Additional informationBackgroundPro

Additional information
Background
Protoplasts are thelivingmaterial ofaplantorbacterial cell,whichincludethe protoplasm and plasma
membrane after the cell wall is removed. Due to removal of the cell wall, plant protoplasts have been
widely used for genetic transformation, cell fusion [5] and somatic mutation for generating unique and
novel plants [3,6–8]. Protoplasts obtained through enzymatic cell wall digestion are highly vacuolated
and fragile and are easy to rupture during the following experimental steps, such as washing, isolation,
and transfection, making it difficult for long-term culture and monitoring of biological processes.
Therefore, it is necessary to protect isolated protoplasts from disruption by immobilization.
Polymers prepared from natural or biocompatible gelling agents, such as agarose [9,10], gellangum
[11], and alginate [2–4,12], are often used as the supporting matrices for cells. Alginate is most
popular because the chelation between Na-alginate and calcium chloride does not require high
temperature and organic solvents. Meanwhile, Ca-alginate can be conveniently de-polymerized by
potassium citrate, releasing encapsulated cells without damage. Although alginate has been widely
used for the entrapment of protoplast in the form of beads [13–20] and
film [2–4,12], it is not
firm
enough to provide a good protection for entrapped cells [10], especially when the experimental
procedure needs repeated washing and cell collecting. Because silica is chemically inert, optically
transparent, biologically resistant to microbial attack, mechanically strong, thermally stable and
versatile in shape and size, silica-based matrices have been successfully used to directly encapsulate
plant cells [21–24] or with a multiple step procedure [25–27] in recent years. For the direct
immobilization of plant cell, the colloidal silica interacts strongly with cell walls [27]. For the two-step
procedure, cells are
first immobilized in Ca-alginate beads that are subsequently trapped in silica
matrix, so that harmful contact between cells and the silica precursors is avoided [25].
However, protoplasts without cell walls are more fragile compared with normal plant cell;
therefore, the immobilization materials and procedures should be more carefully designed. Inspired
by the above studies, we outline a procedure in this work describing the immobilization of tobacco
protoplasts by the formation of a uniform
film instead of beads. Moreover, we demonstrate for the
first
time a combined
film strategy with the cell-friendly Transwell instead of the glass slide as the
substrate, which greatly reduces mechanical damage to the protoplasts, and facilitates easy washing
and transfer of cells as well as easy collection of cell secretion or metabolites.
Specifically, in our two-step procedure, the protoplast is
first immobilized within Ca-alginate gel in
the form of
film on Transwell membrane to make protoplasts evenly distributed, then entrapped by
silica sol–gel. After the silica sol–gel solidifies, the Ca-alginate is liquefied by potassium citrate, leaving
protoplasts entrapped in the cavity of silica network, and the viability of immobilized protoplasts is
checked over several days. This immobilization technique can be used on other plant protoplast by
using the appropriate enzyme solution, protoplast medium, washing, and incubation solutions. To
maintain protoplast viability, the osmolality and pH must be optimized. Keeping an optimized
concentration of mannitol and pH in all of the solutions contacting protoplasts is critical to the
viability of protoplast. We had initially tried to use immobilized protoplasts for transient gene
expression, and despite the low transfection efficiency, this simple approach in immobilization of
protoplasts demonstrates the potential to facilitate easy experimental manipulation in the study of
transient gene expression, metabolite production and migration assay. Because there are many factors
affecting biological processes, all further studies should be systematically examined to determine
optimal conditions in order for a good application.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ข้อมูลเพิ่มเติมพื้นหลังโปมีเซลล์ ofaplantorbacterial thelivingmaterial, whichincludethe โพรโทพลาสซึม และพลาสม่าเมมเบรนหลังจากผนังเซลล์จะถูกลบออก เนื่องจากการกำจัดผนังเซลล์ พืชโปได้ใช้สำหรับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม อาหาร [5] และเซลล์กลายพันธุ์ somatic สำหรับการสร้างเอกลักษณ์ และนวนิยายพืช [3,6-8] โปรับผ่านผนังเซลล์เอนไซม์ในระบบย่อยอาหารมีสูง vacuolatedและเปราะบาง และง่ายต่อการแตกระหว่างทดลองดัง เช่น แยกและ transfection ทำให้ยากสำหรับวัฒนธรรมระยะยาว และการตรวจสอบของกระบวนการทางชีวภาพดังนั้น จึงเป็นความจำเป็นต้องปกป้องโปแยกจากทรัพย โดยตรึงโปโพลิเมอร์ที่เตรียมจากธรรมชาติ หรือชีวภาพ gelling ตัวแทน เช่น agarose [9,10], gellangum[11], และแอลจิเนต [2-4,12], มักใช้เป็นการสนับสนุนในเซลล์ แอลจิเนตเป็นส่วนใหญ่โรงแรมยอดนิยมเนื่องจาก chelation ระหว่างนาแอลจิเนตและแคลเซียมคลอไรด์ต้องสูงอุณหภูมิและอินทรีย์ ในขณะเดียวกัน แอลจิเนต Ca สามารถถูกเชิญ de-polymerized โดยโพแทสเซียมซิเตรต ปล่อยเซลล์สรุป โดยไม่มีความเสียหาย ถึงแม้ว่าแอลจิเนตได้รับกันอย่างแพร่หลายใช้สำหรับ entrapment ของ protoplast ในรูปแบบของลูกปัด [13 – 20] และฟิล์ม [2-4,12], ไม่บริษัทพอที่จะให้การป้องกันที่ดีสำหรับเก็บกักเซลล์ [10], โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อการทดลองขั้นตอนต้องซักซ้ำและการเก็บรวบรวมเซลล์ เนื่องจากซิลิกาเป็นสารเคมี inert, opticallyชิ้นทนต่อจุลินทรีย์โจมตี กลไกแข็งแรง มั่นคงแพ โปร่งใส และหลากหลายในรูปร่างและขนาด ซิลิก้าโดยใช้เมทริกซ์สำเร็จใช้การซ่อนโดยตรงพืชเซลล์ [21-24] หรือมีหลายขั้นตอน [25 – 27] ในปี สำหรับตรงตรึงโปของเซลล์พืช ซิลิก้า colloidal โต้ตอบอย่างยิ่งกับเซลล์ผนัง [27] สำหรับสองขั้นตอนขั้นตอน เซลล์อยู่หาในเม็ดแอลจิเนต Ca ที่ติดอยู่ในซิลิก้ามาก่อนเมทริกซ์ ดังนั้นผู้ติดต่อที่เป็นอันตรายระหว่างเซลล์และ precursors นส่วนหลีกเลี่ยง [25]อย่างไรก็ตาม โป โดยผนังเซลล์จะเปราะบางมากขึ้นเมื่อเทียบกับพืชปกติเซลล์ดังนั้น ตรึงโปวัสดุและขั้นตอนควรระมัดระวังมากออกแบบ แรงบันดาลใจโดยการศึกษาข้างต้น เราเค้าร่างขั้นตอนในการทำงานนี้อธิบายตรึงโปยาสูบโดยการก่อตัวของเหมือนโปฟิล์มแทนลูกปัด นอกจากนี้ เราแสดงให้เห็นถึงการครั้งแรกเวลาที่รวมกลยุทธ์กับ Transwell เป็นเซลล์แทนภาพนิ่งแก้วเป็นฟิล์มพื้นผิว มากลดความเสียหายของเครื่องจักรกลโป และอำนวยความสะดวกซักง่ายและถ่ายโอนเซลล์และชุดง่ายของเซลล์หลั่งหรือ metabolitesโดยเฉพาะ ขั้นตอนสองขั้นตอนของเรา protoplast เป็นหาภายในเจแอลจิเนต Ca ในครั้งแรกรูปแบบของฟิล์มบนเมมเบรน Transwell ทำโปเท่า ๆ กันกระจาย แล้วเก็บกักโดยโซลเจล หลังจากการโซลเจล solidifies, Ca-แอลจิเนตจะหมุน โดยโพแทสเซียมซิเตรต ออกจากโปเก็บกักในช่องของเครือข่ายซิลิก้า และชีวิตของโปเอนไซม์คือตรวจสอบไปหลายวัน สามารถใช้เทคนิคนี้ตรึงโปบน protoplast พืชอื่น ๆ โดยใช้โซลูชันที่เหมาะสมของเอนไซม์ protoplast กลาง ซักผ้า และโซลูชั่นคณะทันตแพทยศาสตร์ ถึงรักษาชีวิต protoplast, osmolality และต้องปรับค่า pH การเพิ่มประสิทธิภาพการรักษาความเข้มข้นของ mannitol และ pH ในโซลูชั่นติดต่อโปมีความสำคัญต่อการชีวิตของ protoplast เราได้เริ่มพยายามใช้โปเอนไซม์สำหรับยีนแบบฉับพลันนิพจน์ และแม้ มี ประสิทธิภาพ transfection ต่ำ วิธีการอย่างนี้ในตรึงโปโปแสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการช่วยจัดการง่ายทดลองในการศึกษาแสดงออกของยีนแบบฉับพลัน metabolite ทดสอบผลิตและโยกย้าย เนื่องจากมีปัจจัยหลายอย่างส่งผลกระทบต่อกระบวนการทางชีวภาพ ศึกษาเพิ่มเติมทั้งหมดควรมีระบบตรวจสอบกำหนดเงื่อนไขที่เหมาะสมเพื่อให้ใบสมัคร

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Additional information
ข้อมูลเพิ่มเติมพื้นหลังBackground
protoplasts มี thelivingmaterial เซลล์ ofaplantorbacterial, whichincludethe Protoplasts are thelivingmaterial ofaplantorbacterial cell,whichincludethe protoplasm and plasma
สิ่งมีชีวิตอยู่ในเซลล์ของสัตว์และพืชและพลาสม่าเยื่อหลังจากที่ผนังเซลล์จะถูกลบออก เนื่องจากการกำจัดของผนังเซลล์ protoplasts membrane after the cell wall is removed. Due to removal of the cell wall, plant protoplasts have been
พืชได้รับการใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมของเซลล์ฟิวชั่น[5] widely used for genetic transformation, cell fusion [5] and somatic mutation for generating unique and
และการกลายพันธุ์ของร่างกายในการสร้างเอกลักษณ์และพืชนวนิยาย[3,6-8] protoplasts novel plants [3,6–8]. Protoplasts obtained through enzymatic cell wall digestion are highly vacuolated
ที่ได้รับผ่านการย่อยผนังเซลล์ของเอนไซม์เป็นอย่างสูงแวคิวโอและเปราะบางและง่ายต่อการแตกร้าวในระหว่างขั้นตอนการทดลองต่อไปนี้เช่นซักผ้าแยกและand fragile and are easy to rupture during the following experimental steps, such as washing, isolation,
transfection ทำให้มันเป็นเรื่องยากสำหรับวัฒนธรรมในระยะยาวและการตรวจสอบของกระบวนการทางชีวภาพ. and transfection, making it difficult for long-term culture and monitoring of biological processes.
ดังนั้นจึงเป็น ที่จำเป็นเพื่อปกป้อง protoplasts แยกออกจากการหยุดชะงักจากการตรึง. Therefore, it is necessary to protect isolated protoplasts from disruption by immobilization.
โพลีเมอที่เตรียมจากสารก่อเจลธรรมชาติหรือชีวภาพเช่น agarose [9,10] gellangum Polymers prepared from natural or biocompatible gelling agents, such as agarose [9,10], gellangum
[11] และอัลจิเนต [2-4,12] มักจะใช้เป็นเมทริกซ์ที่สนับสนุน สำหรับเซลล์ อัลจิเนตเป็นส่วนใหญ่ที่นิยมเพราะขับระหว่างนาอัลจิเนตและแคลเซียมคลอไรด์ไม่จำเป็นต้องสูงอุณหภูมิและตัวทำละลายอินทรีย์ ขณะเดียวกันอัลจิเนต Ca-สามารถสะดวก de-polymerized โดยซิเตรตโพแทสเซียมปล่อยเซลล์ห่อหุ้มโดยไม่มีความเสียหาย แม้ว่าอัลจิเนตที่ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางที่ใช้ในการกักเก็บของโปรโตพลาในรูปแบบของเม็ด [13-20] และภาพยนตร์[2-4,12] มันไม่ได้เป็นบริษัท ที่เพียงพอที่จะให้การป้องกันที่ดีสำหรับเซลล์กัก[10] โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อ ทดลองขั้นตอนการซักผ้าซ้ำความต้องการและการจัดเก็บภาษีมือถือ เพราะซิลิกาเป็นปฏิกิริยาทางเคมีสายตาโปร่งใสทนต่อการโจมตีทางชีวภาพจุลินทรีย์ที่แข็งแกร่งกลไกความร้อนที่มั่นคงและหลากหลายในรูปทรงและขนาดเมทริกซ์ซิลิกาตามที่ได้รับการใช้ประสบความสำเร็จโดยตรงแค็ปซูลเซลล์พืช[21-24] หรือกับหลายขั้นตอน ขั้นตอน [25-27] ในปีที่ผ่านมา สำหรับตรงตรึงเซลล์พืช, ซิลิกาคอลลอยด์โต้ตอบอย่างมากกับผนังเซลล์ [27] [11], and alginate [2–4,12], are often used as the supporting matrices for cells. Alginate is most
popular because the chelation between Na-alginate and calcium chloride does not require high
temperature and organic solvents. Meanwhile, Ca-alginate can be conveniently de-polymerized by
potassium citrate, releasing encapsulated cells without damage. Although alginate has been widely
used for the entrapment of protoplast in the form of beads [13–20] and
film [2–4,12], it is not
firm
enough to provide a good protection for entrapped cells [10], especially when the experimental
procedure needs repeated washing and cell collecting. Because silica is chemically inert, optically
transparent, biologically resistant to microbial attack, mechanically strong, thermally stable and
versatile in shape and size, silica-based matrices have been successfully used to directly encapsulate
plant cells [21–24] or with a multiple step procedure [25–27] in recent years. For the direct
immobilization of plant cell, the colloidal silica interacts strongly with cell walls [27]. For the two-step
procedure, cells are
first immobilized in Ca-alginate beads that are subsequently trapped in silica
matrix, so that harmful contact between cells and the silica precursors is avoided [25].
However, protoplasts without cell walls are more fragile compared with normal plant cell;
therefore, the immobilization materials and procedures should be more carefully designed. Inspired
by the above studies, we outline a procedure in this work describing the immobilization of tobacco
protoplasts by the formation of a uniform
film instead of beads. Moreover, we demonstrate for the
first
time a combined
film strategy with the cell-friendly Transwell instead of the glass slide as the
substrate, which greatly reduces mechanical damage to the protoplasts, and facilitates easy washing
and transfer of cells as well as easy collection of cell secretion or metabolites.
Specifically, in our two-step procedure, the protoplast is
first immobilized within Ca-alginate gel in
the form of
film on Transwell membrane to make protoplasts evenly distributed, then entrapped by
silica sol–gel. After the silica sol–gel solidifies, the Ca-alginate is liquefied by potassium citrate, leaving
protoplasts entrapped in the cavity of silica network, and the viability of immobilized protoplasts is
checked over several days. This immobilization technique can be used on other plant protoplast by
using the appropriate enzyme solution, protoplast medium, washing, and incubation solutions. To
maintain protoplast viability, the osmolality and pH must be optimized. Keeping an optimized
concentration of mannitol and pH in all of the solutions contacting protoplasts is critical to the
viability of protoplast. We had initially tried to use immobilized protoplasts for transient gene
expression, and despite the low transfection efficiency, this simple approach in immobilization of
protoplasts demonstrates the potential to facilitate easy experimental manipulation in the study of
transient gene expression, metabolite production and migration assay. Because there are many factors
affecting biological processes, all further studies should be systematically examined to determine
optimal conditions in order for a good application.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ข้อมูลเพิ่มเติม
พื้นหลัง
เซลล์เป็นเซลล์ ofaplantorbacterial thelivingmaterial whichincludethe โพรโทพลาสซึมและพลาสม่า ,
แผ่นหลัง ผนังเซลล์จะถูกเอาออก เนื่องจากการกำจัดเซลล์ผนังเซลล์พืชได้
ใช้อย่างกว้างขวางสำหรับการถ่ายยีน , เซลล์ฟิวชั่น [ 5 ] และโซมาติคมิวเทชันสำหรับการสร้างเอกลักษณ์และ
นวนิยายพืช 3 , 6 ) [ 8 ] โปรโตพลาสต์ที่ได้ผ่านการย่อยด้วยเอนไซม์สูง vacuolated ผนังเซลล์
และเปราะบางและง่ายต่อการแตกระหว่างขั้นตอนการทดลองดังต่อไปนี้เช่นซักผ้า , การแยก
สำหรับและทำให้ยากสำหรับวัฒนธรรมระยะยาวและการตรวจสอบของกระบวนการทางชีวภาพ
จึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องปกป้องแยกโปรโตพลาสต์จากการหยุดชะงักโดยการตรึง .
พอลิเมอร์ที่เตรียมจากธรรมชาติหรือ gelling ตัวแทนทางชีวภาพ เช่น 9,10 , [ ] , เจลแลนกัม
[ 11 ] และ [ 2 ] อัล - 4,12 มักจะใช้เป็นสนับสนุนเมทริกซ์ เซลล์ อัลจิเนตเป็นที่สุด
เป็นที่นิยมเพราะ chelation ระหว่างนา อัลจิเนตและแคลเซียมคลอไรด์ไม่ต้องสูง
อุณหภูมิและตัวทำละลายอินทรีย์ ในขณะเดียวกัน , CA แอลสามารถค้นหา de โพลิเมอร์โดย
โพแทสเซียมซิเตรต การห่อหุ้มเซลล์โดยไม่เกิดความเสียหาย แม้ว่าแอลได้รับอย่างกว้างขวาง
ใช้สำหรับการแยกโปรโตพลาสต์จากในรูปแบบของลูกปัด [ 13 - 20 ] และ
ภาพยนตร์ [ 2 – 4,12 ] มันไม่ได้
บริษัท
เพียงพอที่จะให้มีการป้องกันที่ดีสําหรับกักเซลล์ [ 10 ] , โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อทดลอง
ขั้นตอนความต้องการซ้ำซักและเก็บเซลล์ เนื่องจากสารเฉื่อยทางเคมี optically
โปร่งใส ป้องกันการโจมตีทางชีวภาพ จุลินทรีย์ที่แข็งแรง มั่นคง และการให้โดยอัตโนมัติ
หลากหลายในรูปร่างและขนาด , ซิลิก้าจากเมทริกซ์ได้รับเรียบร้อยแล้วใช้ตรงแค็ปซูล
เซลล์พืช [ 21 – 24 ] หรือกับหลายขั้นตอนขั้นตอน [ 25 – 27 ] ในปีล่าสุด สำหรับ โดยตรง
การตรึงเซลล์พืช , ซิลิกาคอลลอยด์โต้ตอบอย่างมากกับเซลล์ผนัง [ 27 ] สำหรับแบบสองขั้นตอน
เซลล์เป็นขั้นตอน
แรกที่ตรึงในเม็ดอัลประเทศสหรัฐอเมริกา ต่อมาติดอยู่ในซิลิกา
เมทริกซ์เพื่อให้ติดต่อที่เป็นอันตรายระหว่างเซลล์และชนิดสารตั้งต้น คือหลีกเลี่ยง [ 25 ]
อย่างไรก็ตาม เซลล์ไม่มีผนังเซลล์มีความเปราะบางมากขึ้นเมื่อเทียบกับเซลล์พืชปกติ
ดังนั้น การตรึงวัสดุและขั้นตอนควรออกแบบมาอย่างระมัดระวัง แรงบันดาลใจจาก
จากการศึกษาข้างต้น เราเค้าร่างขั้นตอนในงานนี้อธิบายผลของยาสูบ
โปรโตพลาสต์จากการก่อตัวของเครื่องแบบ
ภาพยนตร์แทนลูกปัด นอกจากนี้ เราแสดงให้เห็นถึงสำหรับ
ครั้งแรก
เวลารวม
ภาพยนตร์กลยุทธ์กับเซลล์เป็นกันเอง transwell แทนที่จะเลื่อนแก้วเป็น
พื้นผิวที่ช่วยลดความเสียหายทางกลที่เหมาะสมและสะดวกง่ายต่อการซักผ้า
และการถ่ายโอนของเซลล์ รวมทั้งเซลล์หลั่งสารคอลเลกชันที่ง่ายหรือ .
โดยเฉพาะในขั้นตอนที่ 2 ของเรา โปร คือ
แรกที่ตรึงในเนตเจลในประเทศสหรัฐอเมริกา
รูปแบบของ
ภาพยนตร์ใน transwell เมมเบรนเพื่อให้กระจายต่อ แล้วตกลงโดย
( ซอลเจลซิลิกา หลังจากที่โซล–ซิลิกาเจลจับตัวเป็นก้อน , CA อัลจิเนตเป็นเหลวโดยโพแทสเซียมซิเตรต ออกจาก
เอนไซม์ตรึงในโพรงของเครือข่ายซิลิกา และสามารถตรึงเอนไซม์คือ
ดูไปหลายๆ วัน ผลการศึกษานี้สามารถใช้เทคนิคโปรโตพลาสต์พืชอื่น ๆโดย
การใช้สารละลายเอนไซม์ที่เหมาะสมจำนวนกลาง , ซักผ้า , และบ่มโซลูชั่น เพื่อ
รักษาโปรอยู่ตลอดเวลา ค่า pH จะต้องปรับให้เหมาะสม การรักษาที่ดีที่สุด
ความเข้มข้นของ mannitol และ pH ในทั้งหมดของโซลูชั่นที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญที่จะติดต่อ
ความมีชีวิตของโปร . เราก็เริ่มพยายามที่จะใช้สำหรับตรึงเอนไซม์และยีน
การแสดงออก และมีประสิทธิภาพสำหรับต่ำ ซึ่งวิธีการที่ง่ายในการตรึง
แสดงให้เห็นถึงศักยภาพที่เหมาะสมเพื่อความสะดวกในการจัดการที่ง่ายในการศึกษาทดลอง
และการแสดงออกของยีนในระดับการผลิตและการโยกย้าย เพราะมีปัจจัยหลายอย่าง
ที่มีผลต่อกระบวนการทางชีวภาพ การศึกษาต่อไปควรจะมีระบบการตรวจสอบเพื่อตรวจสอบ
สภาวะที่เหมาะสมเพื่อให้โปรแกรมดี