Materials and methods Samples Larva

Materials and methods
Samples
Larvae of C. hominivomx were obtained from the wounds of infested cattle in Caiaponia, Goias, Brazil, in 2005. Collected larvae were reared to adults in the laboratory. Total RNA was extracted from larvae and adults using Trizol (lnvitrogen, lnc., Carlsbad, CA, U.S.A.), according to the manufacturer’s instructions. The cDNA was synthesized using the lmProm-HT“ Reverse Transcription System Kit (Promega Corp., Madison, WI, U.S.A.), according to the manufacturer’s instructions.

CDNA amplification

The total coding region of E3 was amplified using six primers (Fig. 1). Two of them had been previously described for L cuprina (Newcomb et al., 1997a): 7Fla (5’ — AGC TAA ATC CCG AAA CTA AAC — 3’) and 7R4 (5’ — CTG TKG ARC CNT ATC AGA C — 3’). The primers 7R3a (5’ — ATC CIT ATC A'I'l‘ ATT 'I'l‘C ACC C — 3’) and 7F4a (5’ — CTG TKG ARC CNT ATC AGA C — 3’) were designed from sequenced fragments amplified by 7Fla/7R4 in C. hominivorax (Carvalho et al., 2006). The primers E3F (5’ — ATG AAT TTC AAI GTY AGY YWI ITG GAG - 3’) and 7R7 (5’ — TTG GT1‘ ACA CTC TAA AAT AAA TC — 3') were designed based on E3 nucleotide sequence align- ment of LcoLE7 of L cuprina, Mdo:E7 of M. domestica, DmotE7 of Drosophila melanogaster Meigen and HiotE7 of Haematobia irritans L. obtained from GenBank. The amplification conditions were standardized and the polymerase chain reaction (PCR) pro- cedures were carried out in a Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler (Perkin Elmer, lnc., Waltham, MA, U.S.A.). The 15-p.l.. PCR mix contained 20mM Tris-HCl (pH 8.4), 50mM KCl, 1 unit of Taq polymerase (lnvitrogen, lnc.), 200 p..M of each dNTP. l.8mM MgCl2, l p.M of each primer and 10-15 ng of DNA. After an ini- tial denaturing step of 3min at 96 °C, 35 cycles were performed, each including 1 min at 95 °C, lmin at 50 °C (or 52 °C, depending on the fragment) and 2min at 72 °C, with a final step of 10min at 72 °C to fully extend all amplicons.

Sequencing

Purified PCR products were cloned into pGEM—T plasmid vector (Promega Corp.). These vectors were used to transform Escherichia coli cells, which were plated on LB media with ampicillin (50 pg/mL) and X«Gal (0.8 mg in each plate). Plasmid DNA was isolated (Sambrook et al., 1989) and the clones were sequenced using M13 direct and reverse primers. The reactions were run on an ABI 3.700 automated DNA sequencer (Applied Biosystems, lnc., Foster City, CA, U.S.A.). The nucleotide sequences of
C. hominivorax were submitted to BLAST N (Altschul et al., 1997) to search for similarities, and sequence alignments were performed using ClustalX (Thompson et al., 1997). The predicted amino acid sequences were obtained using BioEdit (Hall, 1999).

Results
Amplification
The 7F]a/7R4 primer pair amplified a fragment of approximately 700bp, the sequence of which was used to design the C. hominivorax-specific primers 7F4a and 7R3a. Furthermore, the 7F1a/7R3a primer pair was used for the PCR-restricted fragment length polymorphism (RFLP) technique in order to identify mutant individuals in natural populations of C. hominivorax (Carvalho et al., 2006). The characterization of entire coding regions of the E3 gene in C. hominivorax was carried out in two steps. First, the E3F/7R3a primer pair amplified a fragment with approximately 840 bp, as expected from L. cuprina and M. domestica sequences (Newcomb et al., 1997a; Claudi- anos et al., 1999), corresponding to the 5’ portion of E3 cDNA in C. hominivorax.
This region includes both site mutations (Gly137 and Trp25l) possibly related to OP resistance in C. hominivorax.
The second step of the characterization, amplification of the 3' portion, employed a semi-nested PCR technique. Because the amplification reactions using the primer pairs 7Fla/7R7 and 7F4a/7R7 did not amplify any CDNA fragment that was visible in agarose gel, products from the reaction using 7F1a/7R7 were used as a template for further amplification with the 7F4a/7R7 primer pair. This reaction amplified a fragment with approximately 750 bp, as expected. Therefore, the entire coding region of the E3 gene was amplified, allowing for further sequencing.

Sequence analysis
The amplification reaction of the 5’ portion of E3 cDNA in C. hominivorax resulted in a fragment with 831 bp, corresponding to the nucleotide positions 1-831 reported for the orthologous L cuprina gene. The esterase E3 genes characterized in L. cuprina and M. domertica contain three introns inserted into the genomic DNA of this sequence. However, only intron III has been sequenced in C. hominivorax (Carvalho er al., 2006).

Using semi-nested PCR, a 781-bp fragment was amplified (3’ portion). corresponding to positions 940-1721 of the L cuprina nucleotide sequence (Newcomb et al.. 1997a). This region is predicted to contain the introns IV and V. The entire coding region of the E3 gene in C. hominivorax contains 1713 nucleotides. The cDNA consensus sequence from C. homirrivorax showed 83% similarity with that from L c

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ ตัวอย่าง ตัวอ่อนของ C. hominivomx ได้รับจากบาดแผลของวัวรบกวนใน Caiaponia, Goias บราซิล ในปี 2005 เก็บตัวอ่อนถูกรเลี้ยงผู้ใหญ่ในห้องปฏิบัติการ อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากตัวอ่อนและผู้ใหญ่ใช้ Trizol (lnvitrogen, lnc คาร์ลบาด CA สหรัฐอเมริกา), ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ถูกสังเคราะห์ cDNA ใช้ lmProm-HT"กลับถอดชุด System (Promega Corp. เมดิสัน อิน สหรัฐอเมริกา), ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ขยาย CDNA รวมโค้ดของ E3 คือ amplified โดยใช้ไพรเมอร์ที่หก (รูปที่ 1) สองของพวกเขาได้ถูกอธิบายไว้ก่อนหน้านี้สำหรับ cuprina L (Newcomb et al. 1997a): 7Fla (5' — AGC ท่า ATC CCG AAA CTA AAC — 3') และ 7R4 (5' — CTG TKG ARC CNT ATC เอ C — 3') 7R3a ไพรเมอร์ (5' — ATC เมือง ATC A'I 'l' ATT 'I'l' C ACC C — 3') และ 7F4a (5' — CTG TKG ARC CNT ATC เอ C — 3') ถูกออกแบบจาก amplified เศษตามลำดับ โดย 7Fla/7R4 ใน C. hominivorax (Carvalho et al. 2006) ไพรเมอร์ E3F (5' — ATG AAT TTC AAI GTY AGY YWI ITG แก๊ก - 3') และ 7R7 (5' — GT1 ทั้ง ' ACA CTC ท่า AAT AAA TC — 3') ถูกออกแบบโดย E3 นิวคลีโอไทด์ลำดับจัด-ment ของ LcoLE7 L cuprina, Mdo:E7 M. domestica, DmotE7 ของแมลงวันทอง Meigen และ HiotE7 Haematobia irritans L. ที่ได้รับจาก GenBank เงื่อนไข amplification ได้มาตรฐาน และพอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) pro-cedures ดำเนินการในการเพอร์เอลเมอ 9600 ความร้อน Cycler (เพอร์เอลเมอ lnc. นีซ MA สหรัฐอเมริกา) 15-บริษัทพีแอล ผสม PCR อยู่ 20 มม.ทริสเรทติ้ง HCl (pH 8.4), 50 มม. KCl, Taq พอลิเมอเรส (lnvitrogen, lnc), 1 หน่วย p 200 ... มของ dNTP แต่ละ l.8mM MgCl2, l p.M ของรองพื้นแต่ละฉบับ 10-15 ของดีเอ็นเอ หลังจาก ini-tial denaturing ขั้นตอน 3 นาทีที่ 96 ° C, 35 รอบดำเนินการ แต่ละรวมถึง 1 นาทีที่ 95 ° C, lmin ที่ 50 ° C (หรือ 52 ° C ขึ้นอยู่กับส่วนนี้) และ 2 นาทีที่ 72 ° C, 10 นาทีที่ 72 ° C การขยาย amplicons ทั้งหมดเต็มขั้นสุดท้าย การจัดลำดับ ผลิตภัณฑ์ Purified PCR ถูกโคลนลงใน pGEM — T plasmid เวกเตอร์ (Promega Corp.) ใช้เวกเตอร์เหล่านี้เพื่อแปลง Escherichia coli เซลล์ ซึ่งถูกชุบบนสื่อปอนด์โกคอ (50 pg/mL) และ X «Gal (0.8 มิลลิกรัมในแต่ละแผ่น) Plasmid DNA แยก (Sambrook et al. 1989) และโคลนที่ถูกเรียงลำดับโดยใช้ไพรเมอร์ M13 ตรง และย้อนกลับ ปฏิกิริยาที่ถูกเรียกใช้บน ABI 3.700 อัตโนมัติ DNA sequencer (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ lnc. เมืองฟอสเตอร์ CA สหรัฐอเมริกา) ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ C. hominivorax ส่งมาที่ N ระเบิด (Altschul et al. 1997) เพื่อค้นหาความคล้ายคลึงกัน และดำเนินการจัดลำดับโดยใช้ ClustalX (Thompson et al. 1997) ลำดับกรดอะมิโนที่คาดการณ์ได้รับใช้ BioEdit (ฮอลล์ 1999) ผลลัพธ์ Amplification 7F] amplified คู่ไพรเมอร์ ที่/7R4 ส่วนของประมาณ 700bp ลำดับของที่ใช้ในการออกแบบ 7F4a ไพรเมอร์ C. hominivorax-specific และ 7R3a นอกจากนี้ คู่ไพรเมอร์ 7F1a/7R3a ใช้สำหรับเทคนิค PCR จำกัดส่วนความยาวแตกต่าง (RFLP) เพื่อระบุบุคคลที่กลายพันธุ์ในธรรมชาติประชากรของ C. hominivorax (Carvalho et al. 2006) จำแนกลักษณะของทั้งภาคการเข้ารหัสของยีน E3 ใน C. hominivorax ได้ดำเนินการในสองขั้นตอน ครั้งแรก รองพื้น E3F/7R3a จับคู่ amplified ส่วน ด้วยประมาณ 840 bp ตามที่คาดไว้จาก L. cuprina และ M. domestica ลำดับ (Newcomb et al. 1997a Claudi - anos et al. 1999), ที่สอดคล้องกับส่วน 5' ของ cDNA E3 ใน C. hominivorax ภูมิภาคนี้รวมทั้งเว็บไซต์กลายพันธุ์ (Gly137 และ Trp25l) อาจจะเกี่ยวข้องกับความต้านทานของ OP ใน C. hominivorax ขั้นตอนสองของสมบัติ amplification ของ 3 ส่วน ใช้เทคนิค PCR กึ่งซ้อนกัน เนื่องจากปฏิกิริยา amplification โดยใช้ไพรเมอร์คู่ 7Fla/7R7 และ 7F4a/7R7 ไม่ได้ขยายส่วนใด ๆ CDNA ที่มองเห็นได้ใน agarose เจล ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาที่ใช้ 7F1a/7R7 ถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับ amplification เพิ่มเติมกับคู่ไพรเมอร์ 7F4a/7R7 Amplified ปฏิกิริยานี้ มีประมาณ 750 ส่วน bp ตามที่คาดไว้ ดังนั้น ทั้งภูมิภาครหัสของยีน E3 คือ amplified เพื่อให้สามารถเพิ่มเติม การจัดลำดับ การวิเคราะห์ลำดับ ส่งผลให้เกิดปฏิกิริยา amplification ของส่วน 5' ของ cDNA E3 ใน C. hominivorax ส่วนกับ 831 ที่สอดคล้องกับตำแหน่งนิวคลีโอไทด์ 1-831 รายงาน bp การยีน cuprina orthologous L ลักษณะยีน E3 esterase ใน L. cuprina และ domertica เมตรประกอบด้วยสาม introns แทรกดีเอ็นเอออกของลำดับนี้ อย่างไรก็ตาม เท่านั้น intron III ได้ถูกเรียงลำดับใน C. hominivorax (Carvalho เอ้อ al., 2006) ใช้ PCR กึ่งซ้อน 781-bp ส่วนแก้ไข amplified (3 ส่วน) ที่สอดคล้องกับตำแหน่ง 940-1721 ลำดับนิวคลีโอไทด์ cuprina L (Newcomb ร้อยเอ็ด. 1997a) ภูมิภาคนี้คาดว่า จะประกอบด้วย introns IV และ V ทั้งภูมิภาครหัสของยีน E3 ใน C. hominivorax ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 1713 ลำดับการฉันทามติ cDNA จาก C. homirrivorax พบว่า 83% คล้ายคลึงกับที่จาก L c

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
ตัวอย่าง
ตัวอ่อนของซี hominivomx ที่ได้รับจากบาดแผลของวัวเหม็นใน Caiaponia, Goias บราซิลในปี 2005 ตัวอ่อนที่ได้นำมาเลี้ยงให้กับผู้ใหญ่ในห้องปฏิบัติการ อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากตัวอ่อนและผู้ใหญ่ใช้ Trizol (lnvitrogen, LNC. คาร์ลส, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ซึ่งแปลถูกสังเคราะห์โดยใช้ lmProm-HT "ระบบ Reverse ถอดความ Kit (Promega คอร์ปแมดิสัน, WI, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต.

cDNA ขยาย

พื้นที่การเข้ารหัสรวมของ E3 เอ็ด Fi ampli ใช้หกไพรเมอร์ (รูปที่ 1). . สองของพวกเขาได้รับการอธิบายก่อนหน้านี้สำหรับ L cuprina (Newcomb, et al, 1997a.) 7Fla (5 '- อาซาฮี TAA ATC CCG AAA CTA AAC - 3) และ 7R4 (5' - CTG TKG ARC CNT ATC AGA C - 3 ') ไพรเมอร์ 7R3a (5 '- ATC CIT ATC A'I'l' ATT 'I'l'C แม็กซี - 3) และ 7F4a (5' - CTG TKG ARC CNT ATC AGA C - 3) ได้รับการออกแบบจากลำดับขั้นตอน เศษเอ็ด Fi ampli โดย 7Fla / 7R4 ใน C. hominivorax (Carvalho et al., 2006) ไพรเมอร์ E3F (5 '- ATG AAT TTC AAI GTY AGY YWI ITG GAG - 3) และ 7R7 (5' - TTG GT1 'ACA CTC TAA AAT AAA TC - 3) ได้รับการออกแบบขึ้นอยู่กับลำดับเบส E3 align- ment ของ LcoLE7 ของ L cuprina, MDO: E7 เอ็ม domestica, DmotE7 ของแมลงวันทอง Meigen และ HiotE7 ของ Haematobia irritans ลิตรที่ได้รับจาก GenBank ampli เงื่อนไขไอออนบวก Fi ได้รับมาตรฐานและวิธี Polymerase chain reaction (PCR) cedures โปรได้ดำเนินการในเพอร์กินเอลเมอ 9600 Cycler ความร้อน (Perkin Elmer, LNC. วอลแทม, MA, USA) 15-PL ผสม PCR มี 20mm Tris-HCl (pH 8.4), 50mm KCl, 1 หน่วย Taq โพลิเมอร์ (lnvitrogen, LNC.) 200 p..M ของแต่ละ dNTP l.8mM MgCl2, L ส่วนตัวของแต่ละไพรเมอร์และ 10-15 NG ของดีเอ็นเอ หลังจาก tial เริ่มแรกขั้นตอนของ 3 นาทีที่ 96 ° C denaturing 35 รอบได้ดำเนินการแต่ละรวมถึง 1 นาทีที่ 95 ° C, lmin ที่ 50 ° C (หรือ 52 องศาเซลเซียสขึ้นอยู่กับชิ้นส่วน) และ 2min ที่ 72 ° C ด้วยขั้นตอนสุดท้ายของ 10min ที่ 72 ° C ในการรองรับการขยาย amplicons ทั้งหมด.

ลำดับ

Puri Fi เอ็ดผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูกโคลนเข้าไปใน pGEM-T พลาสมิดเวกเตอร์ (Promega คอร์ป) เวกเตอร์เหล่านี้ถูกนำมาใช้ในการแปลงเซลล์ Escherichia coli ซึ่งถูกชุบบนสื่อ LB กับจิบูตี (50 PG / มิลลิลิตร) และ X «แกลลอน (0.8 มิลลิกรัมในแต่ละแผ่น) ดีเอ็นเอที่แยกได้ (Sambrook et al., 1989) และโคลนมีลำดับขั้นตอนการใช้ M13 โดยตรงและไพรเมอร์ย้อนกลับ ปฏิกิริยาวิ่งบน ABI 3.700 ซีเควนดีเอ็นเออัตโนมัติ (Applied Biosystems, LNC. ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ลำดับเบสของ
ซี hominivorax ถูกส่งไประเบิด N (Altschul et al., 1997) เพื่อค้นหาความคล้ายคลึงกันและการจัดแนวลำดับถูกดำเนินการโดยใช้ ClustalX ( ธ อมป์สัน et al., 1997) ที่คาดการณ์อะมิโนกรดที่ได้รับใช้ BioEdit (ฮอลล์, 1999).

ผลการค้นหา
Ampli Fi ไอออนบวก
7F] A / 7R4 คู่ไพรเมอร์ ampli Fi เอ็ดส่วนประมาณ 700bp ลำดับซึ่งถูกนำมาใช้ในการออกแบบซี hominivorax-speci Fi C ไพรเมอร์ 7F4a และ 7R3a . นอกจากนี้ไพรเมอร์คู่ 7F1a / 7R3a ใช้สำหรับ PCR- จำกัด ความยาวชิ้นส่วน polymorphism (RFLP) เทคนิคเพื่อระบุตัวบุคคลที่กลายพันธุ์ในประชากรตามธรรมชาติของซี hominivorax (Carvalho et al., 2006) ลักษณะของภูมิภาคทั้งการเข้ารหัสของยีน E3 ใน C. hominivorax ได้ดำเนินการในขั้นตอนที่สอง ครั้งแรกที่ E3F / 7R3a ไพรเมอร์คู่ ampli Fi เอ็ดชิ้นส่วนที่มีประมาณ 840 bp เป็นไปตามคาดจากลิตร cuprina เมตรและลำดับ domestica (Newcomb, et al, 1997a;.. Claudi- Anos, et al, 1999) ซึ่งสอดคล้องกับ 5 ' เป็นส่วนหนึ่งของงาน E3 cDNA ใน C. hominivorax.
ภูมิภาคนี้รวมทั้งการกลายพันธุ์ของเว็บไซต์ (Gly137 และ Trp25l) อาจจะเกี่ยวข้องกับการต้านทาน OP ใน C. hominivorax.
ขั้นตอนที่สองของตัวละคร, ไอออนบวก Fi ampli ของ 3 'ส่วนลูกจ้างกึ่งซ้อนกัน PCR เทคนิค. เพราะ ampli ปฏิกิริยา Fi ไอออนบวกโดยใช้คู่ไพรเมอร์ 7Fla / 7R7 และ 7F4a / 7R7 ไม่ได้ขยายออกเป็นชิ้น cDNA ใด ๆ ที่ปรากฏอยู่ในเจล agarose ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาโดยใช้ 7F1a / 7R7 ถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบสำหรับต่อไอออนบวก Fi ampli กับไพรเมอร์ 7F4a / 7R7 คู่. ปฏิกิริยานี้ ampli Fi ed ชิ้นส่วนที่มีประมาณ 750 bp เป็นไปตามคาด ดังนั้นภูมิภาคเข้ารหัสทั้งหมดของยีน E3 เอ็ด Fi ampli ให้สามารถลำดับต่อไป.

การวิเคราะห์ลำดับ
ampli ปฏิกิริยา Fi ไอออนบวกของ 'ส่วนที่ 5 ของ E3 cDNA ใน C. hominivorax ส่งผลให้ชิ้นส่วนที่มี 831 ความดันโลหิตที่สอดคล้องกับตำแหน่งเบส 1- 831 รายงานสำหรับ orthologous ยีน L cuprina ยีน esterase E3 ในลักษณะลิตร cuprina เมตรและ domertica มีสาม introns แทรกเข้าไปในดีเอ็นเอของลำดับนี้ แต่เพียง intron III ได้รับการจัดลำดับใน C. hominivorax (Carvalho ER al., 2006).

การใช้กึ่งซ้อนกัน-PCR, ชิ้นส่วน 781-BP เป็น ampli Fi เอ็ด (3 'ส่วน) ที่สอดคล้องกับตำแหน่ง 940-1721 ลำดับ L cuprina เบส (Newcomb, et al .. 1997a) ภูมิภาคนี้คาดว่าจะมี IV introns โวลต์และภูมิภาคทั้งการเข้ารหัสของยีน E3 ใน C. hominivorax มีนิวคลีโอ 1713 ลำดับฉันทามติ cDNA จากซี homirrivorax แสดงให้เห็นความคล้ายคลึงกัน 83% มีที่มาจาก L C