2.3. Yeast identificationITS1-5.8rD

2.3. Yeast identification
ITS1-5.8rDNA-ITS2 PCR-RFLP: yeast isolates identification was performed
by the PCR-RFLP method described by Esteve-Zarzoso et al.
(1999). DNAs from liquid cultures were extracted according to Querol,
Barrio, and Ramon (1992). PCR reaction mixtures (75 μl) containing
0.5 μMprimer ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) and0.5 μMprimer
ITS4 (5′-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3′) (White, Bruns, Lee, & Taylor,
1990), 10 μM deoxynucleotides (Promega), 1.5 mM MgCl2 and 1 unit
DNA polymerase (Promega) were prepared. Amplifications were performed
in a thermocycler (Thermo Electron, USA) in the following conditions:
initial denaturation at 95 °C for 5 min; 30 cycles of denaturating
at 94 °C for 1 min; annealing at 55.5 °C for 2 min; extension at 72 °C for
2min and a final extension step at 72 °C for 10min. PCR products
(10 μl) were digested without further purification with the restriction
endonucleases CfoI, HaeIII and HinfI (Roche). The PCR products and
their restriction fragments were separated on 1% and 3% (w/v) agarose
gels, respectively, with 1× TAE buffer. After electrophoresis, gels were
stained with ethidium bromide, visualized under UV light in a G-Box
Syngene-Genesis 10 UV Scanner (UK). Fragment sizes were estimated
by comparison against a DNA ladder (100 bp BioRad). Yeast isolates
were grouped according to their RFLP profiles and compared with the
RFLP patterns described by Guillamón, Sabaté, Barrio, Cano, and
Querol (1998), Esteve-Zarzoso et al. (1999), Sabate, Cano, Esteve-
Zarzoso, and Guillamon (2002) and de Llanos Frutos, Fernandez-
Espinar, and Querol (2004).
Sequence analysis of the region D1/D2 of the 26S rRNA gene: Representative
strains of each PCR-RFLP profile obtained were treated to
perform sequence analysis of the domains D1 and D2 of the 26S rRNA
gene. PCR amplification of the referred region in the 26S rRNA gene
with the primers NL1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′) and
NL4 (5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′) (Kurtzman & Robnett, 1998)
were performed. The amplification reaction and PCR conditions
were identical to those described above for ITS 5.8 rRNA region
except for the primers used (NL1 and NL4). Amplified products
were sequenced by LGC Genomics (Germany) and sequences
were compared to those available in GenBank database at the
National Center for Biotechnology Information (NCBI) using
BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) to be identified by
sequence homology with described species

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. รหัสยีสต์ITS1-5.8rDNA-ITS2 PCR-RFLP: ทำรหัสแยกยีสต์โดยวิธี PCR-RFLP อธิบายไว้โดย Esteve Zarzoso et al(1999) DNAs จากวัฒนธรรมของเหลวถูกดึงตาม QuerolBarrio ก Ramon (1992) PCR ปฏิกิริยาส่วนผสม (75 μl) ที่ประกอบด้วย0.5 μMprimer ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) and0.5 μMprimerITS4 (5′-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3′) (สีขาว บรันซ์ Lee, & Taylor1990), deoxynucleotides 10 μM (Promega), 1.5 มม. MgCl2 และ 1 หน่วยมีเตรียมดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Promega) ดำเนิน amplificationsในการ thermocycler (เทอร์โมอิเล็กตรอน สหรัฐอเมริกา) ในเงื่อนไขต่อไปนี้:denaturation เริ่มต้นที่ 95 ° C สำหรับ 5 นาที รอบ 30 ของ denaturatingที่ 94 ° C สำหรับ 1 นาที การอบเหนียวที่ 55.5 ° C สำหรับ 2 นาที 72 ° C สำหรับนาทีที่ 2 และขั้นตอนสุดท้ายขยายที่ 72 ° C 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR(10 μl) ถูกต้องโดยไม่ต้องฟอกเพิ่มเติมมีข้อจำกัดendonucleases CfoI, HaeIII และ HinfI (Roche) ผลิตภัณฑ์ PCR และบางส่วนของข้อจำกัดของพวกเขาถูกแยกจากกันใน 1% และ 3% (w/v) agaroseเจ ตามลำดับ กับบัฟเฟอร์เต้ซื้อ 1 หลังจาก electrophoresis เจมีสีกับโบรไมด์ ethidium, visualized ภายใต้แสง UV ใน G-กล่องSyngene-ปฐมกาล 10 UV สแกนเนอร์ (UK) ส่วนขนาดได้ประมาณโดยการเปรียบเทียบ กับดีเอ็นเอบันได (100 bp BioRad) ยีสต์ที่แยกได้จัดกลุ่มตามค่าของ RFLP และเปรียบเทียบกับการรูปแบบ RFLP โดย Guillamón, Sabaté, Barrio, Cano และQuerol (1998), Esteve Zarzoso et al. (1999), Sabate, Cano, Esteve-Zarzoso และ Guillamon (2002) และ de Llanos Frutos เฟอร์นานเด -Espinar และ Querol (2004)ลำดับวิเคราะห์ภาคง 1/D2 ของ 26S rRNA ยีน: ตัวแทนสายพันธุ์ของแต่ละโพรไฟล์ PCR-RFLP ที่ได้รับการดูแลในทำการวิเคราะห์ลำดับของโดเมนง 1 และ D2 ของ 26S rRNAยีน PCR ขยายภาคอ้างอิงในยีน rRNA 26Sมีไพรเมอร์ NL1 (5′ GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG 3′) และNL4 (5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′) (Kurtzman และ Robnett, 1998)มีดำเนินการ ปฏิกิริยาขยายและเงื่อนไข PCRไม่เหมือนกับที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับภูมิภาค 5.8 เป็น rRNAยกเว้นสังกะสี วัสดุที่ใช้ (NL1 และ NL4) ผลิตภัณฑ์เอาต์มีการเรียงลำดับตามลำดับและ Genomics LGC (เยอรมนี)ได้เปรียบเทียบในฐานข้อมูลของ GenBank ที่แห่งชาติศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ (NCBI) ใช้ระเบิด (ส่วน http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) เพื่อสามารถระบุลำดับ homology กับพันธุ์อธิบาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 บัตรประจำตัวยีสต์
ITS1-5.8rDNA-ITS2 PCR-RFLP
ยีสต์สายพันธุ์ประจำตัวประชาชนได้ดำเนินการโดยวิธีPCR-RFLP อธิบายโดย Esteve-Zarzoso et al.
(1999) DNAs จากวัฒนธรรมของเหลวสกัดตาม Querol,
ริโอและรามอน (1992) ผสมปฏิกิริยา PCR (75 ไมโครลิตร) ที่มี
0.5 μMprimer ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3) and0.5 μMprimer
ITS4 (5'-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3 ') (สีขาว, บรูลีและเทย์เลอร์,
1990), 10 ไมครอน deoxynucleotides (Promega) 1.5 มิลลิ MgCl2 และ 1
หน่วยดีเอ็นเอโพลิเมอร์(Promega) ได้จัดทำ เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการใน thermocycler (เทอร์โมอิสหรัฐอเมริกา) ในเงื่อนไขต่อไปนี้: denaturation เริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที; 30 รอบของ denaturating ที่ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที; หลอมที่ 55.5 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที; ส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา2 นาทีและขั้นตอนสุดท้ายส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR (10 ไมโครลิตร) ถูกย่อยสลายโดยไม่บริสุทธิ์ต่อไปด้วยข้อ จำกัดendonucleases CfoI, HaeIII และ HinfI (Roche) ผลิตภัณฑ์ PCR และชิ้นส่วนข้อจำกัด ของพวกเขาถูกแยกออกจากกันในวันที่ 1% และ 3% (w / v) agarose เจลตามลำดับ 1 ×บัฟเฟอร์ TAE หลังจากที่อิเลคเจลถูกย้อมด้วย ethidium bromide, มองเห็นภายใต้แสงยูวีใน G-Box Syngene ปฐม 10 เครื่องสแกนเนอร์ยูวี (สหราชอาณาจักร) ส่วนขนาดประมาณโดยเปรียบเทียบกับบันไดดีเอ็นเอ (100 bp BioRad) ยีสต์สายพันธุ์ที่ได้รับการจัดกลุ่มตามรูปแบบ RFLP ของพวกเขาและเมื่อเทียบกับรูปแบบRFLP อธิบายโดย Guillamon, Sabaté, ริโอ, คาโนและQuerol (1998), Esteve-Zarzoso et al, (1999), Sabate, คาโน Esteve- Zarzoso และ Guillamon (2002) และ Llanos Frutos, Fernandez- Espinar และ Querol (2004). การวิเคราะห์ลำดับของพื้นที่ D1 / การ D2 ของยีน 26S rRNA: ตัวแทนสายพันธุ์ของแต่ละPCR-RFLP รายละเอียดที่ได้รับได้รับการรักษาดำเนินการวิเคราะห์ลำดับของโดเมนD1 D2 และของ 26S rRNA ยีน ขยาย PCR ของภูมิภาคเรียกในยีน 26S rRNA กับไพรเมอร์ NL1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3) และNL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3 ') (เคิร์ทซ์และ Robnett, 1998) ได้ดำเนินการ ปฏิกิริยาการขยายและเงื่อนไขวิธี PCR เหมือนกับที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับ ITS 5.8 rRNA ภูมิภาคยกเว้นไพรเมอร์ที่ใช้(NL1 และ NL4) ผลิตภัณฑ์ขยายมีลำดับขั้นตอนโดย LGC ฟังก์ชั่น (เยอรมนี) และลำดับเมื่อเทียบกับผู้ที่อยู่ในฐานข้อมูลของGenBank ที่ศูนย์แห่งชาติเพื่อข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ(NCBI) โดยใช้ระเบิด(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) ที่จะระบุลำดับที่คล้ายคลึงกันกับสายพันธุ์อธิบาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 ระบุว่าเชื้อยีสต์ยีสต์ its1-5.8rdna-its2

: การกระทำโดยวิธีการอธิบายว่าโดย esteve zarzoso et al .
( 1999 ) แถบ วัฒนธรรมจากของเหลวสกัดจาก querol
, Barrio และราโมน ( 1992 ) เพื่อตรวจหาสารผสม ( 75 μ L ) ประกอบด้วย
0.5 μ mprimer its1 ( 5 ’ - ’ tccgtaggtgaacctgcgg-3 ) 0.5 μ mprimer
its4 ( 5 ’ - ’ tcctcccgcttattgatatgc-3 ) ( สีขาว บรันส์ , ลี &เทย์เลอร์
1990 ) , 10 μ M deoxynucleotides ( promega ) , MgCl2 1.5 มม. และ 1 หน่วย
ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ( promega ) เตรียมไว้แล้ว amplifications จำนวน
ในเทอร์มอไซเคล ์ ( อิเล็กตรอน , เทอร์โม สหรัฐอเมริกา ) ในเงื่อนไขต่อไปนี้ :
( เริ่มต้นที่ 95 องศา C เป็นเวลา 5 นาที ; 30 รอบ denaturating
ที่ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที ; annealing ที่ 55.5 ° C เป็นเวลา 2 นาที ;นามสกุลที่ 72 ° C
2min และสุดท้ายขยายขั้นตอนที่ 72 ° C 10min ผลิตภัณฑ์ PCR
( 10 μ L ) ถูกย่อยต่อไปโดยไม่มีข้อ จำกัด ผลิตและ cfoi haeiii
สงบเงียบ , hinfi ( โรช ) การตรวจผลิตภัณฑ์และข้อ จำกัด ของพวกเขาถูกแยกเศษ
1 % และ 3 % ( w / v )
, เจล , ตามลำดับ , บัฟเฟอร์เท 1 × . หลังจากอิเล็กอยู่
เจลเปื้อนทิเดียมโบรไมด์ , มองเห็นแสงยูวีใน g-box
syngene ปฐมกาล 10 ยูวีสแกนเนอร์ ( UK ) ส่วนขนาดประมาณ
โดยเปรียบเทียบกับดีเอ็นเอบันได ( 100 BP biorad ) ยีสต์ไอโซเลท
ถูกจัดกลุ่มตามโปรไฟล์ : และเมื่อเทียบกับรูปแบบ
: อธิบายโดย guillam เลออง sabat é , Barrio CANO , , ,
querol ( 1998 ) , esteve zarzoso et al . ( 1999 ) , sabate CANO , ,esteve -
zarzoso และ guillamon ( 2002 ) และ เดอ ชื่อทุ่งราบในอเมริกาใต้ frutos , และ -
espinar และ querol ( 2547 ) .
การวิเคราะห์ลำดับของภูมิภาค D1 / D2 ของ 26 rRNA ยีน : ตัวแทน
สายพันธุ์ของแต่ละโปรไฟล์ได้ว่าถูก

แสดงการวิเคราะห์ลำดับของ D1 และ D2 ของโดเมน
26 rRNA ยีน การขยาย PCR ของเจ้าตัวในภูมิภาค 26 rRNA ยีน
ด้วยไพรเมอร์ nl1 ( 5 ’ - ’ gcatatcaataagcggaggaaaag-3 )
nl4 ( 5 ’ - ’ ggtccgtgtttcaagacgg-3 ) ( เคิร์ทแมน& robnett , 1998 )
) แสดง การเพิ่มปริมาณและเงื่อนไขปฏิกิริยา PCR
( เหมือนที่อธิบายข้างต้นของ 5.8 rRNA เขต
ยกเว้นไพรเมอร์ที่ใช้ ( nl1 และ nl4 ) ขยายผลิตภัณฑ์โดยมีลำดับ lgc ไร

( เยอรมนี ) และลำดับเปรียบเทียบกับข้อมูลที่มีอยู่ในฐานข้อมูลขนาดที่
ศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ ( ncbi ) โดยใช้
ระเบิด ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ ) ถูกระบุโดย
ลำดับซึ่งอธิบายชนิดกับ