2.3. Phylogenetic relationshipsWe e

2.3. Phylogenetic relationships

We extracted DNA directly from blood samples using DNeasy kits (Qiagen, Valencia, CA, USA) following the manufacturer's recommendations. Following Martin et al. (2002), we examined 18S ribosomal RNA gene (18S rRNA). We amplified by PCR two overlapping fragment of 18S rRNA with newly designed primers from an alignment of frog trypanosomes. The first fragment—955 bp—was amplified with primers SSU1_F (TCTGGTTGATTCTGCCAGTAG) and SSU1_R (AAAACCAACAAAAGCCGAAA); the second fragment—980 bp—was amplified with primers SSU2_F (CCAAAGCAGTCATCCGACTT) and SSU2_R (AGGAGCATCACAGACCTGCT). These primers were designed from a large alignment of trypanosome species (Hamilton et al., 2007); these primer sequences are highly conserved among trypanosomes, likely are able to amplify multiple species of anuran trypanosomes. Both PCR amplifications were conducted with a touchdown PCR profile (Murphy and O'Brien, 2007). After cleaning the PCR product with ExoSAP-IT (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), we completed sequencing reactions in both directions with the ABI BigDye chemistry (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA), and sequenced the fragments on an ABI 3730xl DNA Analyzer automatic sequencer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA). We assembled contigs with the obtained sequence chromatograms in Geneious 6.1.6 (Biomatters, Auckland, New Zealand), resulting in sequences of 1688 bp for male #165504 (GenBank accession number: KM406915) and 1689 bp for male #165507 (GenBank accession number: KM406916).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. ผลความสัมพันธ์เราสามารถสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างเลือดที่ใช้ชุด DNeasy (Qiagen วาเลนเซีย CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตโดยตรง ต่อไปนี้ Martin et al. (2002), เราตรวจสอบยีน 18 ปี ribosomal RNA (rRNA 18 ปี) เราขยาย โดย PCR สองส่วนซ้อนทับกันของ rRNA 18 ปีด้วยไพรเมอร์ที่ออกแบบใหม่จากการจัดตำแหน่งของกบ trypanosomes ส่วนแรก — 955 bp — ถูกขยาย ด้วยไพรเมอร์ SSU1_F (TCTGGTTGATTCTGCCAGTAG) และ SSU1_R (AAAACCAACAAAAGCCGAAA); ส่วนสอง — 980 bp — ถูกขยาย ด้วยไพรเมอร์ SSU2_F (CCAAAGCAGTCATCCGACTT) และ SSU2_R (AGGAGCATCACAGACCTGCT) ไพรเมอร์เหล่านี้ออกแบบมาจากการจัดตำแหน่งใหญ่พันธุ์ trypanosome (แฮมิลตัน et al. 2007); ลำดับรองพื้นเหล่านี้มีอนุรักษ์สูงระหว่าง trypanosomes มีแนวโน้มจะขยายพันธุ์หลาย anuran trypanosomes Amplifications ทั้ง PCR ได้ดำเนินการกับเหรียญโปรไฟล์ PCR (เมอร์ฟี่และโอไบรอัน 2007) หลังทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ PCR กับไอ ExoSAP (Affymetrix ซานตาคลารา CA, USA), เราเสร็จลำดับปฏิกิริยาในทั้งสองทิศทางกับเคมี ABI BigDye (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ Inc. เมืองฟอสเตอร์ CA, USA), และเรียงลำดับเศษในการ ABI 3730xl วิเคราะห์ดีเอ็นเออัตโนมัติซีเควนเซอร์ (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ Inc. เมืองฟอสเตอร์ CA, USA) เราประกอบ contigs กับ chromatograms ลำดับที่ได้รับใน Geneious 6.1.6 (Biomatters โอ๊คแลนด์ นิวซีแลนด์), ในลำดับของ bp 1688 สำหรับชาย #165504 (เลขทะเบียน GenBank: KM406915) และ bp 1689 สำหรับชาย #165507 (เลขทะเบียน GenBank: KM406916)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 ความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการของ

เราสกัดดีเอ็นเอโดยตรงจากตัวอย่างเลือดโดยใช้ชุด DNeasy (Qiagen, วาเลนเซีย, CA, USA) ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต ต่อไปนี้มาร์ติน, et al (2002) เราตรวจสอบ 18S โซมอลยีน RNA (18S rRNA) เราขยายโดยวิธี PCR ที่ทับซ้อนกันสองส่วนของ 18S rRNA กับไพรเมอร์ที่ออกแบบใหม่จากการจัดตำแหน่งของระดับเชื้อกบ ส่วน-955 เป็นครั้งแรก BP-ถูกขยายด้วยไพรเมอร์ SSU1_F (TCTGGTTGATTCTGCCAGTAG) และ SSU1_R (AAAACCAACAAAAGCCGAAA); ชิ้นส่วนที่สอง-980 BP-ถูกขยายด้วยไพรเมอร์ SSU2_F (CCAAAGCAGTCATCCGACTT) และ SSU2_R (AGGAGCATCACAGACCTGCT) ไพรเมอร์เหล่านี้ได้รับการออกแบบจากการจัดตำแหน่งของสายพันธุ์ที่มีขนาดใหญ่ trypanosome (แฮมิลตัน, et al, 2007.); ลำดับไพรเมอร์เหล่านี้มีการอนุรักษ์อย่างสูงในหมู่ระดับเชื้อมีแนวโน้มที่จะสามารถขยายหลายสายพันธุ์ของระดับเชื้อกบ ทั้งเครื่องขยายเสียง PCR ได้ดำเนินการกับทัชดาวน์รายละเอียด PCR (เมอร์ฟี่และโอไบรอัน, 2007) หลังจากทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ PCR กับ ExoSAP-IT (Affymetrix, ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) เราเสร็จปฏิกิริยาลำดับในทั้งสองทิศทางกับ ABI BigDye เคมี (Applied Biosystems, Inc, ฟอสเตอร์ซิตี, CA, USA) และติดใจ ชิ้นส่วนในซีเควนอัตโนมัติ ABI 3730xl ดีเอ็นเอวิเคราะห์ (Applied Biosystems, Inc, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) เราประกอบ contigs กับ chromatograms ลำดับที่ได้รับใน Geneious 6.1.6 (Biomatters โอ๊คแลนด์นิวซีแลนด์) ส่งผลให้ในลำดับของ 1688 bp ชาย # 165504 (หมายเลขภาคยานุวัติ GenBank: KM406915) และ 1,689 bp ชาย # 165507 (หมายเลขภาคยานุวัติ GenBank : KM406916)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การยืนยันความสัมพันธ์เราสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างเลือดใช้ dneasy อิสระ ( QIAGEN , Valencia , CA , USA ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ต่อไปนี้มาร์ติน et al . ( 2002 ) เราตรวจพบยีนไรโบโซมอล อาร์เอ็นเอ ( 18S rRNA ) เราขยายด้วยเทคนิคสองซ้อนกันส่วนของ 18S rRNA กับใหม่ออกแบบไพรเมอร์จากการ trypanosomes กบ BP fragment-955 แรกของไพรเมอร์ ssu1_f ( tctggttgattctgccagtag ) และ ssu1_r ( aaaaccaacaaaagccgaaa ) ; BP fragment-980 ที่สองของไพรเมอร์ ssu2_f ( ccaaagcagtcatccgactt ) และ ssu2_r ( aggagcatcacagacctgct ) ไพรเมอร์เหล่านี้ถูกออกแบบจากแนวขนาดใหญ่ของทริปพาโนโซมชนิด ( แฮมิลตัน et al . , 2007 ) ; ลำดับไพรเมอร์เหล่านี้ที่มีการอนุรักษ์ของ trypanosomes มีแนวโน้มจะสามารถขยายหลายสปีชีส์ของสัตว์ trypanosomes . ทั้ง amplifications จำนวน PCR ด้วยทัชดาวน์และรายละเอียด ( เมอร์ฟี่และโอไบรอัน , 2007 ) หลังจากการทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ PCR กับ exosap ( affymetrix ซานตา คลาร่า , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา ) , เราเสร็จสิ้นการปฏิกิริยาในทั้งสองทิศทางกับอบิ bigdye เคมี ( Applied Biosystems ( Foster City , CA , USA ) และลำดับเบสใน 3730xl เศษวิเคราะห์ DNA sequencer ABI อัตโนมัติ ( Applied Biosystems ) อุปถัมภ์ เมือง , CA , USA ) เราได้ลำดับสูงประกอบกับกลิ่นใน geneious 6.1.6 ( biomatters โอ๊คแลนด์ นิวซีแลนด์ ) ผลในลำดับของเบสก็ได้ชาย # 165504 ( ขนาดหนังสือเลขที่ : km406915 1689 BP ) และชาย # 165507 ( ขนาดหนังสือเลขที่ : km406916 )