2.2. Phage isolation and purificati

2.2. Phage isolation and purification
Three phages (VP-1, VP-2 and VP-3) were isolated from marine
water samples (salinity 18–21; pH 7.6–7.7) of a semi-intensive aquaculture
(earthen pond aquaculture system Corte das Freiras located in
the estuarine system Ria de Aveiro, latitude: 40°37′51.44″N, longitude
8°40′31.75″W, on the north-western coast of Portugal) using
V. parahaemolyticus as host. Five hundred milliliters of water were filtered
sequentially by 3 μm and then by 0.45 μm pore-size polycarbonate
membranes (Millipore, Billerica, USA). Filtered water was added to
500 mL of TSB with double concentration and to 1 mL of bacterial culture.
The mixture was incubated at 25 °C for 18 h at 80 rpm, and then
filtered through a 0.45 μm membrane. The presence/absence of the bacteriophage
was verified through the spot test (Vieira et al., 2012). Thirty
microliters of the resulting filtrate were inoculated into TSA growth medium
previously inoculated with the bacterial culture. The plates were
incubated at 37 °C for 4–12 h and inspected for zones of clearing. Three
successive single-plaque isolations were performed to obtain a pure
phage stock. All lysates were centrifuged at 10,000 g for 10 min at 4 °C,
to remove intact bacteria and bacterial debris. The phage stocks were
stored at 4 °C and 1% chloroform (Scharlau, Spain) was added. The
phage suspension titer was determined by the double-layer agarmethod
using TSA as culture medium (Adams, 1959). The plates were incubated
at 37 °C for 4–8 h and the number of plaques was counted. The results
were expressed as plaque forming units per milliliter (PFU mL−1).
2.3. Host range determination and efficiency of phage infection
The spot test was performed with the twelve bacteria to assess the
bacterial susceptibility to the bacteriophage (Vieira et al., 2012). The
plates were incubated at 37 °C for 4–12 h. The efficiency of plating
was determined for the bacteria with positive spot tests (occurrence
of a lysis zone) by the double-layer agar method using TSA as culture
medium. Efficacy of plating for each host was calculated by comparison
with an efficacy of 100% for the V. parahaemolyticus bacterium. For each
phage, three independent experiments were done and the results were
presented as the average of the three assays.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. phage แยกและทำให้บริสุทธิ์Phages 3 (VP-1, VP-2 และ VP 3) ถูกแยกจากน้ำตัวอย่างน้ำ (เค็ม 18 – 21; pH 7.6-7.7) ของสัตว์น้ำกึ่งเร่งรัด(เป็นบ่อเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำระบบ Corte das Freiras อยู่ในระบบขีด Aveiro เดเรีย ละติจูด: 37′51 องศา 40. 44″N ลองจิจูด8 ° 40′31. 75″W บนชายฝั่งตะวันตกเหนือของโปรตุเกส) ใช้V. parahaemolyticus เป็นโฮสต์ Milliliters ห้าร้อยน้ำถูกกรองตามลำดับ โดย 3 μm และขนาดรูพรุน 0.45 μm โพลีคาร์บอนเนตเข้า (มาก Billerica สหรัฐอเมริกา) มีเพิ่มน้ำที่กรองแล้วขนาด 500 มล.ของ TSB มีสองความเข้มข้น และ 1 มิลลิลิตรของแบคทีเรียส่วนผสมคือ incubated ที่ 25 ° C สำหรับ h 18 ที่ 80 รอบต่อนาที และกรองผ่านเยื่อ 0.45 μm สถานะ/ขาดการแบคทีมีการตรวจสอบผ่านการทดสอบจุด (Vieira et al., 2012) สามสิบmicroliters ของสารกรองได้ถูก inoculated ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ TSAก่อนหน้านี้ inoculated มีวัฒนธรรมเชื้อแบคทีเรีย แผ่นได้incubated ที่ 37 ° C สำหรับ h 4 – 12 และตรวจสอบสำหรับโซนหัก สามดำเนิน isolations หินปูนเดียวต่อเนื่องเพื่อให้ได้ความบริสุทธิ์phage หุ้น มี centrifuged lysates ทั้งหมดที่ g 10000 สำหรับที่ 4 ° C, 10 นาทีเอาเหมือนเดิมแบคทีเรียและแบคทีเรียเศษ มีหุ้น phageเก็บ ที่ 4 ° C และ 1% คลอโรฟอร์ม (Scharlau สเปน) ถูกเพิ่ม ที่titer ระงับ phage ถูกกำหนด โดย agarmethod ชั้นสองใช้ TSA เป็นสื่อวัฒนธรรม (Adams, 1959) แผ่นที่ incubatedที่ 37 ° C h 4 – 8 และจำนวน plaques ที่นับ ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นหินปูนขึ้นรูปหน่วยละ milliliter (PFU mL−1)2.3 การจัดกำหนดช่วงและประสิทธิภาพของเชื้อ phageทำการทดสอบจุด ด้วยแบคทีเรียสิบสองเพื่อประเมินการง่ายแบคที (Vieira et al., 2012) แบคทีเรีย ที่แผ่นก็ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ h 4-12 ประสิทธิภาพของการชุบกำหนดสำหรับแบคทีเรียที่ มีทดสอบจุดบวก (เกิดขึ้นของโซน lysis) โดยวิธี agar ชั้นสองใช้ TSA เป็นวัฒนธรรมสื่อ ประสิทธิภาพของการชุบสำหรับแต่ละโฮสต์ถูกคำนวณโดยการเปรียบเทียบมีการศึกษาประสิทธิภาพ 100% สำหรับการ V. parahaemolyticus แบคทีเรีย สำหรับแต่ละphage อิสระสามการทดลองทำ และได้ผลนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ยของ assays สาม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ ฟาจ ( vp-1
3 , และ vp-2 vp-3 ) ที่แยกได้จากตัวอย่างน้ำ ทะเล
( ความเค็ม 18 – 21 ; pH 7.6 ( 7.7 ) ของกึ่งเข้มข้น การเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ
( บ่อดินเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำระบบ Corte Das Freiras ตั้งอยู่ในระบบน้ำเค็ม Ria de Aveiro
ละติจูด 40 องศา 37 ณิตคิดเป็นร้อยละเท่ากับ 51.44 นั้นบอกว่า N เส้นแวง
8 ° 40 ’ 31.75 เพลง W , บนชายฝั่งตะวันตกเฉียงเหนือของโปรตุเกส ) โดยใช้
Vเริ่มต้เป็นเจ้าภาพ 500 มิลลิลิตรของน้ำกรอง
ตามลำดับ 3 μ M แล้ว โดยสามารถμ M ขนาดรูแผ่นโพลีคาร์บอเนต
( มิลลิ , ประเทศสหรัฐอเมริกา , อเมริกา ) น้ำกรองเพิ่ม

500 มล. ของ TSB กับสมาธิคู่และ 1 มิลลิลิตรแบคทีเรีย .
ส่วนผสมมีอุณหภูมิ 25 ° C 18 H ที่ 80 รอบต่อนาที แล้วกรองผ่าน 0.45 m
μเมมเบรนการมี / ไม่มีของแบคเทอริโอเฟจ
ยืนยันผ่านจุดทดสอบ ( วิเอร่า et al . , 2012 ) สามสิบ
ตัวเลขของผลจากการปลูกเชื้อลงในสื่อ TSA
ก่อนหน้านี้ใส่ แบคทีเรีย . จานบ่มที่ 37 ° C )
4 – 12 ชั่วโมงและการตรวจสอบโซนล้าง 3
ต่อเนื่องเดียวจุลินทรีย์ isolations มีการปฏิบัติเพื่อให้ได้เพียว
ว่าหุ้น ทั้งหมด lysates เป็นระดับที่ 10 , 000 G สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ° C ,
ลบแบคทีเรียแบคทีเรียเหมือนเดิมและเศษ ว่าหุ้น
เก็บไว้ที่ 4 ° C และ 1 % คลอโรฟอร์ม ( scharlau , สเปน ) ถูกเพิ่มเข้ามา
ว่าช่วงล่างอิสระถูกกำหนดจากหลากหลาย agarmethod
ใช้เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อ TSA ( อดัมส์ , 1959 ) จานถูกบ่ม
ที่ 37 ° C 4 – 8 H และหมายเลขของโล่เป็นนับ ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นรูป
หน่วยต่อมิลลิลิตรจุลินทรีย์ ( พีเอฟยู ml − 1 ) .
2.3 การกำหนดช่วงของโฮสต์และประสิทธิภาพของเฟจการติดเชื้อ
จุดทดสอบการปฏิบัติกับสิบสองแบคทีเรียเพื่อประเมินความไวต่อแบคทีริโอเฟจแบคทีเรีย
( วิเอร่า et al . , 2012 )
แผ่นถูกบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 4 - 12 ชั่วโมงประสิทธิภาพของชุบ
ตั้งใจสำหรับแบคทีเรียด้วยการทดสอบจุดบวก ( เกิดการสลาย
ของโซน ) โดยวิธีการใช้ Layer วุ้นอาหารเลี้ยงเชื้อ TSA เป็น

ประสิทธิภาพของชุบแต่ละโฮสต์ที่ถูกคำนวณโดยการเปรียบเทียบกับผลของ
100% สำหรับเชื้อ V . parahaemolyticus . สำหรับแต่ละ
ฟา สามการทดลองอิสระ ทำและผลลัพธ์ที่ได้
นำเสนอเป็นค่าเฉลี่ยของทั้งสามวิธี .