Briefly, 560 μL lysis buffer was pi

Briefly, 560 μL lysis buffer was pipetted into the microcentrifuge tube, and added with 140 μL cell culture media, mixed by pulse vortexing, and incubated at room temperature for 10 min. Later, 560 µL ethanol (96-100%) was added and mixed by pulse vortexing for 15 sec. After that, 630 µL of above solution was applied to the QIAamp mini column, centrifuged at 1000 g for 1 min. QIAamp mini column was placed to another collection tube, and the tube containing the filtrate was discarded. Then, the column washed twice with washing buffer and the bound RNA in the column was eluted with 60 μL of elution buffer. The viral RNA was analyzed using RT PCR. Complementary DNA of the viral RNA was synthesized by cDNA synthesis Kit (Fermentas,Vilnius, Lithuania). Briefly, the 20 µL of mix reagent containing SRV primer set consisting of an upstream primer ‘5-CACCTCTYTRCTYAYAGAGCTGA-3’ and a downstream primer 5’-GAAACTGCGCCTGTCT-3’ and dNTPs was mixed with 5 μL of RNA sample. PCR amplification was performed by following protocol

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สั้น ๆ 560 μL lysis บัฟเฟอร์ pipetted ลงในหลอดไมโคร และเพิ่มสื่อวัฒนธรรมเซลล์ μL 140 ผสม โดยชีพจร vortexing และรับการกกที่อุณหภูมิห้อง 10 นาที ในภายหลัง 560 µL เอทานอล (96-100%) ถูกเพิ่ม และผสม โดย vortexing ชีพจรสำหรับ 15 วินาที หลังจากนั้น µL 630 ของเหนือโซลูชันใช้ QIAamp มินิคอลัมน์ ผลิตภัณฑ์ที่ 1000 กรัม 1 นาที QIAamp มินิคอลัมน์วางหลอดคอลเลกชัน และท่อที่ประกอบด้วยการกรองถูกละทิ้ง คอลัมน์ล้างสองครั้ง ด้วยล้างบัฟเฟอร์ แล้ว RNA ถูกผูกไว้ในคอลัมน์คือ eluted กับ μL 60 ของบัฟเฟอร์ชะ อาร์เอ็นเอไวรัสแก้ไขวิเคราะห์ใช้ RT PCR เสริมดีเอ็นเอของ RNA ไวรัสถูกสังเคราะห์ โดยการสังเคราะห์ cDNA Kit (Fermentas วิลนีอุส ลิธัวเนีย) สั้น ๆ 20 µL ผสมน้ำยาที่ประกอบด้วยรองพื้น SRV ที่ตั้งประกอบด้วยรองพื้นเป็นต้นน้ำของ ' 5-CACCTCTYTRCTYAYAGAGCTGA-3' และเป็นรองพื้นปลาย 5'-GAAACTGCGCCTGTCT-3' และ dNTPs ถูกผสมกับ μL 5 ของอาร์ กระบือทำ โดยโพรโทคอต่อไปนี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สั้น ๆ , 560 ไมโครลิตรบัฟเฟอร์สลายถูกปิเปตลงในหลอดไมโครและเพิ่มด้วย 140 ไมโครลิตรเซลล์เพาะเลี้ยงผสมโดยการเต้นของชีพจร vortexing และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที ต่อมา 560 ไมโครลิตรเอทานอล (96-100%) ถูกบันทึกและผสมชีพจร vortexing 15 วินาที หลังจากนั้น 630 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาข้างต้นถูกนำไปใช้กับมินิ QIAamp คอลัมน์หมุนเหวี่ยงที่ 1,000 กรัมเป็นเวลา 1 นาที QIAamp มินิคอลัมน์ถูกวางหลอดคอลเลกชันอื่นและหลอดที่มีการกรองที่ถูกทิ้ง จากนั้นล้างคอลัมน์สองครั้งกับบัฟเฟอร์ซักผ้าและอาร์เอ็นเอที่ถูกผูกไว้ในคอลัมน์ที่ถูกชะ 60 ไมโครลิตรของ buffer ชะ อาร์เอ็นเอของไวรัสได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ RT PCR ดีเอ็นเอที่สมบูรณ์ของอาร์เอ็นเอไวรัสถูกสังเคราะห์โดยชุดการสังเคราะห์ยีน (Fermentas วิลนีอุลิทัวเนีย) สั้น ๆ , 20 ไมโครลิตรของสารผสมที่มีชุด SRV ไพรเมอร์ประกอบด้วยไพรเมอร์ต้นน้ำ '5 CACCTCTYTRCTYAYAGAGCTGA-3' และไพรเมอร์ปลายน้ำ 5'-GAAACTGCGCCTGTCT-3 'และ dNTPs ผสมกับ 5 ไมโครลิตรของกลุ่มตัวอย่างอาร์เอ็นเอ ขยาย PCR ได้ดำเนินการโดยโปรโตคอลต่อไปนี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สั้น ๆ , 560 μ l การสลายบัฟเฟอร์ pipetted ในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ และเพิ่มกับ 140 μ L เซลล์วัฒนธรรมสื่อ ผสมด้วยชีพจร vortexing และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีต่อมา ก็µลิตรเอทานอล ( 96-100 % ) คือการเพิ่มและผสมโดยชีพจร vortexing เป็นเวลา 15 วินาที หลังจากนั้น ผมµล. แก้ปัญหาข้างต้นมาใช้ใน qiaamp มินิ คอลัมน์ ที่ระดับ 1000 กรัม ต่อ 1 นาที qiaamp มินิคอลัมน์ถูกวางไปอีกชุดหลอด และหลอดบรรจุสารถูกละทิ้ง แล้วคอลัมน์ล้างสองครั้งกับล้างบัฟเฟอร์และผูก RNA ในคอลัมน์ตัวอย่างμ 60 ลิตรใช้บัฟเฟอร์ ยีนของไวรัสถูกวิเคราะห์โดยใช้ RT PCR ดีเอ็นเอของยีนของไวรัสซึ่งถูกสังเคราะห์โดยชุดการสังเคราะห์ cDNA ( fermentas วิลนีอุส , ลิทัวเนีย , ) สั้น ๆ , 20 µลิตรผสมสารเคมีที่มีการบริการ primer ชุดประกอบด้วยต้นน้ำและปลายน้ำ " " 5-cacctctytrctyayagagctga-3 ไพรเมอร์รองพื้น 5 " - gaaactgcgcctgtct-3 " และ dntps ผสมกับ 5 μ L ของอาร์เอ็นเอตัวอย่าง เทคนิคการสื่อสารโดยใช้โปรโตคอลดังต่อไปนี้