n each of these tests, a slide was

n each of these tests, a slide was treated with a 0.3 M NaCl PBS buffer solution containing T1 and T2 in different ratios (total concentration = 1 nM) in a humidity chamber. After 2 hours, the chip was washed with a 0.3 M NaCl PBS buffer to remove nonspecifically bound target. Then, the chip was treated with nanoparticle probes (P1 and P2 at 1:1 ratio, 2 nM total concentration) for 1.5 hours to effect hybridization with the overhanging region of the target sequences (Scheme 2). The chip was washed with 0.3 M NaNO3 PBS buffer solution to remove chloride ions and nonspecifically bound nanoparticle probes. There are four possible hybridization modes, namely, T1:P1, T2:P2, T1:P2, and T2:P1(Scheme 2). When the chip was developed by Ag enhancing without a previous stringency wash, the Raman measurements on the gray spots, which correspond to different solution target ratios, yielded nearly identical spectra in all seven experiments; these spectra also are almost identical to those obtained for a sample containing a 1:1 ratio of probe 1 and probe 2 (11). These data show that probe 1 and probe 2 are bound to the spots on the chip in equal amounts, regardless of the target composition on the spot.

To identify the target composition on the spots, one must apply a salt- or temperature-based stringency wash (1, 19). Accordingly, we used a salt stringency wash (8 mM NaCl PBS buffer) to selectively denature the imperfect duplexes (T1:P2 and/or T2:P1) (Scheme 2, C and D) but not the duplexes formed from the perfectly complementary oligonucleotides (T1:P1 and/or T2:P2) (Scheme 2, A and B). After stringency wash and subsequent Ag staining, the Raman analysis of the gray spots can be used to readily identify the target composition on the spots by their spectral fingerprints. In tests where only pure RNA target 1 or 2 is present, only signals for probe 1 or 2, respectively, were observed (compare Fig. 4B, “a” and “g”) (11). In the case of mixtures, signals for both probes (I 1 at 1650 cm−1 from probe 1 and I 2 at 1588 cm−1 from probe 2) were detected, and the intensity ratios are proportional to the ratios of the two targets in each experiment (Fig. 4B, inset).

Compared with fluorescence-based chip detection, this nanoparticle-based methodology offers several advantages. The ratio of Raman intensities can be extracted from a single Raman spectrum with single-laser excitation. Second, the number of available Raman dyes is much greater than the number of available and discernable fluorescent dyes (7, 9). Indeed, a Raman dye can be either fluorescent or nonfluorescent, but a minor chemical modification of a dye molecule can lead to a new dye with a different Raman spectrum even though the two dyes exhibit virtually indistinguishable fluorescence spectra (7). Therefore, this fingerprinting method offers potentially greater flexibility, a larger pool of available and nonoverlapping probes, and higher multiplexing capabilities than conventional fluorescence-based detection approaches. Finally, the method incorporates all of the previous advantages of Au- nanoparticle based detection, including several orders of magnitude higher sensitivity and many orders of magnitude higher selectivity than the analogous molecular fluorescence-based approach (1,19). When considered with previous demonstrations of the unique properties of nanoparticle probes (1–4,19–27), a strong argument is being made for nanoparticles as the next-generation labeling technology for biodiagnostic research.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

n แต่ละเหล่านี้ทดสอบ ภาพนิ่งได้รับการรักษา ด้วยโซลูชันบัฟเฟอร์ NaCl PBS 0.3 M ที่ประกอบด้วย T1 และ T2 ในอัตราส่วนที่แตกต่างกัน (รวมความเข้มข้น = 1 นาโนเมตร) ในห้องความชื้น 2 ชั่วโมง ชิถูกล้าง ด้วย 0.3 M NaCl PBS บัฟเฟอร์เพื่อลบเป้าหมายผูก nonspecifically แล้ว ชิถูกรักษา ด้วยโพรบ nanoparticle สูง (P1 และ P2 ที่อัตรา 1:1, 2 nM ข้น) 1.5 ชั่วโมงการ hybridization ผลกับภูมิภาค overhanging ลำดับเป้าหมาย (แผน 2) ชิถูกล้าง ด้วยโซลูชันบัฟเฟอร์ NaNO3 PBS 0.3 M ลบคลอไรด์ไอออน และ probes nanoparticle สูงผูก nonspecifically มีสี่โหมด hybridization เป็นไปได้ คือ T1:P1, T2:P2, T1:P2 และ T2:P1(Scheme 2) เมื่อชิพัฒนา โดย Ag เพิ่มโดยไม่ต้องล้าง stringency ก่อนหน้านี้ ที่รามันสีเทาจุด ซึ่งสอดคล้องกับอัตราส่วนเป้าหมายของโซลูชันต่าง ๆ การวัดผลสเปกตรัมเกือบเหมือนในการทดลองทั้งหมดเจ็ด มุมนี้ยังเกือบจะเหมือนกันได้สำหรับตัวอย่างที่ประกอบด้วยอัตราส่วน 1:1 วัด 1 และโพรบ 2 (11) ข้อมูลเหล่านี้แสดงว่า โพรบ 1 และโพรบ 2 ถูกผูกไว้กับจุดบนชิในปริมาณที่เท่ากัน โดยไม่คำนึงถึงองค์ประกอบของเป้าหมายในจุดการระบุองค์ประกอบเป้าหมายบนจุด หนึ่งต้องใช้การใช้เกลือ หรืออุณหภูมิ stringency ล้าง (1, 19) ดังนั้น เราใช้ล้างเกลือ stringency (บัฟเฟอร์ 8 มม. NaCl PBS) เลือก denature ดูเพล็กซ์ไม่สมบูรณ์ (T1:P2 หรือ T2:P1) (โครงการ 2, C และ D) แต่ไม่ดูเพล็กซ์เกิดจาก oligonucleotides อย่างสมบูรณ์แบบเสริม (T1:P1 หรือ T2:P2) (แบบแผน 2, A และ B) หลังจากล้าง stringency และ Ag มาย้อมสี เทคนิคการวิเคราะห์จุดสีเทาสามารถใช้พร้อมระบุองค์ประกอบเป้าหมายบนจุด โดยลายนิ้วมือของสเปกตรัม ในการทดสอบที่บริสุทธิ์ RNA เป้าหมาย 1 หรือ 2 เป็นปัจจุบัน เฉพาะสัญญาณโพรบ 1 หรือ 2 ลำดับ ถูกตั้งข้อสังเกต (เปรียบเทียบรูป 4B, "a" และ "g") (11) ในกรณีผสม ตรวจพบสัญญาณทั้งสองวัด (I 1 ที่ 1650 cm−1 จากวัด 1) และ 2 ที่ 1588 cm−1 จากโพรบ 2 และอัตราส่วนความเข้มเป็นสัดส่วนกับอัตราส่วนของสองเป้าหมายในแต่ละการทดลอง (รูปที่ 4B แทรก)เมื่อเทียบกับการตรวจจับการเรืองแสงตามชิป nanoparticle สูงตามวิธีการนี้มีข้อดีหลายประการ อัตราส่วนของความเข้มรามันสามารถถูกแยกจากสเปกตรัมรามันเดียวกับเดี่ยวเลเซอร์กระตุ้น ที่สอง จำนวนสีรามันมีเป็นมากมากกว่าตัวเลขที่มีอยู่ และ discernable ฟลูออเรสเซนต์สีย้อม (7, 9) แน่นอน สีรามันสามารถเรืองแสง หรือ nonfluorescent แต่การเปลี่ยนแปลงทางเคมีน้อยของโมเลกุลสีย้อมสามารถนำไปสู่การย้อมใหม่กับสเปกตรัมรามันแตกต่างกันแม้ว่าสีสองแสดงสเปกตรัมแทบจำแนกไม่เรืองแสง (7) ดังนั้น วิธีนี้ fingerprinting มีความยืดหยุ่นมากขึ้นอาจ สระว่ายน้ำขนาดใหญ่พร้อม และขนานหัว และสามารถมัลติเพล็กซ์แบบสูงกว่าวิธีการตรวจจับการเรืองแสงธรรมดา ในที่สุด วิธีการรวมทั้งหมดของข้อก่อนหน้านี้การตรวจสอบคะแนน nanoparticle สูง Au รวมหลายอันดับของขนาดความไวแสงสูงและหลายใบสั่งของขนาดใวสูงกว่าคล้ายโมเลกุลเรืองแสงตามวิธี (1,19) เมื่อพิจารณาการสาธิตก่อนหน้าพัก nanoparticle สูงหัว (1 – 4,19 – 27), โต้เถียงคือการทำสำหรับเก็บกักเป็นเทคโนโลยีติดฉลากรุ่นใหม่ biodiagnostic วิจัย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

n แต่ละการทดสอบเหล่านี้ภาพนิ่งได้รับการรักษาด้วย 0.3 M NaCl พีบีเอสที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ T1 และ T2 ในอัตราส่วนที่แตกต่างกัน (ความเข้มข้นรวม = 1 NM) ในห้องที่มีความชื้น หลังจาก 2 ชั่วโมงชิปถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ 0.3 M NaCl พีบีเอสเพื่อเอาเป้าหมายผูกพัน nonspecifically จากนั้นชิปรับการรักษาด้วยอนุภาคนาโนโพรบ (P1 และ P2 ที่อัตราส่วน 1: 1, 2 นาโนเมตรความเข้มข้นรวม) 1.5 ชั่วโมงจะทำให้เกิดการผสมข้ามพันธุ์กับภูมิภาคที่ยื่นของลำดับเป้าหมาย (โครงการ 2) ชิปถูกล้างด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ 0.3 M NaNO3 พีบีเอสที่จะลบไอออนคลอไรด์และผูกพัน nonspecifically probes อนุภาคนาโน P1, T2: P2, T1: P2 และ T2: P1 (โครงการ 2) มีสี่โหมดที่เป็นไปได้ผสมพันธุ์คือ T1 เป็น เมื่อชิปได้รับการพัฒนาโดยเอจีเพิ่มโดยไม่ต้องล้างเข้มงวดก่อนหน้านี้วัดรามันบนจุดสีเทาซึ่งสอดคล้องกับเป้าหมายอัตราส่วนการแก้ปัญหาที่แตกต่างกันให้ผลสเปกตรัมเกือบเหมือนกันในทุกการทดลองเจ็ด; สเปกตรัมเหล่านี้ยังเกือบจะเหมือนกันกับผู้ที่ได้รับสำหรับตัวอย่างที่มีอัตราส่วน 1: 1 จากการสอบสวนที่ 1 และ 2 การสอบสวน (11) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการสอบสวนที่ 1 และ 2 การสอบสวนจะผูกพันกับจุดบนชิปในปริมาณที่เท่ากันโดยไม่คำนึงถึงองค์ประกอบเป้าหมายในจุด.

เพื่อระบุองค์ประกอบเป้าหมายในจุดหนึ่งต้องใช้ความเข้มงวดเกลือหรืออุณหภูมิตาม ล้าง (1, 19) ดังนั้นเราใช้ล้างเกลือเข้มงวด (8 มิลลิโซเดียมคลอไรด์พีบีเอสบัฟเฟอร์) เพื่อคัดเลือกลบล้างแฝดไม่สมบูรณ์ (T1: P2 และ / หรือ T2: P1) (โครงการ 2, C และ D) แต่ไม่แฝดที่เกิดขึ้นจาก oligonucleotides เสริมได้อย่างสมบูรณ์แบบ (T1: P1 และ / หรือ T2: P2) (โครงการ 2, A และ B) หลังจากล้างเข้มงวดและต่อมาย้อมสี Ag การวิเคราะห์รามันในจุดสีเทาสามารถใช้ในการพร้อมระบุองค์ประกอบเป้าหมายบนจุดลายนิ้วมือสเปกตรัมของพวกเขา ในการทดสอบที่มีเพียงเป้าหมาย RNA บริสุทธิ์ 1 หรือ 2 เป็นปัจจุบันสัญญาณเฉพาะสำหรับการสอบสวน 1 หรือ 2 ตามลำดับถูกตั้งข้อสังเกต (เปรียบเทียบรูป. 4B, "A" และ "G") (11) ในกรณีของการผสมสัญญาณสำหรับทั้งฟิวส์ (I 1 1650 CM-1 จากการสอบสวน 1 และฉัน 2 1588 CM-1 จากการสอบสวน 2) ได้รับการตรวจพบและอัตราส่วนความเข้มเป็นสัดส่วนอัตราส่วนของทั้งสองเป้าหมายใน การทดสอบแต่ละครั้ง (รูป. 4B สอด).

เมื่อเทียบกับการตรวจสอบชิปเรืองแสงตามวิธีอนุภาคนาโนที่ใช้นี้มีข้อดีหลายประการ อัตราส่วนของความเข้มรามันสามารถสกัดได้จากสเปกตรัมรามันเดียวที่มีการกระตุ้นเดียวเลเซอร์ ประการที่สองจำนวนของสีย้อมรามันที่มีอยู่มากขึ้นกว่าจำนวนของสีย้อมเรืองแสงที่มีอยู่และ discernable นี้ (7, 9) อันที่จริงสีย้อมรามันสามารถเป็นได้ทั้งเรืองแสงหรือ nonfluorescent แต่การเปลี่ยนแปลงทางเคมียังไม่บรรลุนิติภาวะของโมเลกุลสีย้อมสามารถนำไปสู่การย้อมสีใหม่ที่มีคลื่นความถี่ที่แตกต่างกันรามันถึงแม้ว่าทั้งสองสีย้อมแสดงสเปกตรัมการเรืองแสงแทบแยกไม่ออก (7) ดังนั้นวิธีการพิมพ์ลายนิ้วมือนี้อาจมีความยืดหยุ่นมากขึ้นสระว่ายน้ำขนาดใหญ่ของยานสำรวจที่มีอยู่และ nonoverlapping และความสามารถมัลติสูงกว่าการเรืองแสงที่ใช้วิธีการตรวจสอบการชุมนุม สุดท้ายวิธีการรวมเอาข้อดีของก่อนหน้าของการตรวจสอบตามแบบอัตโนมัติอนุภาคนาโนรวมทั้งคำสั่งหลายขนาดความไวสูงและหลายคำสั่งของขนาดหัวกะทิสูงกว่าวิธีการเรืองแสงตามโมเลกุลคล้าย (1.19) เมื่อพิจารณาด้วยการสาธิตก่อนหน้าของคุณสมบัติที่ไม่ซ้ำกันของอนุภาคนาโนโพรบ (1-4,19-27) อาร์กิวเมนต์ที่แข็งแกร่งจะถูกสร้างขึ้นมาสำหรับอนุภาคนาโนเป็นเทคโนโลยีการติดฉลากรุ่นต่อไปสำหรับการวิจัย biodiagnostic

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

N แต่ละการทดสอบเหล่านี้ภาพนิ่งเปรียบเทียบกับ 0.3 M NaCl พีบีเอสในสารละลายบัฟเฟอร์ที่มี T1 และ T2 ในอัตราส่วนต่าง ๆ ( รวมสมาธิ = 1 nm ) ในความชื้นในห้อง หลังจาก 2 ชั่วโมง ชิป ได้ซัดกับ 0.3 M NaCl PBS buffer เพื่อลบ nonspecifically พันธนาการเป้าหมาย แล้วชิปที่ได้รับการรักษาด้วยอนุภาคนาโนโพรบ ( P1 P2 ในอัตราส่วน 1 : 1 และ 2 nm รวมสมาธิ ) 1.5 ชั่วโมง ( พร้อมยื่นผลเขตของเป้าหมาย ลำดับ ( โครงการ 2 ) ชิปล้างด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ 0.3 M NaNO3 PBS เพื่อลบไอออนคลอไรด์และ nonspecifically ผูกพันสำหรับเครื่องมือตรวจสอบ มี 4 โหมด ( เป็นไปได้คือ T1 : P1 , P2 T2 : T1 และ T2 : P2 : P1 ( โครงการ 2 ) เมื่อชิปถูกพัฒนาโดยเอจีเพิ่มโดยไม่ต้องล้าง stringency ก่อนหน้า รามัน การวัดในจุดสีเทา ซึ่งสอดคล้องกับเป้าหมายอัตราส่วนแตกต่างกัน โซลูชั่น พบว่าเกือบเหมือนแสงทั้งเจ็ดทดลอง แสงเหล่านี้ เหมือนกับที่ได้ตัวอย่างที่มีอัตราส่วนของโพรบ 1 2 ( 11 ) และการสอบสวน . ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าหัว 1 และโพรบ 2 ถูกผูกไว้กับจุดบนชิปในปริมาณที่เท่ากัน โดยไม่คำนึงถึงเป้าหมายองค์ประกอบในจุดที่การระบุเป้าหมาย ประกอบกับจุดที่ ต้องใช้เกลือหรืออุณหภูมิ stringency ล้างตาม ( 1 , 19 ) ดังนั้นเราใช้ stringency เกลือล้าง ( 8 mM NaCl PBS buffer ) จะเลือกนมที่แฝดที่ไม่สมบูรณ์ ( T1 : P2 และ / หรือ T2 : P1 ) ( โครงการ 2 , C และ D ) แต่ไม่ใช่แฝดที่เกิดจากโอลิโกนิวคลีโอไทด์อย่างสมบูรณ์แบบ ( T1 : P1 และ / หรือ T2 : P2 ) ( โครงการ 2 , A และ B ) หลังจากล้าง stringency และต่อมาโดยการย้อมสีรามันการวิเคราะห์จุดสีเทาสามารถใช้พร้อมระบุเป้าหมายองค์ประกอบบนจุด โดยตนตรวจลายนิ้วมือ ในการทดสอบที่บริสุทธิ์ ซึ่งเป้าหมายที่ 1 หรือ 2 คือปัจจุบันเท่านั้นสัญญาณโพรบ 1 หรือ 2 ตามลำดับ พบว่า ( เปรียบเทียบภาพ 4B , " A " และ " G " ) ( 11 ) ในกรณีของการผสมสัญญาณ ทั้งฟิวส์ ( ผม 1 cm − 1 จาก 1650 หัว 1 และ 2 cm − 1 1287 จากโพรบ 2 ) ถูกตรวจพบและความรุนแรงเป็นสัดส่วนกับอัตราส่วนของอัตราส่วนสองเป้าหมายในแต่ละการทดลอง ( ภาพ 4B inset , )เมื่อเทียบกับการตรวจสอบชิปสำหรับใช้วิธีการตามนี้มีข้อดีหลายประการ อัตราส่วนของรามันเข้มสามารถสกัดได้จากสเปกตรัมรามันเลเซอร์เดียวแบบเดียว ที่สอง , จํานวนของรามันสีย้อมมากมากกว่าจำนวนที่มีอยู่และการรับรู้สีเรืองแสง ( 7 , 9 ) แน่นอน รามันสีย้อมสามารถเรืองแสงหรือ nonfluorescent แต่การเปลี่ยนแปลงทางเคมีย่อยของโมเลกุลสีย้อมสามารถนำสีใหม่กับสเปกตรัมรามันที่แตกต่างกันแม้ว่าสองสีมีจวนแยกสเปกตรัมฟลูออเรสเซนซ์ ( 7 ) ดังนั้น วิธีนี้มีความยืดหยุ่นมากขึ้นรูปแบบอาจสระว่ายน้ำขนาดใหญ่ของที่มีอยู่ และ nonoverlapping probes และความสามารถที่สูงกว่าปกติตามแนวทางการมัลติเพล็กซ์โดยการตรวจสอบ ในที่สุดวิธีที่ประกอบด้วยทั้งหมดของข้อดีของ AU - สำหรับการตรวจสอบตามเดิม รวมทั้งคำสั่งหลายขนาดและความไวสูงหลายคำสั่งของขนาดเลือกได้สูงกว่าแบบโมเลกุลเรืองแสงตามแนวทาง 1,19 ) เมื่อพิจารณาก่อนหน้านี้การสาธิตคุณสมบัติเฉพาะของอนุภาคนาโนโพรบ ( 1 ) 4,19 – 27 ) อาร์กิวเมนต์ที่แข็งแกร่งคือการทำฉลากนาโนเป็นเทคโนโลยีรุ่นต่อไปเพื่อ biodiagnostic .