ictaluri, and A. hydrophila in diff

ictaluri, and A. hydrophila in different combinations.
Sterile, disposable 1 μl plastic loops dipped in broth
cultures containing ~1 × 109 CFU ml–1 of bacteria were
mixed vigorously with ~30 to 50 mg of each tissue
sample in 1.5 ml microtubes and placed in an ice bath
until used for bacteriological culture or nucleic acid
extraction.
Nucleic acid extraction. Total nucleic acid was
extracted from 200 μl pure culture of each bacteria
listed in Table 1, from 30 to 50 mg tissue (blood, gills or
kidney) of experimentally infected fish, and from
spiked tissue samples (30 to 50 mg) using a High Pure
PCR template preparation kit (Roche Diagnostics)
according to the instructions provided. Tissues were
first macerated with sterilized Kontes disposable pellet
pestles (Fisher Scientific) in 10 μl of buffer containing
10 mM Tris HCl, 100 mM EDTA, pH 7.6. Nucleic acid
was quantified with a NanoDrop ND-1000 (NanoDrop
Technologies) spectrophotometer.
Target genes, primers and optimization of m-PCR
amplification parameters. Oligonuleotide primers for
genes of Flavobacterium columnare, Edwardsiella
ictaluri and Aeromonas hydrophila are listed and
described in Table 2. Primers targeting unique
sequences within the 16S rRNA gene of E. ictaluri
were designed for this study. All primers were synthesized
at the Iowa State University DNA Sequencing
and Synthesis Facility, Ames. Optimal conditions for
the m-PCR were empirically determined by varying
template nucleic acid concentrations (60, 30 and
20 ng), primer concentrations (0.2 to 0.8 μM), reaction
buffers, and annealing temperatures. Reaction buffers
tested included Master Mix (Promega) and FailSafe
PCR PreMixes A–L containing 50 mM KCl, 200 μM of

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ictaluri และ A. hydrophila ในรวมกันผ้าอ้อม ฆ่าเชื้อ 1 μl พลาสติกลูปจุ่มลงในซุปวัฒนธรรมประกอบด้วย ~ 1 × 109 CFU ml – 1 ของแบคทีเรียได้ผสมโยคะกับ ~ 30-50 มิลลิกรัมของเนื้อเยื่อแต่ละชิ้นงานตัวอย่างใน microtubes 1.5 ml และในอ่างอาบน้ำเป็นน้ำแข็งจนกระทั่งใช้วัฒนธรรม bacteriological หรือกรดนิวคลีอิกสกัดการสกัดกรดนิวคลีอิก กรดนิวคลีอิกรวมได้สกัดจาก 200 μl วัฒนธรรมบริสุทธิ์ของแบคทีเรียแต่ละแสดงในตารางที่ 1, 30 กับ 50 มิลลิกรัมต่อเนื้อเยื่อ (เลือด gills หรือไต) ของปลาที่ติดเชื้อ experimentally และจากตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ถูกแทง (30-50 มิลลิกรัม) โดยใช้ความสูงเพียวชุดเตรียมแม่แบบ PCR (Roche วินิจฉัย)ตามคำแนะนำ เนื้อเยื่อได้macerated ครั้งแรก กับ sterilized Kontes ทิ้งเม็ดpestles (Fisher วิทยาศาสตร์) ใน μl 10 ของบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยทริสเรทติ้ง HCl, 100 mM EDTA 10 มม. pH 7.6 กรดนิวคลีอิกมี quantified กับการ NanoDrop ND-1000 (NanoDropเครื่องทดสอบกรดด่างเทคโนโลยี)ยีนเป้าหมาย ไพรเมอร์ และเพิ่มประสิทธิภาพของ m-PCRพารามิเตอร์การขยาย ไพรเมอร์ Oligonuleotide สำหรับยีนของ Flavobacterium columnare, Edwardsiellaictaluri และ Aeromonas hydrophila อยู่ และอธิบายไว้ในตารางที่ 2 กำหนดเป้าหมายเฉพาะไพรเมอร์ลำดับภายในยีน rRNA 16S ของ E. ictaluriถูกออกแบบมาสำหรับการศึกษานี้ ไพรเมอร์ทั้งหมดถูกสังเคราะห์ในลำดับดีเอ็นเอมหาวิทยาลัยรัฐไอโอวาและสังเคราะห์สิ่งอำนวยความ สะดวก เอมส์ เงื่อนไขที่เหมาะสมสำหรับm-PCR ได้ empirically ตามแตกต่างกันความเข้มข้นของกรดนิวคลีอิกแม่ (60, 30 และ20 ng), ปฏิกิริยา ความเข้มข้นของสีรองพื้น (μM 0.2-0.8)บัฟเฟอร์ และอุณหภูมิหลอม บัฟเฟอร์ปฏิกิริยาทดสอบผสมหลัก (Promega) และ FailSafePCR PreMixes A – L ประกอบด้วย 50 mM KCl, μM 200 ของ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ictaluri และ A. hydrophila ในชุดที่แตกต่างกัน.
หมันทิ้ง 1
ไมโครลิตรห่วงพลาสติกจุ่มลงในน้ำซุปวัฒนธรรมที่มี~ 1 × 109 CFU ml-1
ของเชื้อแบคทีเรียที่ได้รับการผสมกับแรง~ 30 ถึง 50 มก.
ของแต่ละเนื้อเยื่อตัวอย่างใน1.5 มล. และ Microtubes วางอยู่ในห้องอาบน้ำน้ำแข็งจนใช้สำหรับการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียหรือกรดนิวคลีอิกสกัด. สกัดกรดนิวคลีอิก กรดนิวคลีอิกทั้งหมดถูกสกัดจากเชื้อบริสุทธิ์ 200 ไมโครลิตรของแต่ละแบคทีเรียที่ระบุไว้ในตารางที่1, 30-50 มิลลิกรัมเนื้อเยื่อ(เลือดเหงือกหรือไต) ของปลาที่ติดเชื้อทดลองและจากตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกแทง(30-50 มก.) โดยใช้สูง เพียวแม่แบบPCR เตรียมชุด (Roche Diagnostics) ตามคำแนะนำที่ให้ไว้ เนื้อเยื่อที่ถูกหมักครั้งแรกกับการฆ่าเชื้อเม็ดทิ้ง Kontes pestles (ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์) 10 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์ที่มี10 มิลลิ Tris HCl 100 มิลลิ EDTA, พีเอช 7.6 กรดนิวคลีถูกวัดด้วย NanoDrop ND-1000 (NanoDrop เทคโนโลยี) spectrophotometer. ยีนเป้าหมายไพรเมอร์และการเพิ่มประสิทธิภาพของม-PCR พารามิเตอร์ขยาย ไพรเมอร์ Oligonuleotide สำหรับยีนของFlavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri เชื้อ Aeromonas hydrophila และมีการระบุไว้และอธิบายไว้ในตารางที่2 ไพรเมอร์ที่ไม่ซ้ำกันกำหนดเป้าหมายลำดับภายในยีน16S rRNA ของอี ictaluri ได้รับการออกแบบสำหรับการศึกษานี้ ไพรเมอร์ทั้งหมดถูกสังเคราะห์ที่ดีเอ็นเอมหาวิทยาลัยแห่งรัฐไอโอวาลำดับและสิ่งอำนวยความสะดวกการสังเคราะห์สารอาเมส สภาวะที่เหมาะสมสำหรับM-PCR ได้รับการพิจารณาที่แตกต่างกันโดยสังเกตุแม่แบบของความเข้มข้นของกรดนิวคลีอิก(60, 30 และ20 นาโนกรัม) ความเข้มข้นของไพรเมอร์ (0.2-0.8 ไมครอน) ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์และอุณหภูมิการหลอม บัฟเฟอร์ปฏิกิริยาการทดสอบรวมผสมปริญญาโท (Promega) และ FailSafe PCR premixes A-L ที่มี 50 มิลลิ KCl 200 ไมครอนของ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ictaluri , และ A . hydrophila ในที่แตกต่างกัน
เป็นหมัน ผ้าอ้อม 1 ชั้นพลาสติกμลูปจุ่มลงในซุป
วัฒนธรรม× 109 CFU ml ประกอบด้วย ~ 1 – 1 ของแบคทีเรียถูก
ผสมชะมัด ~ 30 ถึง 50 มก. ของแต่ละตัวอย่างเนื้อเยื่อ
1.5 ml microtubes และวางไว้ในน้ำแข็งอาบน้ำ
จนใช้วัฒนธรรม แบคทีเรียหรือการสกัดกรดนิวคลีอิก
.
การสกัดกรดนิวคลีอิก . ทั้งหมดคือ
กรดนิวคลีอิกสกัดจาก 200 μผมบริสุทธิ์ วัฒนธรรมของแต่ละแบคทีเรีย
แสดงในตารางที่ 1 จาก 30 ถึง 50 มิลลิกรัม ( เลือด หรือเนื้อเยื่อเหงือกของปลาที่ติดเชื้อนี้
ไต ) และจาก
ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกแทง ( 30 ถึง 50 มก. ) โดยใช้เทคนิคแม่แบบสูงเพียว
เตรียมชุด ( โรชวินิจฉัย )
ตามไป คำแนะนำที่ให้ไว้ เนื้อเยื่อถูก
แรก macerated กับฆ่าเชื้อ kontes ทิ้งเม็ด
pestles ( ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ ) ใน 10 μ L ของบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย
HCl ซึ่ง 10 มม. 100 mM EDTA pH 7.6 . กรดนิวคลีอิก
เป็นวัดที่มี nanodrop nd-1000 ( nanodrop
เทคโนโลยี ) วัสดุ
ยีนเป้าหมาย , ไพรเมอร์และการเพิ่มประสิทธิภาพของพารามิเตอร์ ( m-pcr

oligonuleotide ดีเอ็นเอของยีนสำหรับ

และ edwardsiella columnare ฟลาโวแบคทีเรียม , ictaluri hydrophila อยู่และ
อธิบายไว้ในรางที่ 2 โดยเป้าหมายลำดับเบส 16S rRNA ยีนภายในกัน
.
ictaluri ถูกออกแบบมาสำหรับการศึกษานี้ ทุกชิ้นดีเอ็นเอสังเคราะห์
ที่มหาวิทยาลัยรัฐไอโอวาดีเอ็นเอ
และสิ่งอำนวยความสะดวก การสังเคราะห์ เอมส์ สภาวะที่เหมาะสมสำหรับ
m-pcr ถูกกำหนดโดยการใช้แม่แบบกรดนิวคลีอิก (

) 60 , 30 และ 20 ng ) primer ความเข้มข้น ( 0.2 - 0.8 μ M )บัฟเฟอร์ของปฏิกิริยา
และอุณหภูมิอบ . บัฟเฟอร์ของปฏิกิริยา
ทดสอบรวมอาจารย์ผสม ( promega ) และระบบป้องกัน
PCR premixes เป็น–ฉันประกอบด้วย KC1 50 mm , 200 μม.