Culture-dependentandculture-indepen

Culture-dependentandculture-independentmethodswerecombinedfortheinvestigationofaceticacidbacteria
(AAB) populations in traditionally produced vinegars and mother of vinegar samples obtained from apple and
grape. The culture-independent denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis, which targeted the
V7–V8 regions of the 16S rRNA gene, showed that Komagataeibacter hansenii and Komagataeibacter europaeus/
Komagataeibacter xylinus were the most dominant species in almost all of the samples analyzed directly. The
culture-independent GTG 5 -rep PCR fingerprinting was used in the preliminary characterization of AAB isolates
and species-level identification was carried out by sequencing of the 16S rRNA gene, 16S–23S rDNA internally
transcribedto thespacer(ITS)region and tufgene.Acetobacterokinawensiswasfrequentlyisolatedfromsamples
obtained from apple while K. europaeus was identified as the dominant species, followed by Acetobacter
indonesiensis in the samples originating from grape. In addition to common molecular techniques, real-time
PCR intercalating dye assays, including DNA melting temperature (Tm) and high resolution melting analysis
(HRM),wereappliedtoaceticacidbacterialisolatesforthefirsttime.ThetargetsequenceofITSregiongenerated
species-specific HRM profiles and Tm values allowed discrimination at species level.
1. Introduction
Vinegar is the product of a two-step fermentation process involving
the alcoholic fermentation of sugars into ethanol by yeasts, and, subse-
quently, the oxidation of ethanol into acetic acid by acetic acid bacteria
(AAB). Vinegar has been renowned as a food preservative since ancient
times andisstillusedtodayinthefood industryas ahighlysought-after
condimentand a multi-functionalproductutilized for pickling, preserv-
ing and flavor-balancing purposes (Sengun and Karapinar, 2004;
Steinkraus, 2002). All raw materials containing sugar or fruits can be
employedasstartingsubstancesforproducingvinegar.Severaldifferent
types of vinegars are produced around the world by using diverse
manufacturing techniques and raw materials native to specific areas.
In general, two well-defined methods, namely, slow surfaceculture fer-
mentation and fast submerged fermentation, are used in vinegar
manufacturing(Tesfayeetal.,2002). Theslow method is also called tra-
ditional vinegar production and the AAB grow on the surface of the liq-
uid during the fermentation process, which may take from several
weeks up to a few months (Nanda et al., 2001). A non-toxic film com-
posed of AAB and cellulose accumulates on the surface of the vinegar
throughout the oxidation process. This film, called “mother of vinegar”,
is used in the back-slopping practice as an indigenous starter culture to
trigger acetification in the production of traditional vinegar (Holzapfel,
2002; Hidalgo et al., 2010).
As a result of the two stage fermentation, several microbial species
show competitive activity in the vinegar throughout the production
process (Holzapfel, 2002). The microbial transformations give the
characteristic taste and fragrance to vinegar and the microbial metabo-
lites have beneficial health effects (Shimoji et al., 2002; Stasiak and
Blażejak, 2009). Acetic acid bacteria, which carry out the second trans-
formation,namely oxidative fermentation,are oneof themain microbi-
al populations in vinegar.
The three genera of acetic acid bacteria, Acetobacter (A.),
Gluconacetobacter (Ga.) and Komagataeibacter (K.) are mainly re-
sponsible for acetic fermentation in vinegar. The species of
Acetobacter aceti, Acetobacter malorum, Acetobacter pasteurianus,
Acetobacter pomorum, Komagataeibacter europaeus, Komagataeibacter
hansenii, Komagataeibacter intermedius, Komagataeibacter oboediens,
Komagataeibacter xylinus, Komagataeibacter medellinensis and
Komagataeibacter maltiaceti were previously detected in the vinegar
ecosystem (Sievers et al., 1992; Trcek et al., 1997; Sokollek et al.,
1998; Boesch et al., 1998; Trcek et al., 2000; De Vero et al., 2006;
Gullo et al., 2006; Yamada et al., 2012; Castro et al., 2013; Slapsak
etal.,2013).However,theprofilesofAABareunstableandshowpartic-
ular diversity in accordance with the raw material characteristics and
production process features (Gullo et al., 2009).
Identification of AAB based only on morphological, biochemical, and
physiological characteristics is not reliable and, therefore, is insufficient
International Journal of Food Microbiology 204 (2015) 9–16
⁎ Corresponding author. Tel.: [phone]/32729.
E-mail address: [e-mail] (Z. Kesmen).
http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.03.013
0168-1605/© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.
Contents lists available at ScienceDirect
International Journal of Food Microbiology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/ijfoodmicro
because of the poor reproducibility and discriminatory power of these
phenotypic tests (Cleenwerck and De Vos, 2008; Papalexandratou
et al., 2009). For this reason, nucleic acid-based molecular methods
are now used to characterize and identify isolates of AAB from wine
andvinegarecosystems.ThesehaveincludedEnterobacterialRepetitive
Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) (Gonzalez et al., 2004; Gullo
et al., 2009; Nanda et al., 2001), Repetitive Extragenic Palindromic-
PCR (REP-PCR) (González et al., 2004), (GTG) 5 -rep-PCR fingerprinting
(De Vuyst et al., 2008) and RAPD-PCR (Trcek et al., 1997; Bartowsky
etal.,2003;Nandaetal.,2001).Areliabletaxonomicidentificationisob-
tainedwhenthesetechniquesarecombinedwiththesequencingof16S
rDNAgenes(Gonzalez,2005)andinternaltranscribedspacersequences
(ITS) of the 16S–23S rDNA genes (Gonzalez and Mas, 2011). Restriction
fragment length polymorphism (RFLP) analysis of the ribosomal genes
or their spacer regions has also been used for the identification of AAB
present in food-related ecosystems (Gullo et al., 2006; Ruiz et al.,
2000; Trcek and Teuber, 2002; Trcek, 2005; Vegas et al., 2010).
The combination of culture-independent methods with culture-
dependent methods in a polyphasic system is recommended as an ef-
fective approach to overcome the difficulties regarding the isolation
and cultivation of AAB strains (Cleenwerck and De Vos, 2008; Gullo
et al., 2009; Sengun and Karapinar, 2011). In the last decade, several
studies using the culture-independent DGGE and Temporal Tempera-
ture Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) techniques were reported
for the characterization of the microbial community in vinegar and the
determination of population dynamics of AAB during fermentation
(De Vero et al., 2006; De Vero and Giudici, 2008; Ilabaca et al., 2008).
In addition, the real-time PCR technique has also been proposed for
culture-independent detection of different genera, or species, of AAB
(Andorra et al., 2008; Torija et al., 2010; Valera et al., 2013). Recently,
the intercalating dye-based real-time PCR analysis involved in specific
melting temperature (Tm) and high-resolution melting analysis were
applied asa highly promisingnew approach for confirmingtheidentifi-
cation and groupingof the culturable strains belonging to different bac-
terialspecies(Kaoetal.,2007;Juvonenetal.,2008;Kesmenetal.,2014),
but not yet to AAB. These new approaches provide a rapid and reliable
tool for the detection of small differences in the target DNA sequences
of closely related species.
The identification of indigenous AAB has critical importance to im-
prove the process control, overcome unpredictable fermentation prob-
lems and select the most suitable strains as the potential starter
culture. Therefore, in this study, we aimed to detect and compare AAB
populations in grape and apple vinegar and in mother of vinegar
samples obtained from different regions of Turkey. Thus the culture-
independent PCR-DGGE technique was combined with culture-
dependent molecular techniques, including (GTG) 5 -rep-PCR and
sequence analysis of the 16S rRNA gene, 16S–23S rRNA internal tran-
scribed sequences (ITS) region and tuf gene for identification and char-
acterization of AAB isolated from analyzed samples. Furthermore, real-
time PCR intercalating dye-based analysis was applied to AAB isolates
to obtain species-level discrimination.
2. Materials and methods
2.1. Vinegar and mother of vinegar samples
Vinegar and mother of vinegar samples produced by the spontane-
ous fermentation method were obtained from three different local pro-
ducers in Kayseri and Düzce, in Turkey. The samples, consisting of 2
grape vinegars (bg and eg) and their mothers (BG and EG), 2 apple vin-
egars (da and ha) and their mothers (DA and HA), were collected at the
end of the acetic fermentation from wood barrels in which traditional
surface fermentation is carried out. The acetic acid content of the vine-
gar samples were reported by producers as 3.96, 4.08, 4.28 and 4.37%
for the samples ha, da, bg and eg respectively. After the sampling
process, the vinegar and mother of vinegar samples were analyzed for
AAB using cultural and molecular methods.
2.2. Isolation of acetic acid bacteria (AAB)
10 ml of each of the 5 vinegar samples were diluted with 90 ml of
Maximum Recovery Diluent (Merck, GmbH, Darmstadt, Germany),
and homogenized for 2 min with a shaker (IKA, Germany). Serial deci-
mal dilutions were prepared with the same diluent and subjected to
the agar plate method for the isolation of AAB on GYC (5% D -glucose,
1% ethanol, 1% yeast extract, 1% CaCO 3 , 0.05% bromocresol purple, 2%
agar) and MYP (1% mannitol, 1% yeast extract, 0.3% peptone, 2% agar)
agar plates. To inhibit yeast growth, 100 ppm cycloheximide (Sigma)
was added to both agars. All plates were incubated at 30 °C for 5 days.
For each sample, 10–15 catalase-positive, oxidase-negative, and Gram-
negative colonies, showing different morphological characteristics
were purified by streak-plate technique and subjected to further char-
acterization. All isolates selected from samples were stored at −80 °C.
2.3. DNA extraction from pure cu

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัฒนธรรม-dependentandculture-independentmethodswerecombinedfortheinvestigationofaceticacidbacteriaประชากร (aab โดย) ซึ่งผลิต vinegars และแม่ตัวอย่างน้ำส้มสายชูที่ได้จากแอปเปิ้ล และองุ่น วัฒนธรรมอิสระ denaturing เจลไล่ระดับ electrophoresis (DGGE) วิเคราะห์ ซึ่งเป็นเป้าหมายแคว้น 16S rRNA ยีน V7-V8 พบที่ hansenii Komagataeibacter Komagataeibacter europaeus และ /Komagataeibacter xylinus สปีชีส์หลักมากที่สุดในตัวอย่างวิเคราะห์โดยตรงเกือบทั้งหมดได้ ที่วัฒนธรรมอิสระ GTG 5-ตัวแทน PCR ลายพิมพ์ใช้ในคุณสมบัติเบื้องต้นของ aab โดยแยกและพันธุ์ระดับรหัสถูกดำเนินการ โดยลำดับของยีน 16S rRNA, 16S – 23S rDNA ภายในภูมิภาค thespacer (ของ) transcribedto และ tufgene Acetobacterokinawensiswasfrequentlyisolatedfromsamplesได้รับจากแอปเปิ้ลในขณะที่คุณ europaeus ระบุเป็นสายพันธุ์หลัก ตาม Acetobacterindonesiensis ในตัวอย่างที่มาจากองุ่น นอกจากนี้ทั่วไปถึงระดับโมเลกุลเทคนิค เรียลไทม์Intercalating ย้อม assays รวมละลายอุณหภูมิ (Tm) และความละเอียดสูงละลายวิเคราะห์ DNA PCR(HRM), wereappliedtoaceticacidbacterialisolatesforthefirsttime ThetargetsequenceofITSregiongeneratedค่า Tm และโพรไฟล์ HRM species-specific ได้แบ่งแยกระดับพันธุ์1. บทนำน้ำส้มสายชูเป็นผลิตภัณฑ์ของเป็นสองขั้นตอนหมักกระบวนการเกี่ยวข้องกับหมักแอลกอฮอล์น้ำตาลเป็นเอทานอลโดย yeasts และ subse-quently ออกซิเดชันของเอทานอลเป็นแบคทีเรียกรดน้ำส้มโดยกรดอะซิติก(AAB โดย) น้ำส้มสายชูได้รับชื่อเสียงเป็น preservative อาหารตั้งแต่โบราณเวลา industryas andisstillusedtodayinthefood ahighlysought หลังcondimentand multi-functionalproductutilized สำหรับ pickling, preserv-กำลังและสร้างความสมดุลในรสชาติวัตถุประสงค์ (Sengun และ Karapinar, 2004Steinkraus, 2002) ทั้งหมดวัตถุดิบที่ประกอบด้วยน้ำตาลหรือผลไม้สามารถemployedasstartingsubstancesforproducingvinegar Severaldifferentชนิดของ vinegars ผลิตทั่วโลกโดยมีความหลากหลายการผลิตเทคนิคและวัตถุดิบพื้นถิ่นเฉพาะพื้นที่ทั่วไป โดยสองวิธี ได้แก่ ช้า fer surfaceculture-เอกสารและหมักน้ำท่วมอย่างรวดเร็ว ใช้ในน้ำส้มสายชูmanufacturing(Tesfayeetal.,2002) วิธี Theslow จะเรียกว่าตรา-ditional ผลิตน้ำส้มสายชูและ aab โดยเติบโตบนพื้นผิวของ liq-uid ในระหว่างกระบวนการหมัก ซึ่งอาจใช้เวลาจากหลายสัปดาห์ที่ผ่านมาได้ไม่กี่เดือน (นันดาและ al., 2001) เป็นพิษฟิล์ม com-อิทธพลของ aab โดย และเซลลูโลสสะสมบนพื้นผิวของน้ำส้มสายชูตลอดกระบวนการออกซิเดชัน ฟิล์มนี้ เรียกว่า "แม่น้ำส้มสายชู"ใช้ในทางปฏิบัติกลับ slopping เป็นวัฒนธรรมการชนสตาร์ทให้acetification ทริกเกอร์ในการผลิตน้ำส้มสายชูแบบดั้งเดิม (Holzapfel2002 Hidalgo et al., 2010)จากขั้นตอนที่สองหมัก จุลินทรีย์ชนิดต่าง ๆแสดงกิจกรรมแข่งขันในน้ำส้มสายชูตลอดการผลิตกระบวนการ (Holzapfel, 2002) ให้แปลงจุลินทรีย์รสชาดและกลิ่นน้ำส้มสายชูและในจุลินทรีย์ metabo-lites มีผลประโยชน์ต่อสุขภาพ (Shimoji et al., 2002 Stasiak และBlażejak, 2009) แบคทีเรียกรดอะซิติก การดำเนินการสองทรานส์-ผู้แต่ง หมักได้แก่ oxidative เป็นหนึ่งใน themain microbi-ประชากรอัลในน้ำส้มสายชูสกุลที่สามของแบคทีเรียกรดน้ำส้ม Acetobacter (เอ),Gluconacetobacter (Ga.) และ Komagataeibacter (เค) เป็นส่วนใหญ่ re-sponsible การหมักอะซิติกในน้ำส้มสายชู สายพันธุ์ของAcetobacter aceti, Acetobacter malorum, Acetobacter pasteurianusAcetobacter pomorum, Komagataeibacter europaeus, Komagataeibacterอินเทอร์มีเดียท Komagataeibacter, hansenii, Komagataeibacter oboediensKomagataeibacter xylinus, Komagataeibacter medellinensis และKomagataeibacter maltiaceti ก่อนหน้านี้ตรวจพบในน้ำส้มสายชูระบบนิเวศ (Sievers et al., 1992 Trcek และ al., 1997 Sokollek et al.,ปี 1998 Boesch และ al., 1998 Trcek และ al., 2000 เดอ Vero และ al., 2006Gullo et al., 2006 ยามาดะ et al., 2012 Al. ร้อยเอ็ด Castro, 2013 Slapsaketal., 2013) อย่างไรก็ตาม theprofilesofAABareunstableandshowpartic -ular หลากหลายตามลักษณะของวัตถุดิบ และคุณลักษณะการกระบวนการผลิต (Gullo et al., 2009)รหัส aab โดยยึดเฉพาะสัณฐาน ชีวเคมี และลักษณะสรีรวิทยาไม่น่าเชื่อถือ และ ดังนั้น ไม่เพียงพอสมุดรายวันระหว่างประเทศของจุลชีววิทยาอาหาร 204 (2015) 9-16ผู้ที่เกี่ยวข้อง⁎ โทร.: [phone]/32729ที่อยู่อีเมล: (z. Kesmen) ใน [e-mail]://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.03.0130168-1605 / © 2015 Elsevier b.v สงวนลิขสิทธิ์ทั้งหมดเนื้อหารายการ ScienceDirectสมุดรายวันระหว่างประเทศของจุลชีววิทยาอาหารหน้าแรกของสมุดรายวัน: www.elsevier.com/locate/ijfoodmicroreproducibility ดีและโจ่งแจ้งพลังงานเหล่านี้ทดสอบไทป์ (Cleenwerck และ De Vos, 2008 Papalexandratouร้อยเอ็ด al., 2009) ด้วยเหตุนี้ กรดนิวคลีอิกโดยวิธีโมเลกุลตอนนี้ใช้เพื่อกำหนดลักษณะ และแยกจากไวน์ของ aab โดยระบุandvinegarecosystems ThesehaveincludedEnterobacterialRepetitiveIntergenic มติ-PCR (เอริค-PCR) (Gonzalez et al., 2004 Gulloร้อยเอ็ด al., 2009 นันดาและ al., 2001), ซ้ำ Extragenic Palindromic -PCR (ตัวแทน-PCR) (González et al., 2004), (GTG) แทน 5--ลายพิมพ์ PCR(De Vuyst et al., 2008) และอาร์เอพีดี-PCR (Trcek และ al., 1997 Bartowskyetal., 2003 Nandaetal., 2001) Areliabletaxonomicidentificationisob-tainedwhenthesetechniquesarecombinedwiththesequencingof16SrDNAgenes (Gonzalez, 2005) andinternaltranscribedspacersequences(ของ) ของยีน rDNA 16S – 23S (Gonzalez และมาส 2011) ข้อจำกัดส่วนความยาวโพลีมอร์ฟิซึม (RFLP) วิเคราะห์ยีน ribosomalหรือภูมิภาคของตนเป็นตัวเว้นวรรคยังถูกใช้สำหรับการระบุของ aab โดยอยู่ในอาหารที่เกี่ยวข้องกับระบบนิเวศ (Gullo et al., 2006 Ruiz et al.,2000 Trcek และ Teuber, 2002 Trcek, 2005 สเวกัส et al., 2010)การรวมกันของวิธีการอิสระวัฒนธรรมและวัฒนธรรมขอแนะนำวิธีการอ้างอิงในระบบ polyphasic เป็น ef มี-fective วิธีการเอาชนะความยากลำบากเกี่ยวกับการแยกและปลูก aab โดยสายพันธุ์ (Cleenwerck และ De Vos, 2008 Gulloร้อยเอ็ด al., 2009 Sengun ก Karapinar, 2011) ในทศวรรษที่ผ่านมา หลายใช้วัฒนธรรมอิสระ DGGE และขมับอุณหภูมิ - การศึกษามีรายงานเทคนิค ture Electrophoresis เจลไล่ระดับสี (TTGE)สำหรับคุณสมบัติของชุมชนจุลินทรีย์ในน้ำส้มสายชูและกำหนดประชากร dynamics ของ aab โดยในระหว่างการหมัก(เด Vero และ al., 2006 เดอ Vero และ Giudici, 2008 Ilabaca et al., 2008)นอกจากนี้ เทคนิค PCR แบบเรียลไทม์ได้ถูกเสนอในตรวจสอบวัฒนธรรมอิสระของสกุลต่าง ๆ พันธุ์ aab โดย(อันดอร์รา et al., 2008 Torija et al., 2010 Valera et al., 2013) ล่าสุดintercalating ใช้การย้อมแบบเรียลไทม์ PCR วิเคราะห์เกี่ยวข้องกับเฉพาะอุณหภูมิการละลาย (Tm) และวิเคราะห์ความละเอียดสูงละลายได้ใช้ asa สูง promisingnew วิธีการสำหรับ confirmingtheidentifi -cation และ groupingof สายพันธุ์ culturable ที่เป็นสมาชิกของบัคต่าง ๆ -terialspecies (Kaoetal. 2007 Juvonenetal. 2008 Kesmenetal. 2014)แต่ไม่ ได้ ไป aab โดย ใหม่ ๆ เหล่านี้ให้รวดเร็ว และเชื่อถือได้เครื่องมือสำหรับการตรวจพบความแตกต่างเล็ก ๆ ในลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดรหัสของ aab โดยคนพื้นเมืองมีความสำคัญสำคัญถึง im-ควบคุมกระบวนการพิสูจน์ การเอาชนะ prob หมักไม่แน่นอน-lems และเลือกสายพันธุ์เหมาะเป็น starter มีศักยภาพวัฒนธรรม ดังนั้น ในการศึกษานี้ เรามีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบ และเปรียบเทียบ aab โดยประชากร ในองุ่นและแอปเปิ้ลน้ำส้มสายชู และ ในแม่น้ำส้มสายชูตัวอย่างที่ได้จากภูมิภาคต่าง ๆ ของตุรกี ดังนั้นการวัฒนธรรม-เทคนิค PCR DGGE อิสระถูกรวมกับวัฒนธรรม-ขึ้นอยู่กับโมเลกุลเทคนิค (GTG) แทน 5--PCR และวิเคราะห์ลำดับ 16S rRNA ยีน 16S – 23S rRNA ภายในทราน-ลำดับ scribed (ของ) ภูมิภาคและ tuf ยีนสำหรับรหัสและอักขระacterization ของ aab โดยแยกต่างหากจากตัวอย่างที่วิเคราะห์ นอกจากนี้ จริง-เวลา PCR intercalating ใช้ย้อมวิเคราะห์นำมาใช้ที่ aab โดยแยกรับแบ่งแยกชนิดระดับ2. วัสดุและวิธีการ2.1. น้ำส้มสายชูและแม่ตัวอย่างน้ำส้มสายชูน้ำส้มสายชูและแม่ตัวอย่างน้ำส้มสายชูที่ผลิต โดย spontane-วิธีหมัก ous ได้รับมาจากสามแตกต่างกันเฉพาะ pro-ducers ใน Kayseri และ Düzce ในตุรกี ตัวอย่าง ประกอบด้วย 2vinegars องุ่น (bg และ eg) และมารดาของพวกเขา (BG และ EG), 2 แอปเปิ้ลวิน -egars (ดา และฮา) และแม่ของพวกเขา (ดาและ HA), ถูกรวบรวมไว้ที่นี้สิ้นสุดการหมักอะซิติกจากถังไม้ที่ดั้งเดิมหมักผิวจะดำเนิน เนื้อหาของเถาวัลย์ - กรดอะซิติกมีรายงานตัวอย่าง gar คู โดยผลิต 3.96, 4.08, 4.28 และ 4.37%สำหรับตัวอย่างฮา ดา bg และเช่นตามลำดับ หลังจากการสุ่มตัวอย่างมีวิเคราะห์กระบวนการ น้ำส้มสายชู และแม่ตัวอย่างน้ำส้มสายชูสำหรับAab โดยใช้วิธีการทางวัฒนธรรม และระดับโมเลกุล2.2 การแยกแบคทีเรียกรดน้ำส้ม (aab โดย)10 มิลลิลิตรของตัวอย่างน้ำส้มสายชู 5 แห่งได้ผสมกับ ml 90 ของกู้สูงสุด Diluent (เมอร์ค GmbH ดาร์มส เยอรมนี),และ homogenized เป็นกลุ่มสำหรับ 2 นาทีกับเชคเกอร์ (IKA เยอรมนี) ประจำ deci-อัป dilutions พร้อม diluent เดียวกัน และอยู่ภายใต้การวิธีแผ่น agar สำหรับแยกของ aab โดยบน GYC (5% D-กลูโคสเอทานอล 1% สารสกัดจากยีสต์ 1%, 1% CaCO 3 สี ม่วง bromocresol 0.05%, 2%agar) และ MYP (mannitol 1% สารสกัดจากยีสต์ 1%, 0.3% peptone, agar 2%)agar แผ่น ยับยั้งการเจริญเติบโตของยีสต์ cycloheximide 100 ppm (ซิกมา)มีเพิ่มการ agars ทั้งสอง แผ่นทั้งหมดถูก incubated ที่ 30 ° C สำหรับ 5 วันแต่ละตัวอย่าง 10 – 15 catalase-บวก ลบ oxidase และกรัม-อาณานิคมลบ แสดงลักษณะสัณฐานที่แตกต่างกันบริสุทธิ์ โดยเทคนิคริ้ว plate และภายใต้อักขระเพิ่มเติม -acterization ทั้งหมดที่แยกได้จากตัวอย่างเลือกถูกเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส2.3. ดีเอ็นเอแยกจากบริสุทธิ์ cu

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ประชากรใน vinegars
ผลิตแบบดั้งเดิมและแม่ของกลุ่มตัวอย่างที่ได้จากน้ำส้มสายชูแอปเปิ้ลและองุ่น denaturing วัฒนธรรมอิสระลาดข่าวคราว (DGGE)
การวิเคราะห์ซึ่งเป้าหมายภูมิภาคV7-V8 ของยีน 16S rRNA แสดงให้เห็นว่า hansenii Komagataeibacter และ Komagataeibacter ยูโร /
Komagataeibacter xylinus ถูกสายพันธุ์ที่โดดเด่นที่สุดในเกือบทุกกลุ่มตัวอย่างวิเคราะห์โดยตรง
GTG วัฒนธรรมอิสระ 5 -rep PCR พิมพ์ลายนิ้วมือถูกใช้ในลักษณะเบื้องต้นของ AAB
แยกและบัตรประจำตัวสายพันธุ์ระดับได้ดำเนินการโดยลำดับของยีน16S rRNA, 16S-23S rDNA ภายใน
transcribedto thespacer (ITS) และภูมิภาค tufgene.Acetobacterokinawensiswasfrequentlyisolatedfromsamples
ที่ได้จากแอปเปิ้ลในขณะที่เคยูโรถูกระบุว่าเป็นสายพันธุ์ที่โดดเด่นตามด้วย Acetobacter
indonesiensis ในกลุ่มตัวอย่างที่มาจากองุ่น นอกจากเทคนิคโมเลกุลร่วมกันในเวลาจริงการตรวจย้อม PCR intercalating รวมทั้งอุณหภูมิหลอมเหลวดีเอ็นเอ (TM) และละลายความละเอียดสูง โปรไฟล์ HRM และค่า Tm ได้รับอนุญาตการเลือกปฏิบัติในระดับสายพันธุ์. 1 บทนำน้ำส้มสายชูเป็นผลิตภัณฑ์ของกระบวนการหมักสองขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับการหมักแอลกอฮอล์ของน้ำตาลเอทานอลโดยยีสต์และsubse- quently, ออกซิเดชันของเอทานอลลงในกรดอะซิติกจากแบคทีเรียกรดอะซิติก(AAB) น้ำส้มสายชูได้รับชื่อเสียงเป็นสารกันบูดอาหารตั้งแต่โบราณครั้ง andisstillusedtodayinthefood industryas ahighlysought หลัง condimentand หลาย functionalproductutilized สำหรับดอง preserv- ไอเอ็นจีและวัตถุประสงค์รสชาติที่สมดุล (Sengun และ Karapinar 2004; Steinkraus, 2002) วัตถุดิบทั้งหมดที่มีน้ำตาลหรือผลไม้สามารถemployedasstartingsubstancesforproducingvinegar.Severaldifferent ประเภท vinegars มีการผลิตทั่วโลกที่มีความหลากหลายโดยใช้เทคนิคการผลิตและวัตถุดิบที่มีถิ่นกำเนิดในพื้นที่เฉพาะ. โดยทั่วไปสองวิธีที่ดีที่กำหนดคือช้า surfaceculture fer- mentation และ หมักจมอยู่ใต้น้ำได้อย่างรวดเร็วและถูกนำมาใช้ในน้ำส้มสายชูผลิต(Tesfayeetal., 2002) วิธี Theslow จะเรียกว่าลองพิจารณาการผลิตน้ำส้มสายชูditional และ AAB เติบโตบนพื้นผิวของของเหลวuid ในระหว่างขั้นตอนการหมักซึ่งอาจต้องใช้เวลาหลายสัปดาห์ที่ผ่านมาถึงไม่กี่เดือน(ดา et al., 2001) สั่งภาพยนตร์ที่ปลอดสารพิษที่เกิดจาก AAB และเซลลูโลสสะสมบนพื้นผิวของน้ำส้มสายชูที่ตลอดกระบวนการออกซิเดชัน ภาพยนตร์เรื่องนี้เรียกว่า "แม่ของน้ำส้มสายชู" ถูกนำมาใช้ในทางปฏิบัติกลับ slopping เป็นวัฒนธรรมเริ่มต้นชนพื้นเมืองที่เรียกacetification ในการผลิตน้ำส้มสายชูแบบดั้งเดิม (Holzapfel, 2002. อีดัลโก et al, 2010). ในฐานะที่เป็นผลมาจากการที่ การหมักขั้นตอนที่สองสายพันธุ์จุลินทรีย์หลายแสดงกิจกรรมการแข่งขันในน้ำส้มสายชูตลอดการผลิตกระบวนการ(Holzapfel, 2002) แปลงจุลินทรีย์ให้รสชาติและกลิ่นหอมลักษณะการน้ำส้มสายชูและจุลินทรีย์ metabo- lites มีผลกระทบต่อสุขภาพที่เป็นประโยชน์ (Shimoji, et al., 2002; Stasiak และBlażejak 2009) แบคทีเรียกรดอะซิติกซึ่งดำเนินการทรานส์สองรูปแบบคือการหมักออกซิเดชันเป็น themain oneof microbi- ประชากรในอัลน้ำส้มสายชู. สามจำพวกแบคทีเรียกรดอะซิติก Acetobacter (ก) Gluconacetobacter (Ga.) และ Komagataeibacter (K .) ส่วนใหญ่จะเป็นอีกsponsible สำหรับการหมักอะซิติกในน้ำส้มสายชู ชนิดของAcetobacter Aceti, Acetobacter Malorum, Acetobacter เชื้อที่, Acetobacter pomorum, Komagataeibacter ยูโร, Komagataeibacter hansenii, Komagataeibacter intermedius, Komagataeibacter oboediens, Komagataeibacter xylinus, Komagataeibacter medellinensis และKomagataeibacter maltiaceti ตรวจพบก่อนหน้านี้ในน้ำส้มสายชูระบบนิเวศ(Sievers et al, 1992. Trcek et al, 1997;. Sokollek, et al. 1998; Boesch et al, 1998;. Trcek et al, 2000;. เดเวโร et al, 2006;. Gullo et al, 2006;. ยามาดะ et al, 2012. คาสโตร, et al, 2013;. Slapsak. etal 2013) อย่างไรก็ตาม, theprofilesofAABareunstableandshowpartic- หลากหลาย ular สอดคล้องกับลักษณะของวัตถุดิบและ.. คุณสมบัติขั้นตอนการผลิต (Gullo et al, 2009) บัตรประจำตัวของ AAB ขึ้นอยู่เฉพาะในลักษณะทางสัณฐานวิทยาชีวเคมี และลักษณะทางสรีรวิทยาไม่น่าเชื่อถือและมีไม่เพียงพอวารสารนานาชาติจุลชีววิทยาอาหาร204 (2015) 9-16 ⁎ผู้เขียนที่สอดคล้องกัน Tel .: [phone]/32729. ที่อยู่ E-mail:. [e-mail] (ซี Kesmen) http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.03.013 0168-1605 / © 2015 Elsevier BV สงวนลิขสิทธิ์. รายการเนื้อหาที่มีอยู่ใน ScienceDirect วารสารนานาชาติจุลชีววิทยาอาหารหน้าแรกของวารสาร: www.elsevier.com/locate/ijfoodmicro เพราะการทำสำเนาที่ไม่ดีและพลังของการเลือกปฏิบัติเหล่านี้ทดสอบฟีโนไทป์ (Cleenwerck และ De Vos 2008 ; Papalexandratou et al, 2009). ด้วยเหตุนี้กรดนิวคลีอิกที่ใช้วิธีการโมเลกุลที่ใช้ตอนนี้จะอธิบายลักษณะและระบุสายพันธุ์ของ AAB จากไวน์ andvinegarecosystems.ThesehaveincludedEnterobacterialRepetitive intergenic ฉันทามติ-PCR (ERIC-PCR) (กอนซาเล et al, 2004;. Gullo et al, 2009;. ดา et al., 2001) ซ้ำ Extragenic Palindromic- PCR (REP-PCR) (González et al., 2004), (GTG) 5 พิมพ์ลายนิ้วมือ -rep-PCR (De Vuyst et al., 2008) และ RAPD-PCR (Trcek et al, 1997. ของ 16S-23S ยีน rDNA (กอนซาเลและ Mas 2011). ข้อ จำกัดแตกต่างมีความยาวส่วน (RFLP) การวิเคราะห์ยีนโซมอลหรือภูมิภาคspacer ของพวกเขายังถูกนำมาใช้เพื่อระบุตัวตนของ AAB อยู่ในระบบนิเวศที่เกี่ยวกับอาหาร (Gullo et al, ., 2006; รุยซ์, et al. 2000; Trcek และ Teuber 2002; Trcek 2005.. สเวกัส, et al, 2010) การรวมกันของวิธีการวัฒนธรรมอิสระที่มีวัฒนธรรมวิธีการขึ้นอยู่ในระบบ polyphasic แนะนำเป็น EF - วิธีการ fective ที่จะเอาชนะความยากลำบากเกี่ยวกับการแยกและการเพาะปลูกสายพันธุ์AAB (Cleenwerck และ De Vos, 2008; Gullo et al, 2009; Sengun และ Karapinar 2011.) ในทศวรรษที่ผ่านมาหลาย. การศึกษาโดยใช้วัฒนธรรมเป็นอิสระ DGGE และชั่วขณะอุณหภูมิture ไล่โทนสีเจล Electrophoresis (TTGE) เทคนิคที่ได้รับรายงานสำหรับลักษณะของชุมชนจุลินทรีย์ในน้ำส้มสายชูและที่ความมุ่งมั่นของการเปลี่ยนแปลงประชากรAAB ระหว่างการหมัก(เดอเวโร et al, 2006;. เดเวโรและ Giudici 2008; Ilabaca .. et al, 2008) นอกจากนี้ในเวลาจริงวิธี PCR ยังได้รับการเสนอให้การตรวจสอบวัฒนธรรมอิสระจำพวกที่แตกต่างกันหรือชนิดของAAB (อันดอร์รา et al, 2008. Torija et al, 2010. วาเลร่า et al., 2013) เมื่อเร็ว ๆ นี้intercalating ย้อมตามแบบ real-time PCR ที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ในเฉพาะอุณหภูมิหลอมเหลว(TM) และความละเอียดสูงวิเคราะห์ละลายถูกนำไปใช้วิธีการที่เอเอสเอ promisingnew สูงสำหรับ confirmingtheidentifi- ไอออนบวกและ groupingof สายพันธุ์ culturable เป็นของที่แตกต่างกัน bac- terialspecies (Kaoetal 2007. Juvonenetal 2008; Kesmenetal 2014). แต่ยังไม่ถึง AAB เหล่านี้วิธีการใหม่ให้อย่างรวดเร็วและเชื่อถือได้เครื่องมือสำหรับการตรวจสอบความแตกต่างเล็ก ๆ ในลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายของสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด. บัตรประจำตัวของ AAB พื้นเมืองที่มีความสำคัญสำคัญที่จะอิ่มพิสูจน์การควบคุมกระบวนการหมักเอาชนะกำหนดปัญหาที่คาดเดาไม่ได้LEMS และเลือก สายพันธุ์ที่เหมาะสมที่สุดในขณะที่เริ่มต้นที่มีศักยภาพวัฒนธรรม ดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้เรามีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบและเปรียบเทียบ AAB ประชากรในน้ำส้มสายชูแอปเปิ้ลองุ่นและและแม่ของน้ำส้มสายชูตัวอย่างที่ได้รับจากภูมิภาคต่าง ๆ ของประเทศตุรกี ดังนั้นวัฒนธรรมเทคนิคอิสระ PCR-DGGE ได้ร่วมกับวัฒนธรรมเทคนิคโมเลกุลขึ้นรวมทั้ง(GTG) 5 -rep-PCR และการวิเคราะห์ลำดับของยีน16S rRNA, 16S-23S rRNA tran- ภายในscribed ลำดับ (ITS) และภูมิภาค ยีน TUF สำหรับการระบุและอักษรacterization ของ AAB ที่แยกได้จากตัวอย่างการวิเคราะห์ นอกจากนี้จริงเวลาวิเคราะห์ PCR intercalating สีย้อมที่ใช้ถูกนำไปใช้ AAB แยกที่จะได้รับการเลือกปฏิบัติสายพันธุ์ที่ระดับ. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 น้ำส้มสายชูและแม่ของกลุ่มตัวอย่างน้ำส้มสายชูน้ำส้มสายชูและแม่ของกลุ่มตัวอย่างน้ำส้มสายชูที่ผลิตโดย spontane- วิธีการหมักภายใต้กฎระเบียบที่ได้รับจากที่แตกต่างกันสามโปรท้องถิ่นducers ใน Kayseri และDüzceในตุรกี กลุ่มตัวอย่างประกอบด้วย 2 vinegars องุ่น (BG และเช่น) และแม่ของพวกเขา (BG และ EG), แอปเปิ้ล 2 vin- egars (ดาและฮ่า) และแม่ของพวกเขา (DA และ HA) ที่ถูกเก็บรวบรวมในตอนท้ายของการหมักอะซิติกจากถังไม้แบบดั้งเดิมที่หมักพื้นผิวจะดำเนินการ เนื้อหากรดอะซิติกของ vine- ตัวอย่างการ์ได้รับรายงานจากผู้ผลิตเป็น 3.96, 4.08, 4.28 และ 4.37% สำหรับตัวอย่างฮ่า, ดาที่ bg และเช่นตามลำดับ หลังจากการสุ่มตัวอย่างกระบวนการน้ำส้มสายชูและแม่ของกลุ่มตัวอย่างน้ำส้มสายชูวิเคราะห์สำหรับAAB โดยใช้วิธีการทางวัฒนธรรมและโมเลกุล. 2.2 การแยกเชื้อแบคทีเรียกรดอะซิติก (AAB) 10 มล. ของแต่ละ 5 ตัวอย่างถูกน้ำส้มสายชูเจือจางด้วย 90 มลสูงสุดกู้คืนเจือจาง(เมอร์ค GmbH, ดาร์มสตัด, เยอรมนี) และปั่นเป็นเวลา 2 นาทีด้วยเครื่องปั่น (IKA, เยอรมนี) อนุกรมได้ตัดสินใจที่เจือจาง mal ได้จัดทำกับเจือจางเดียวกันและภายใต้วิธีการที่แผ่นวุ้นในการแยกของAAB ใน GYC (5% D -glucose, เอทานอล 1% สารสกัดจากยีสต์ 1%, 1% CaCO 3, 0.05% bromocresol สีม่วง , 2% วุ้น) และ MYP (แมนนิทอล 1% สารสกัดจากยีสต์ 1% 0.3% เปปโตน, วุ้น% 2) วุ้นแผ่น เพื่อยับยั้งการเจริญเติบโตของยีสต์ 100 ppm cycloheximide (ซิกม่า) ถูกบันทึกอยู่ในสาหร่ายทั้ง แผ่นทั้งหมดถูกบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วัน. สำหรับแต่ละตัวอย่าง 10-15 catalase บวก oxidase ลบและ Gram- อาณานิคมลบแสดงลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่แตกต่างกันได้รับการทำให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิคแนวแผ่นและยัดเยียดให้อักษรต่อไปacterization ไอโซเลททั้งหมดเลือกจากตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส. 2.3 การสกัดดีเอ็นเอจากลูกบาศ์กบริสุทธิ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัฒนธรรม dependentandculture independentmethodswerecombinedfortheinvestigationofaceticacidbacteria
( AAB ) ประชากรในผ้าที่ผลิตน้ำส้มสายชูและแม่ของตัวอย่างที่ได้จากแอปเปิ้ลและส้ม
องุ่น วัฒนธรรมไที่ลาด gel electrophoresis ( การทดลอง ) วิเคราะห์ ซึ่งเป้าหมาย
v7 V8 และภูมิภาคของเบส 16S rRNA ยีนและพบว่า komagataeibacter hansenii komagataeibacter europaeus /
komagataeibacter xylinus เป็นชนิดเด่นที่สุดในเกือบทั้งหมดของตัวอย่างวิเคราะห์โดยตรง
วัฒนธรรมอิสระ GTG 5 - ตัวแทนตรวจลายนิ้วมือถูกใช้ในลักษณะเบื้องต้นของ AAB ไอโซ
และชนิดระบุระดับกระทำโดยการจัดลำดับของยีน 16S rRNA ,( - 23s rDNA ภายใน
transcribedto thespacer ( ของมัน ) ภูมิภาค และ tufgene . acetobacterokinawensiswasfrequentlyisolatedfromsamples
ที่ได้จากแอปเปิ้ลในขณะที่คุณ europaeus ถูกระบุเป็นชนิดเด่น รองลงมาคือ Acetobacter
indonesiensis ในกลุ่มตัวอย่างที่มาจากองุ่น นอกจากเทคนิคโมเลกุลทั่วไป เวลาจริง
intercalating ย้อมตรวจ PCR ,รวมถึงดีเอ็นเออุณหภูมิหลอมเหลว ( TM ) และความละเอียดสูงจุดหลอมเหลวการวิเคราะห์
( HRM ) wereappliedtoaceticacidbacterialisolatesforthefirsttime . thetargetsequenceofitsregiongenerated
เผ่าพันธุ์ - เฉพาะหรือโปรไฟล์และค่าจำแนกชนิดและได้รับอนุญาตในระดับ .
1 ส้มแนะนำ
เป็นผลิตภัณฑ์ของกระบวนการหมัก 2 ขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับ
การหมักแอลกอฮอล์จากน้ำตาลเป็นเอทานอลโดยยีสต์ และ subse -
quently , ออกซิเดชันของเอทานอลในกรดอะซิติกโดยแบคทีเรียกรดน้ำส้ม
( AAB ) ส้มได้รับชื่อเสียงเป็นอาหารบูดตั้งแต่โบราณ
ครั้ง andisstillusedtodayinthefood industryas ahighlysought หลัง
condimentand หลาย functionalproductutilized สำหรับดอง preserv -
ไอเอ็นจีและรสชาติที่สมดุล ( และมี sengun karapinar , 2004 ;
steinkraus , 2002 ) ทั้งหมดวัตถุดิบผลไม้ที่มีน้ำตาล หรือจะ severaldifferent

employedasstartingsubstancesforproducingvinegar ชนิดของน้ำส้มสายชูที่ผลิตทั่วโลก โดยการใช้เทคนิคการผลิตและวัตถุดิบพื้นเมืองหลากหลาย

พื้นที่เฉพาะ โดยทั่วไปกำหนด 2 วิธี คือช้า surfaceculture Fer -
mentation อย่างรวดเร็ว และน้ำหมักที่ใช้ในการผลิตน้ำส้มสายชู
( tesfayeetal . , 2002 ) theslow วิธีที่เรียกว่า tra -
ditional การผลิตน้ำส้มสายชูและแอ็ปเติบโตบนพื้นผิวของ liq -
อี๊ดในระหว่างกระบวนการหมัก ซึ่งอาจใช้เวลาหลายสัปดาห์ถึงหลายเดือน
( Nanda et al . , 2001 ) คอมพิวเตอร์ - ภาพยนตร์ปลอดสารพิษ
วางของ AAB และเซลลูโลสที่สะสมบนพื้นผิวของส้ม
ตลอดกระบวนการออกซิเดชัน ภาพยนตร์เรื่องนี้ เรียกว่า " แม่ของส้ม "
ใช้ในคืน slopping การปฏิบัติเป็นการเริ่มต้นวัฒนธรรมพื้นเมือง

เรียก acetification ในการผลิตน้ำส้มสายชูแบบดั้งเดิม ( holzapfel
, 2002 ; Hidalgo et al . , 2010 ) .
เป็นผลจากสองขั้นตอนการหมัก , จุลินทรีย์
หลายชนิดแสดงกิจกรรมแข่งขันในน้ำส้มสายชูตลอดกระบวนการผลิต
( holzapfel , 2002 ) การเปลี่ยนแปลงของจุลินทรีย์ให้รสชาติและกลิ่นส้ม
ลักษณะและแท่นวาง - จุลินทรีย์
ลิตรมีผลกระทบต่อสุขภาพที่เป็นประโยชน์ ( shimoji et al . , 2002 ; stasiak และ
บลาż ejak , 2009 ) แบคทีเรียกรดอะซิติก ซึ่งมี 2 รูปแบบคือปฏิกิริยาทรานส์ -
, หมักเป็น 1 ในหลัก microbi - ประชากร
ลในน้ำส้มสายชู .
3 สกุลของแบคทีเรีย กรดอะซีโตแบคเตอร์ ( A )
, gluconacetobacter ( Ga ) และ komagataeibacter ( HK ) ส่วนใหญ่จะถูก re -
sponsible สำหรับการหมักกรดในน้ำส้มสายชู ชนิดของ Acetobacter aceti Acetobacter malorum
, ,
pasteurianus Acetobacter , Acetobacter pomorum komagataeibacter europaeus hansenii komagataeibacter
, , ,