปัญหาของเมทานอล: น้ำกลั่น: กรดอะซิติก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 การวิเคราะห์โปรตีนทั้งหมดภายในเซลล์
ไอโซเอนไซม์สกัดจากผู้ปกครอง และลูกผสมสายพันธุ์
เติบโตในระดับปานกลางที่สมบูรณ์ เส้นใยในม. resuspended บัฟเฟอร์ ( 0.1m
trizma ฐาน 33mg nadp 1.2 , EDTA ) เซลล์ที่ถูกแช่แข็งด้วยไนโตรเจนเหลว ละลายที่อุณหภูมิ 37 ◦
C และพื้นดินในปูน เศษเซลล์จะถูกลบออกโดยการเหวี่ยงแยก
ที่ 10000rpm สำหรับ 20 นาทีที่ 4 ◦ Cสารสกัดจากโปรตีน คือโปรตีนและเก็บไว้ที่
− 20 ◦ C จนใช้ ปริมาณโปรตีนรวมของ lysate ถูกกำหนดโดยวิธี Bradford
[ 15 ] 20  กรัมของโปรตีนถูกแก้ไขบน SDS-PAGE 7.5% แนวตั้ง 4 H
ที่ 100V . ด่างและกรดดิในเจลถูกเปรอะเปื้อนตาม
วิธีอธิบายโดยชอว์และประสาท [ 16 ] สั้นๆ หลังจากที่อิเล็กเจล
ถูกบ่มในสารละลายย้อมสีแอซิดฟอสฟาเตส [ 90ml ทริส– HCL
( บัฟเฟอร์ pH 5.8 ) 1ml ของ 0.2mmgcl2 100 มก. ,  - naphthyl acetate , 1ml อย่างรวดเร็วโกเมน GBC ฐาน
โซลูชั่น ] หรืออัลคาไลน์ ฟอสฟาเตสคราบ [ 90ml ของ 0.1m ทริส– HCl บัฟเฟอร์ pH
8.1 ) 100 มก.  - naphthyl ฟอสเฟต โซเดียมเกลือ 100 มก. อย่างรวดเร็วสีฟ้า RR เกลือ 1ml ของ
0.2mmgcl2 150 mg , MgSO4 ใ ] 2 H ที่ 37 ◦ Cเจลแล้ว distained ใน 1:2:1
( v / v ) สารละลายเมทานอล : น้ำ : กรดอะซิติก