2.3. Detection of G-6-PD gene mutations
Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes using DNAzol kit (Invitrogen Corp.). The DNA concentration of each sample was quantified with the GE NanoVue spectrophotometer (AZoNetwork UK Ltd.) and adjusted to 10 ng/μl for RFLP-PCR assays. G-6-PD gene mutations screened were G-6-PD Viangchan (871 G N A) (the most common variant in the Thai population [12]), G-6-PD Mahidol (487 G N A), G-6-PD Canton (1376 C N T), G-6-PD Union (1360 C N T),
G-6-PD Kaiping (1388 G N A), G-6-PD Chinese-4 (392 G N T), G-6-PD Chinese-5 (1024 C N T) and G-6-PD Gaohe (95 A N G). Primers used were as described previously. PCR was performed in a 25 μl reaction mixture containing 1× PCR buffer, 1 U Taq polymerase (Invitrogen Corporation), 20 ng of each primer pair, 1.5 mmol/l MgCl2, 200 μmol/l each dNTP and 50 ng of DNA template. PCR thermocycling (conducted in TProfessional standard thermocycler; Biometra GmbH) conditions were as follows: 95 °C for 5 min; 35 cycles of 95 °C for 60 s, 56–62 °C (depending on Tm of the primer pair) for 45 s and 72 °C for 45 s; and a final step of 72 °C for 5 min. Then 5 μl aliquots of the amplicons were digested with 5 U of the appropriate restriction endonuclease in a 10 μl reaction volume at 37 °C for 3 h. A 5 μl aliquot from each of the reaction mixture was analyzed by 3% agarose gel-electrophoresis, and the DNA fragments were stained with ethidium bromide and visualized under UV light.
2.3. การตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน G-6-PDดีเอ็นเอการถูกแยกจากเลือดหญิงใช้ชุด DNAzol (Invitrogen Corp.) ความเข้มข้นของดีเอ็นเอของแต่ละอย่างถูกวัด ด้วย spectrophotometer GE NanoVue (AZoNetwork UK จำกัด) และปรับเป็น 10 ฉบับ/μl สำหรับ RFLP-PCR assays กลายพันธุ์ของยีน G-6-PD ฉายถูก G-6-PD เวียงจันทน์ (871 G N A) (แบบทั่วไปตัวแปรในประชากรไทย [12]), G-6-PD มหิดล (487 G N A), G-6-PD Canton (1376 C N T) G-6-PD สหภาพ (1360 C N T),ไคผิง G-6-PD (1388 G N A), G-6-PD จีน-4 (392 G N T), G-6-PD จีน-5 (1024 C N T) และ G-6-PD Gaohe (95 N G) ไพรเมอร์ที่ใช้ได้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ทำ PCR ในปฏิกิริยา 25 μl ที่ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ PCR × 1, 1 U Taq พอลิเมอเรส (Invitrogen Corporation), 20 ฉบับของแต่ละคู่ไพรเมอร์ 1.5 mmol/l MgCl2, 200 ไมโครโมล/ลิตรละ dNTP และ 50 ฉบับของดีเอ็นเอแม่แบบ เทอร์โม゚ PCR (ดำเนินการใน TProfessional มาตรฐาน thermocycler Biometra GmbH) เงื่อนไขมีดังนี้: 95 ° C เป็นเวลา 5 นาที รอบ 35 95 ° c 60 s, 56-62 ° C (ขึ้นอยู่กับ Tm ของคู่ไพรเมอร์) สำหรับ s และ 72 ° C สำหรับ 45 45 s และขั้นสุดท้ายของ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที แล้ว 5 aliquots μl ของ amplicons ถูกย่อยสลาย ด้วย 5 U ของ endonuclease จำกัดที่เหมาะสมในโวลุ่มปฏิกิริยา μl 10 ที่ 37 ° C เป็นเวลา 3 ชม Μl 5 ทั้งจากของผสมปฏิกิริยาถูกวิเคราะห์ โดย 3% agarose เจอิ และชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกย้อม ด้วยโบรไมด์ ethidium ดู และภายใต้แสงยูวี
การแปล กรุณารอสักครู่..