2.4. Multiplex RT-LAMP assayMultipl

2.4. Multiplex RT-LAMP assay
Multiplex RT-LAMP assays were performed in a PCR reaction tube (PCR Snapstrip 0.2 ml Natural, Anachem, Luton, UK) using a 25 l volume reaction mix that contained 2 l of template RNA, 0.15 units of AMV reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA), 8 units of Bst DNA polymerase (large fragment; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), 20 mM Tris–HCl (pH8.8, Cambridge bioscience, Cambridge, UK), 10 mM KCl (Sigma–Aldrich), 8 mM MgSO4 (New England Biolabs), 10 mM (NH4)2SO4 (Sigma–Aldrich), 0.1% Tween20 (Sigma–Aldrich), 0.8 M Betaine (Sigma–Aldrich), 1.4 mM each dNTPs (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), 1.6 M each of inner primers FIP-1, BIP-1, FIP-2 and BIP-2, 0.2 M each of outer primers F3-1, B3-1, F3-2 and B3-2; and 0.8 M each of loop primers LF-1, LB-1, LF-2 and LB-2. In circumstances where a primer contained mixed degenerate bases, the concentration of the primer was multiplied by two for each component oligonucleotide. Each RT-LAMP reaction was incubated at 63◦C for 60 min, followed by 80◦C for 5 min. Amplified products were detected at 650 nm using
a Loopamp EXIA turbidimeter (Teramecs, Kyoto, Japan). A reaction was considered positive when the differential value of the turbidity reached 0.1 within 60 min, and a Tp value was designated as the time at which this differential value reached this threshold. The evaluation of the multiplex RT-LAMP assays was performed using
coded samples in a blind manner

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 การ multiplex RT-หลอดทดสอบMultiplex RT-โคม assays ดำเนินใน PCR ปฏิกิริยาหลอด (PCR Snapstrip 0.2 ml ธรรมชาติ Anachem ลูตัน UK) ใช้ผสมปฏิกิริยาปริมาตร 25 l ที่อยู่ 2 ลิตรหน่วย transcriptase กลับ AMV (Invitrogen คาร์ลส CA, 0.15 อาร์เอ็นเอแม่แบบสหรัฐอเมริกา), หน่วย 8 ของ Bst ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (ส่วนใหญ่ Biolabs นิวอิงแลนด์ อิปสวิช MA, USA), 20 มม.ตรี – HCl (pH8.8 ซื้อเคมบริดจ์ เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร), 10 mM KCl (ซิก-Aldrich), 8 มม. MgSO4 (นิวอิงแลนด์ Biolabs), 10 มม. (NH4) 2SO4 (ซิก-Aldrich), 0.1% Tween20 (ซิก-Aldrich), Betaine 0.8 M (ซิก-Aldrich), 1.4 มม.แต่ละ dNTPs (GE สุขอนามัย ชาร์ฟอร์นเซนน้อย UK), 1.6 M แต่ละของไพรเมอร์ภายในเช่น FIP-1, BIP-1, 2 เช่น FIP และ BIP 2 , 0.2 M แต่ละของไพรเมอร์นอก F3-1, B3-1, F3-2 และ B3-2 และ 0.8 M แต่ละของไพรเมอร์วน LF-1 ป. 1, LF-2 และป. 2 ในสถานการณ์ที่เป็นรองพื้นอยู่ฐานผสม degenerate ความเข้มข้นของสีรองพื้นจะถูกคูณ ด้วยสองสำหรับแต่ละคอมโพเนนต์ oligonucleotide แต่ละปฏิกิริยา RT-โคมไฟถูก incubated ที่ 63◦C สำหรับ 60 นาที ตาม ด้วย 80◦C สำหรับผลิตภัณฑ์ Amplified 5 นาทีพบที่ 650 nm ใช้เป็น Loopamp EXIA turbidimeter (Teramecs เกียวโต ญี่ปุ่น) ปฏิกิริยาที่ถูกถือว่าบวกค่าความขุ่นของน้ำที่แตกต่างถึง 0.1 ภายใน 60 นาที และค่า Tp ถูกกำหนดเป็นเวลาที่ค่านี้แตกต่างถึงขีดจำกัดนี้ ดำเนินการประเมิน assays RT-โคมไฟต่าง ๆ ๅใช้ตัวอย่างรหัสอย่างตาบอด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . มัลติเพล็กซ์ (
rt-lamp multiplex rt-lamp หรือแสดงปฏิกิริยาในหลอด PCR PCR ( snapstrip 0.2 มิลลิลิตร ธรรมชาติ anachem ลุททัน , UK ) ใช้ 25  ลิตรปริมาตรปฏิกิริยาผสมที่มี 2  L ของ RNA แม่แบบ , 0.15 หน่วยและ reverse transcriptase ( Invitrogen Carlsbad , CA , USA ,
) , 8 หน่วย ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส BST ( ~ ; ขนาดใหญ่อังกฤษ biolabs อิปสวิช , MA , USA ) , 20 มิลลิเมตร ( ph8.8 ทริส– HCL ,เคมบริดจ์วิทยาศาสตร์ชีวภาพ เคมบริดจ์ , อังกฤษ ) , 10 mm . ( Sigma ) ดิช ) 8 มม. MgSO4 ใ ( อังกฤษ biolabs ) , 10 มม. ( NH4 ) 2so4 ( Sigma ) ดิช ) 0.1% tween20 ( Sigma ) ดิช ) 0.80 เมตร บี ( Sigma ) ดิช ) 1.4 มิลลิเมตร แต่ละ dntps ( GE ดูแลสุขภาพ น้อยริดสีดวงทวาร , อังกฤษ ) , 1.6  M แต่ละชั้นใน fip-1 bip-1 fip-2 , ไพรเมอร์ , และ  bip-2 0.2 M แต่ละชนิด f3-1 b3-1 f3-2 ภายนอก , และ , b3-2 ; และ 08  M แต่ละวง lf-1 lb-1 lf-2 , ไพรเมอร์ , และ lb-2 . ในสถานการณ์ที่มีการผสมรองพื้นเบสรองพื้น คือ ความเข้มข้นของคูณสองสำหรับแต่ละองค์ประกอบ ซึ่ง . แต่ละ rt-lamp ปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 63 ◦ C นาน 60 นาที ตามด้วย 80 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ◦ขยายผลิตภัณฑ์ที่ตรวจพบ 650 nm ใช้
เป็น loopamp exia turbidimeter ( teramecs , เกียวโต , ญี่ปุ่น )ปฏิกิริยาเป็นบวกเมื่อความแตกต่างของค่าความขุ่นถึง 0.1 ภายใน 60 นาที และ TP ค่าถูกกำหนดเวลาที่แตกต่างกันนี้มูลค่าถึงจุดนี้ การประเมินผลการใช้ระบบมัลติเพล็กซ์ หรือ rt-lamp
โค้ดตัวอย่างในลักษณะที่ตาบอด