Unlike WT and T111H cyanomet CtrHbs

Unlike WT and T111H cyanomet CtrHbs, which are reduced slowly
and with different efficiencies between the major and minor forms
(Supporting Information Fig. S14–15), DT reduction of L75H cyanomet
CtrHb leads to complete and rapid disappearance of all cyanomet
resonances (Supporting Information Fig. S16). Reoxidation results in a
spectrum (Fig. 3e) distinct from the starting material (Fig. 3c) and
consistent with high yield of one major product (N90 %, henceforth
L75H CtrHb-B). Only one heme vinyl group can be identified in
DQF-COSY data of the product (Supporting Information Fig. S18). The
intact vinyl Hα exhibits an NOE to a heme methyl, itself having a
weak intraheme connectivity to a second heme methyl. The vinyl and
methyl chemical shifts (Table 2) and NOE pattern are analogous to the
WT 2-vinyl↔1-CH3↔8-CH3 sequence and suggest that the reaction
occurs on pyrrole C. Also similar to the WT, characteristic 1-CH3 ↔
F48 and 2-vinyl Hα↔F80 contacts are observed. Of the 2-vinyl βcis
and βtrans protons, the latter is oriented toward a third heme methyl,
assigned as the heme 3-CH3 (Supporting Information Fig. S18C). This
methyl shows distinctive dipolar contacts, including strong NOEs to
the side chain methyls of V83 and the ring of F80. In addition, the
heme 3-CH3 displays an NOE to a methyl group, the latter
(−0.49 ppm, Supporting Information Fig. S18D) J-coupled to a proton
resonating at 0.54 ppm. The relative intensity of the 0.54 ppm
and −0.49 resonances is consistent with a 4-CαH-CβH3 heme moiety.
The 3:1:1:3 splitting pattern observed in the 13C dimension of the
1H-coupled natural abundance 13C spectrum confirms that the signal
at−0.49 ppm corresponds to a methyl group (Supporting Information
Fig. S19). The 4-CαΗ is oriented towards the heme 5-CH3 and the
4-CβΗ3 is proximal to the heme 3-CH3, as in the starting material
L75H major isomer.
Because WT CtrHb does not form a crosslink, H75 is the logical
candidate for modification. 1H-15N lr-HMQC spectra collected on
cyanometWT and L75H CtrHbs before and after treatment demonstrate
that, in L75H CtrHb-B, signals corresponding to intact H75 are missing
and a new set of shifted cross peaks are detected. Both H75 imidazole
nitrogens exhibit J-coupling to a proton at 7.12 ppm (Hε1). The ring
15Nε2 is also J-coupled to a proton at 5.42 ppm (Hδ2) and to the heme
4-CβH3 (−0.49 ppm, Fig. 6). NOE connectivities define the position of
the modified histidine: H75 Hδ2 has strong dipolar interactions with
both the heme 3- and 4-CβH3 groups, whereas H75 Hε1 is oriented
towards the 5-CH3 group (data not shown). Together, these data
support that the H75 ring undergoes a rotation fromits original position
and forms the anticipated crosslink,with R stereochemistry at the heme
4-Cα, as depicted in Supporting Information Fig. S20B. Interestingly, for
both T111H and L75H CtrHbs, the engineered histidine reorients in
order to react with the heme.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ต่างจาก WT และ T111H cyanomet CtrHbs ซึ่งจะลดลงอย่างช้า ๆและ มีประสิทธิภาพแตกต่างกันระหว่างฟอร์มหลัก และรอง(สนับสนุนข้อมูลฟิก S14–15), ลด DT L75H cyanometCtrHb นำไปสู่การหายตัวไปอย่างรวดเร็ว และสมบูรณ์ของ cyanomet ทั้งหมดresonances (สนับสนุนฟิกข้อมูล S16) Reoxidation ผลการสเปกตรัม (Fig. 3e) แตกต่างจากวัสดุเริ่มต้นกินซี 3) และสอดคล้องกับผลตอบแทนสูงของผลิตภัณฑ์หลัก (N90% แท้ ๆL75H CtrHb-B) สามารถระบุเพียงหนึ่งกลุ่มไวนิล heme ในโคซี่ DQF ข้อมูลของผลิตภัณฑ์ (สนับสนุนฟิกข้อมูล S18) ที่เหมือนเดิมไวนิล Hα จัดแสดงการโนส์กับ methyl heme ตัวเองมีความเชื่อมต่อ intraheme อ่อนกับ methyl heme ที่สอง แบบไวนิล และเคมี methyl กะ (ตารางที่ 2) และรูปแบบโนส์จะคล้ายคลึงกับการWT 2-vinyl↔1-CH3↔8-CH3 ลำดับ และแนะนำที่ปฏิกิริยาเกิด pyrrole C. นอกจากนี้ยังคล้ายกับ WT ลักษณะ 1-CH3 ↔พบ F48 และไวนิล 2 ติดต่อ Hα↔F80 ของ βcis 2-ไวนิลและ βtrans โปรตอน หลังเป็นเชิงต่อ heme ที่สาม methylกำหนดให้เป็น heme 3-CH3 (สนับสนุนฟิกข้อมูล S18C) นี้methyl แสดงโดดเด่นติดต่อ dipolar รวม NOEs แข็งแรงไปmethyls โซ่ด้าน V83 และแหวนของ F80 แห่งheme 3-CH3 แสดงโนส์เป็นกลุ่ม methyl หลัง(−0.49 ppm ฟิกข้อมูลสนับสนุน S18D) ควบคู่ J จะเป็นโปรตอนresonating ที่ 0.54 ppm ความเข้มสัมพัทธ์ของ 0.54 ppmและ −0.49 resonances จะสอดคล้องกับ moiety heme 4-CαH-CβH3สังเกต 3:1:1:3 ที่แบ่งรูปแบบในมิติ 13 Cยืนยัน 1H ควบคู่ธรรมชาติที่อุดมสมบูรณ์ 13C สเปกตรัมที่สัญญาณat−0.49 ppm ตรงกลุ่ม methyl (สนับสนุนข้อมูลฟิก S19) 4 CαΗ จะมุ่งเน้นไปทาง heme 5-CH3 และ4 CβΗ3 เป็น proximal เพื่อ heme 3-CH3 ในวัสดุเริ่มต้นL75H ไอโซเมอร์ที่สำคัญเนื่องจาก WT CtrHb ฟอร์มการ crosslink, H75 เป็นทางตรรกะตัวเลือกสำหรับการแก้ไข 1H 15N lr HMQC แรมสเป็คตรารวบรวมในสาธิต cyanometWT และ CtrHbs L75H ก่อน และ หลังการรักษาใน L75H CtrHb-B สัญญาณที่สอดคล้องกับ H75 เหมือนเดิมหายไปและพบยอดถูกเลื่อนข้ามชุดใหม่ อิมิดาโซลทั้ง H75nitrogens แสดงคลัป J กับโปรตอนที่ 7.12 ppm (Hε1) แหวน15Nε2 ยังเป็น J-ควบคู่ และ heme โปรตอนที่ 5.42 ppm (Hδ2)4-CβH3 (−0.49 ppm, Fig. 6) โนส์ connectivities กำหนดตำแหน่งของhistidine แก้ไข: H75 Hδ2 มีแรงโต้ตอบ dipolar กับทั้ง heme 3 - และ 4-CβH3 กลุ่ม H75 Hε1 เป็นแนวต่อกลุ่ม 5 CH3 (ข้อมูลไม่แสดง) กัน ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนว่า แหวน H75 ผ่านตำแหน่งเดิม fromits หมุนและแบบ crosslink คาด กับ stereochemistry R ที่ heme4-Cα เป็นแสดงในฟิกข้อมูลสนับสนุน S20B เป็นเรื่องน่าสนใจ สำหรับทั้ง T111H และ L75H CtrHbs, histidine ออกแบบ reorients ในสั่งการตอบสนองกับ heme

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ซึ่งแตกต่างจาก WT และ T111H CtrHbs cyanomet ซึ่งจะลดลงอย่างช้า ๆ
และด้วยประสิทธิภาพที่แตกต่างกันระหว่างรูปแบบที่ใหญ่และรายย่อย
(สนับสนุนข้อมูลรูป. S14-15), DT ลด L75H cyanomet
CtrHb นำไปสู่การดำเนินการและการหายตัวไปอย่างรวดเร็วของ cyanomet ทั้งหมด
Resonances (ข้อมูลสนับสนุน รูปที่. S16) ผล Reoxidation ใน
สเปกตรัม (รูป. 3e) แตกต่างจากวัสดุที่เริ่มต้น (รูป. 3c) และ
สอดคล้องกับผลตอบแทนสูงของหนึ่งผลิตภัณฑ์หลัก (N90% ต่อจากนี้ไป
L75H CtrHb-B) เพียงคนเดียวที่กลุ่มไวนิล heme สามารถระบุได้ใน
ข้อมูล DQF-โคซี่ของผลิตภัณฑ์ (สนับสนุนข้อมูลรูป. S18)
ไวนิลเหมือนเดิมHαจัดแสดงนิทรรศการ NOE เพื่อ heme เมธิลตัวเองที่มี
การเชื่อมต่อ intraheme อ่อนแอเมธิลฮีมที่สอง ไวนิลและ
เมธิลกะเคมี (ตารางที่ 2) และรูปแบบการ NOE มีความคล้ายคลึงกับ
ลำดับ WT-2-vinyl↔1CH3↔8-CH3 และแนะนำว่าปฏิกิริยา
ที่เกิดขึ้นในพิโรล C. นอกจากนี้คล้ายกับ WT ลักษณะ 1 CH3 ↔
F48 และ 2 ไวนิลรายชื่อHα↔F80จะสังเกตเห็น ของβcis 2 ไวนิล
และโปรตอนβtransหลังจะเน้นไปทางเมธิลฮีมที่สาม
รับมอบหมายให้เป็น heme 3 CH3 (สนับสนุนข้อมูลรูป. S18C) นี้
แสดงให้เห็นถึงรายชื่อเมทิล dipolar ที่โดดเด่นรวมทั้ง noes ที่แข็งแกร่งในการ
ห่วงโซ่ด้าน methyls ของ V83 และแหวนของ F80 นอกจากนี้
heme 3 CH3 แสดง NOE ไปยังกลุ่มเมธิลหลัง
(-0.49 พีพีเอ็มสนับสนุนข้อมูลรูป. S18D) J-คู่กับโปรตอน
สะท้อนที่ 0.54 ส่วนในล้านส่วน ความเข้มของญาติของ 0.54 พีพีเอ็ม
และ -0.49 Resonances มีความสอดคล้องกับ 4 CαH-CβH3ครึ่งฮีม.
3: 1: 1: 3 รูปแบบการแยกตั้งข้อสังเกตในมิติของ 13C
อุดมสมบูรณ์ตามธรรมชาติ 1H คู่สเปกตรัม 13C ยืนยันว่า สัญญาณ
ที่ 0.49 ppm และสอดคล้องกับกลุ่มเมธิล (สนับสนุนข้อมูล
รูป. S19) 4 CαΗจะเน้นไปทาง heme 5- CH3 และ
4 CβΗ3เป็นเนื้อหาใกล้กับ heme 3 CH3 ในขณะที่สารตั้งต้น
L75H isomer ที่สำคัญ.
เพราะ WT CtrHb ไม่ก่อ Crosslink, H75 เป็นตรรกะที่
ผู้สมัครรับเลือกตั้ง การเปลี่ยนแปลง 1H-15N LR-HMQC สเปกตรัมเก็บ
cyanometWT และ L75H CtrHbs ก่อนและหลังการรักษาแสดงให้เห็น
ว่าใน L75H CtrHb-B, สัญญาณสอดคล้องกับ H75 เหมือนเดิมจะหายไป
และชุดใหม่ของยอดเขาข้ามขยับมีการตรวจพบ ทั้ง imidazole H75
nitrogens จัดแสดง J-มีเพศสัมพันธ์เพื่อโปรตอนที่ 7.12 พีพีเอ็ม (Hε1) แหวน
15Nε2ยังเป็น J-คู่กับโปรตอนที่ 5.42 พีพีเอ็ม (Hδ2) และ heme
4 CβH3 (-0.49 พีพีเอ็ม, รูปที่. 6) NOE connectivities กำหนดตำแหน่งของ
ฮิสทิดีแก้ไข: H75 Hδ2มีปฏิสัมพันธ์ที่ดีกับ dipolar
ทั้ง heme 3 และกลุ่ม 4 CβH3ขณะ H75 Hε1จะมุ่งเน้น
ไปที่กลุ่ม 5-CH3 (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ร่วมกันข้อมูลเหล่านี้
สนับสนุนการที่แหวน H75 ผ่านการหมุน fromits ตำแหน่งเดิม
และรูปแบบการเชื่อมโยงพันธะที่คาดว่าจะมี R สเตอริโอที่ heme
4 Cαเป็นที่ปรากฎในรูปที่สนับสนุนข้อมูล S20B ที่น่าสนใจสำหรับ
ทั้ง T111H และ L75H CtrHbs, ฮิสติดีนวิศวกรรม reorients ใน
เพื่อที่จะทำปฏิกิริยากับ heme

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ซึ่งแตกต่างจาก WT และ t111h cyanomet ctrhbs ซึ่งจะลดลงอย่างช้าๆ และด้วยประสิทธิภาพที่แตกต่างกันระหว่าง

รูปแบบหลักและรายย่อย ( สนับสนุนข้อมูลรูป s14 15 – ) , DT ลด l75h cyanomet
ctrhb นำไปสู่สมบูรณ์และหายตัวไปอย่างรวดเร็วของ resonances cyanomet
ทั้งหมด ( ข้อมูลประกอบรูปที่ s16 ) reoxidation ผลลัพธ์ใน
สเปกตรัม ( มะเดื่อ 3E ) แตกต่างจาก ( รูป ตั้งแต่วัสดุ3 C )
สอดคล้องกับผลผลิตสูงของผลิตภัณฑ์หลัก ( 90 % อีก
l75h ctrhb-b ) เพียงหนึ่งท่านไวนิลกลุ่มสามารถที่ระบุไว้ใน dqf-cosy
ข้อมูลของสินค้า ( ข้อมูลประกอบรูปที่ s18 )
เหมือนเดิมไวนิล H αประมาณกันกับฮีมเมทิล , ตัวเองมี
การเชื่อมต่อ intraheme อ่อนแอเมทิลิน 2 ไวนิลและ
กะสารเคมีเมทิล ( ตารางที่ 2 ) และ โนเอะ รูปแบบคล้ายคลึงกับ
WT 2-vinyl ↔ 1-ch3 ↔ 8-ch3 ลำดับและชี้ให้เห็นว่าปฏิกิริยาเกิดขึ้นใน C
ลยังคล้ายกับน้ำหนัก ลักษณะ 1-ch3 ↔
f48 2-vinyl H และα↔ f80 ติดต่อตามลำดับ ของ 2-vinyl บีตาและ CIS
บีตาทรานส์โปรตอน , หลังเป็นเชิงต่อเมทิลิน 3
มอบหมายให้เป็น ท่าน 3-ch3 ( สนับสนุนข้อมูลภาพประกอบs18c ) เมทิล นี้
dipolar แสดงรายชื่อที่โดดเด่น รวมทั้งไม่แข็งแรง

methyls โซ่ข้างของ v83 และแหวนของ f80 . นอกจากนี้ ท่าน 3-ch3
แสดงโนในกลุ่มเมธิล หลัง
( − 0.49 มิลลิกรัม สนับสนุนข้อมูลรูป s18d ) j-coupled กับโปรตอน
กี่ที่ 0.54 ppm ความเข้มสัมพัทธ์ของ 0.54 มิลลิกรัม และ−
049 resonances สอดคล้องกับกึ่งหนึ่งฮีม 4-C α h-c บีตา H3 .
3:1:1:3 แบ่งรูปแบบ 2 มิติ 13C ของ
1 คู่ธรรมชาติอุดมสมบูรณ์ 13C สเปกตรัมยืนยันว่าสัญญาณ
ที่− 0.49 ppm สอดคล้องกับกลุ่มเมทิล ( สนับสนุนข้อมูล
รูปที่ s19 ) การαΗ 4-C เป็นเชิงต่อท่าน 5-ch3 และ
4-C βΗ 3 ใกล้เคียงกับฮีม 3-ch3 เป็นในวัสดุเริ่มต้น
l75h สาขาเซ็นเตอร์ .
เพราะ WT ctrhb ไม่สร้างพันธะข้าม h75 , เป็นตัวเลือกตรรกะ
สำหรับการปรับเปลี่ยน 1h-15n LR ได้โดยเก็บ
cyanometwt l75h ก่อนและหลังการรักษา และ ctrhbs สาธิต
, l75h ctrhb-b , สัญญาณกันเหมือนเดิม h75 หายไป
และชุดใหม่ของเลื่อนข้ามยอดเขาจะพบ ทั้ง h75 อิมิดาโซล
ไนโตรเจนมี j-coupling กับโปรตอนที่ 712 ppm ( H ε 1 ) แหวน
15 ε 2 ยัง j-coupled กับโปรตอนที่ 5.42 ppm ( H δ 2 ) และเพื่อท่าน
4-C บีตา H3 ( − 0.49 ppm , ภาพที่ 6 ) ส่วนเชื่อมต่อวงจรกัน กำหนดตำแหน่งของการ h75 H :
เมื่อδ 2 มีปฏิสัมพันธ์ที่ดีกับทั้งสองท่าน dipolar
3 - 4-C บีตา H3 กลุ่ม ในขณะที่ h75 H ε 1 มุ่งเน้น
ต่อกลุ่ม 5-ch3 ( ข้อมูลไม่แสดง ) กัน , ข้อมูลเหล่านี้
สนับสนุนว่าแหวน h75 ทนี้ fromits การหมุนตำแหน่งเดิม
และรูปแบบคาดว่า Crosslink กับ r สเตอริโอเคมิสตรีที่ฮีม
4-C αตามที่ปรากฎในการสนับสนุนข้อมูลรูป s20b น่าสนใจ สำหรับ t111h
ทั้งสองและ ctrhbs l75h วิศวกรรม reorients ีนใน
เพื่อทำปฏิกิริยากับท่าน