Materials and methodsIsolation of x

Materials and methods
Isolation of xylose assimilation yeast strains
Yeast strains were isolated from different natural
sources, including flowers, fruits, wood, and soil,
obtained from the Kyoto area in Japan (approximately
100 samples in total). The samples were collected in
sterilized polypropylene bottles of 15 mL capacity (Becton
Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) and suspended
in 10 mL of SX liquid medium (3% xylose and 0.67%
YNB without amino acid; Difco, Detroit, MI, USA) containing
chloramphenicol at a concentration of 100 μg/
mL. The samples were cultivated for 4 days at 30°C in
static culture with the lids slightly opened. Aliquots (200
μL) of the culture supernatants were spread onto SX
agar medium and incubated aerobically at 30°C for 3
days. Yeasts were purified using single-colony isolation.
The yeast strains were routinely maintained on YPD
agar plates (2% glucose, 2% peptone [Difco], 1% yeast extract
[Difco] and 1.5% agar) and grown at 30°C. YPX
medium (4% xylose, 2% peptone [Difco] and 1% yeast
extract [Difco]) was used for the screening of xylosefermenting
yeast.




Selection of xylose-fermenting yeast with
thermotolerance
Prior to the fermentation experiments, strain ATY839
was inoculated into 3 mL of YPD medium in test tubes
and incubated overnight at 30°C with reciprocal shaking
at 150 opm (preculture). The preculture was suspended
to 25 mL of synthetic glucose (SG) medium (2% glucose
and 0.67% YNB without amino acid) or synthetic xylose
(SX) medium (2% xylose and 0.67% YNB without amino
acid) in a 50 mL Erlenmeyer flask to a cell optical density
of 0.1 at 600 nm (OD600) and then cultured at 35°C,
37°C, 38°C, or 39°C for 48 h at 120 rpm. Sugars and
ethanol concentrations of the culture supernatants were
determined by following the procedures detailed below.
Cell growth was determined at OD600 using a spectrophotometer.
All experiments were performed in
triplicate.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ
แยก xylose ผสมยีสต์
ยีสต์ที่แยกจากธรรมชาติแตกต่าง
แหล่ง ดอกไม้ ผลไม้ ไม้ ดิน และ
รับจากพื้นที่เกียวโตประเทศญี่ปุ่น (ประมาณ
100 ตัวอย่างรวม) ตัวอย่างถูกเก็บรวบรวมใน
sterilized polypropylene ขวดความจุ 15 มล. (Becton
สัน แฟรงคลินทะเลสาบ NJ สหรัฐอเมริกา) และระงับ
ใน 10 mL ของ SX ขนาดกลางของเหลว (xylose 3% และ 0.67%
YNB โดยที่กรดอะมิโน Difco ดีทรอยต์ MI สหรัฐอเมริกา) ประกอบด้วย
chloramphenicol ที่ความเข้มข้นของ 100 μg /
mL ตัวอย่างดีปลูกมา 4 วันที่ 30° C ใน
วัฒนธรรมคง มีฝาที่เปิดเล็กน้อย Aliquots (200
μL) ของวัฒนธรรม supernatants ถูกแพร่กระจายไป SX
agar กลาง และ incubated aerobically ที่ 30° C สำหรับ 3
วัน Yeasts ได้บริสุทธิ์ที่ใช้แยกโคโลนีเดียวกัน
ยีสต์มีอยู่เป็นประจำใน YPD
แผ่น agar (กลูโคส 2% สารสกัดจากยีสต์ 1%, 2% peptone [Difco]
[Difco] และ 1.5% agar) และเติบโตที่ 30 องศาเซลเซียส YPX
ปานกลาง (xylose 4%, 2% peptone [Difco] และยีสต์ 1%
แยก [Difco]) ใช้สำหรับคัดกรองของ xylosefermenting
ยีสต์


เลือก xylose fermenting ยีสต์กับ
thermotolerance
ก่อนทดลองหมัก สายพันธุ์ ATY839
ถูก inoculated เป็น 3 mL ของกลาง YPD ในหลอดทดสอบ
และค้างคืนที่ 30 ° C ด้วยกันและเขย่า incubated
ที่ 150 แผ่น/นาที (preculture) Preculture ที่ถูกระงับ
ไป 25 mL ของน้ำตาลกลูโคสที่สังเคราะห์ (SG) กลาง (กลูโคส 2%
0.67% และ YNB ไม่ มีกรดอะมิโน) หรือกลาง xylose
(SX) สังเคราะห์ (0.67% และ 2% xylose YNB โดยอะมิโน
กรด) ใน 50 มล Erlenmeyer หนาวเพื่อความหนาแน่นออปติคอลเซลล์
ของ 0.1 ที่ 600 nm (OD600) แล้ว อ่างที่ 35 ° C,
37 ° C, 38 ° C หรือ 39 ° C สำหรับ h 48 ที่ 120 รอบต่อนาที น้ำตาล และ
เอทานอลความเข้มข้นของ supernatants วัฒนธรรมถูก
ตามรายละเอียดด้านล่างตอน.
กำหนดเซลล์เจริญเติบโตที่ OD600 โดยใช้เครื่องทดสอบกรดด่าง
ดำเนินการทดลองทั้งหมดใน
triplicate

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธี
การแยกไซโลดูดซึมยีสต์สายพันธุ์
ยีสต์สายพันธุ์ที่แยกได้จากธรรมชาติที่แตกต่างกัน
แหล่งที่มารวมทั้งดอกไม้, ผลไม้, ไม้และดิน
ที่ได้จากพื้นที่ในเกียวโตประเทศญี่ปุ่น (ประมาณ
100 ตัวอย่างทั้งหมด) กลุ่มตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ใน
ขวดฆ่าเชื้อโพรพิลีนของความจุ 15 มิลลิลิตร (Becton
ดิกคินสัน, แฟรงคลินส์, นิวเจอร์ซีย์, สหรัฐอเมริกา) และการสนับสนุน
ใน 10 มิลลิลิตร SX เหลว (ไซโล 3% และ 0.67%
YNB ไม่มีกรดอะมิโน; Difco, ดีทรอยต์, มิชิแกน, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ที่มี
chloramphenicol ที่ความเข้มข้น 100 ไมโครกรัม /
มิลลิลิตร กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการเพาะปลูกเป็นเวลา 4 วันที่ 30 ° C ใน
วัฒนธรรมแบบคงที่มีฝาปิดเปิดเล็กน้อย aliquots (200
ไมโครลิตร) ของ supernatants วัฒนธรรมถูกแพร่กระจายไปยัง SX
กลางวุ้นและออกซิเจนบ่มที่ 30 ° C เป็นเวลา 3
วัน ยีสต์บริสุทธิ์ถูกใช้แยกเดี่ยวอาณานิคม
ยีสต์สายพันธุ์ที่ได้รับการบำรุงรักษาเป็นประจำกับ YPD
แผ่นวุ้น (กลูโคส 2%, 2% เปปโตน [Difco], สารสกัดจากยีสต์ 1%
[Difco] และ 1.5% วุ้น) และการเจริญเติบโตที่ 30 ° C. YPX
กลาง (4% ไซโล, 2% เปปโตน [Difco] และยีสต์ 1%
สารสกัด [Difco]) ถูกนำมาใช้สำหรับการคัดกรองของ xylosefermenting
ยีสต์เลือกไซโล-หมักยีสต์ด้วยthermotolerance ก่อนที่จะมีการทดลองหมักความเครียด ATY839 รับเชื้อเข้าไป 3 มิลลิลิตรของกลาง YPD ในหลอดทดลองและบ่มค้างคืนที่ 30 ° C กับการสั่นซึ่งกันและกันที่ 150 OPM (preculture) preculture ถูกระงับไป 25 มล. ของกลูโคสสังเคราะห์ (SG) กลาง (กลูโคส 2% และ 0.67% YNB ไม่มีกรดอะมิโน) หรือไซโลสังเคราะห์(SX) กลาง (ไซโล 2% และ 0.67% โดยไม่ต้อง YNB อะมิโนกรด) ใน 50 มล. Erlenmeyer ขวดไปยังเซลล์ความหนาแน่นของแสง0.1 ที่ 600 นาโนเมตร (OD 600) แล้วเพาะเลี้ยงที่ 35 ° C, 37 ° C, 38 ° C หรือ 39 ° C เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 120 รอบต่อนาที น้ำตาลและเอทานอลความเข้มข้นของ supernatants วัฒนธรรมถูกกำหนดโดยวิธีการดังต่อไปนี้รายละเอียดด้านล่างเจริญเติบโตของเซลล์ที่ถูกกำหนด OD 600 ใช้สเปกการทดสอบทั้งหมดได้ดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ การแยกยีสต์สายพันธุ์ B

สายพันธุ์ยีสต์ที่แยกได้จากแหล่งธรรมชาติ
ที่แตกต่างกัน ได้แก่ ดอกไม้ ผลไม้ ไม้ และดิน
ได้จากแถบเกียวโตในญี่ปุ่น ( ประมาณ
ตัวอย่าง 100 ในทั้งหมด ) โดยเก็บตัวอย่างใน
ฆ่าเชื้อ Polypropylene ขวดความจุ 15 ml ( เบคตอน
ดิกคินสัน Franklin Lakes , NJ , USA ) และระงับ
ใน 10 ml ของ SX เหลว ( ร้อยละ 3 และ 6 0.67 %
ynb ไม่มีกรดอะมิโน ; difco ดีทรอยท์ มิ สหรัฐอเมริกา ) ที่ประกอบด้วย
chloramphenicol ความเข้มข้น 100 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรμ
จำนวนปลูก 4 วันที่ 30 ° C
วัฒนธรรมคงที่กับเปลือกตาเล็กน้อย เปิด เฉยๆ ( 200
μ L ) ของวัฒนธรรม supernatants ถูกกระจายลงบนอาหารวุ้น เ เ กซ์
aerobically บ่มที่ 30 ° C 3
วันยีสต์บริสุทธิ์ใช้แยกเป็นโคโลนีเดี่ยว
ยีสต์สายพันธุ์ ตรวจรักษา ypd
วุ้นแผ่น ( 2 % glucose 2% ตามลำดับ [ difco ] 1 % สารสกัดจากยีสต์
[ difco ] และ 1.5% วุ้น ) และโตที่ 30 องศา ypx
ขนาดกลาง ( 4 % B , 2% ตามลำดับ [ difco และสารสกัดจากยีสต์
% ] 1 [ difco ] ) คือใช้สำหรับการ xylosefermenting
ยีสต์ เลือก




6 หมักยีสต์ ด้วย

thermotoleranceก่อนการหมัก โดยสายพันธุ์ aty839
เป็นเชื้อ 3 มล. ในหลอดทดลองขนาดกลาง ypd
บ่มค้างคืนที่ 30 ° C แบบสั่น
150 OPM ( พันธุ์ ) ส่วนพันธุ์ ถูกพักงาน
25 มล. น้ำตาลสังเคราะห์ ( SG ) ขนาดกลาง ( 2
% กลูโคสและกรดอะมิโนเท่ากับ 0.67 % ynb โดยไม่ ) หรือสังเคราะห์ 6
( SX ) ปานกลาง ( ร้อยละ 2 และ 6 0.67 %
ynb โดยไม่ อะมิโนกรด ) ใน 50 ml ขวดไปเออร์เลนเมเยอร์ความหนาแน่นเซลล์แสง
0.1 ที่ 600 nm ( od600 ) จากนั้นนำไปเลี้ยงที่อุณหภูมิ 35 องศา C ,
37 ° C , 38 ° C หรือ 39 ° C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง 120 รอบต่อนาที น้ำตาลและเอทานอลความเข้มข้นของวัฒนธรรม supernatants

มีกำหนดตามขั้นตอนรายละเอียดด้านล่าง .
การเจริญเติบโตของเซลล์ถูกกำหนดที่ od600 โดยใช้วัสดุ ทดลองใน

ทั้งหมดทำสำเนาสามฉบับ .