For 2D-SDS-PAGE, after protein prec

For 2D-SDS-PAGE, after protein precipitation with TCA/acetone, pallet protein were mixed with rehydration solution (8 M urea, 3% CHAPS, 2% IPG buffer (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden), 50mM DTT, 0.01% Triton-X100). For isoelectric
focusing (IEF), immobilized strip gels (pH 3–10NL , 11 cm; Bio-rad) were used to separate 400 mg of protein lysate and was carried out at 207C with Ettan (Amersham Biosciences). The procedure was modified for full and steady-state focusing. Briefly, the strip gel was rehydrated for 14-16 at room temperature and the proteins were separated using the following stepwise increases in voltage and running times: 500 V for 1 h, 1000 V for 1 h, 6000 V for 9 50 mins. Focused strip gels were incubated for 15 min at room temperature with equilibration buffer I (50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT) and then
transferred to equilibration buffer II (50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS, 2.5% iodoacetamide). After this equilibration step, the strip gels were placed on 12.5% denaturing acrylamide gels and sealed with a 0.5% agarose solution. SDS-PAGE was performed at 20 mA for 30 min and 50 mA for 5 hours. Gels were subsequently staining.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สำหรับ 2D SDS-หน้า หลังฝนโปรตีนกับ TCA/อะ ซิโตน แท่นวางสินค้าโปรตีนถูกผสมกับโซลูชัน rehydration (8 เมตร urea, CHAPS 3%, 2% IPG บัฟเฟอร์ (Amersham เวลาออก Uppsala สวีเดน), 50 มม. DTT, 0.01% ไตรตั้น - X 100) สำหรับ isoelectricเน้น (IEF), ตรึงแถบเจ (pH 3-10NL, 11 ซม. Bio-rad) ถูกใช้เพื่อแยกโปรตีน lysate 400 มก. และถูกดำเนินการที่ C 207 ด้วย Ettan (เวลาออก Amersham) ขั้นตอนถูกปรับเปลี่ยนสำหรับขาสามท่อน และเต็มกำลัง สั้น ๆ เจลสตริปเป็น rehydrated สำหรับ 14-16 ที่อุณหภูมิห้อง และโปรตีนที่ถูกแบ่งใช้เพิ่ม stepwise ต่อในแรงดันและการทำงาน: 500 V สำหรับ h 1, 1000 V สำหรับ h 1, 6000 V สำหรับ 9 50 นาที เจแถบเน้นถูก incubated สำหรับ 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องกับบัฟเฟอร์ equilibration ฉัน (50 มม.ตรี-HCl, pH 8.8 ม. 6 ยูเรีย 30% กลีเซอร SDS 2%, 1% DTT) แล้วโอนย้ายไปยังบัฟเฟอร์ equilibration II (50 มม.ตรี-HCl, pH 8.8 ยูเรีย 6 M, iodoacetamide 30% กลีเซอร SDS 2%, 2.5%) หลังจากขั้นตอนนี้ equilibration เจแถบถูกวางบน 12.5% denaturing เจอะคริลาไมด์ และปิดผนึก ด้วย 0.5% agarose โซลูชัน ทำหน้า SDS ที่ 20 ม้า 30 นาทีและ 50 mA 5 ชั่วโมง เจมีต่อมามีการย้อมสี

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับ 2D-SDS-PAGE หลังจากตกตะกอนโปรตีน TCA / อะซิโตนโปรตีนพาเลทถูกผสมกับการแก้ปัญหาคืน (8 M ยูเรีย CHAPS 3%, 2% บัฟเฟอร์ IPG (Amersham ชีววิทยาศาสตร์อัปซาลา, สวีเดน), 50mm DTT 0.01% ไทรทัน -X100) สำหรับ Isoelectric
มุ่งเน้น (IEF) เจลแถบตรึง (pH 3-10NL 11 ซม Bio-RAD) ถูกนำมาใช้ในการแยก 400 มิลลิกรัม lysate โปรตีนและได้ดำเนินการที่ 207C กับ Ettan (Amersham ชีววิทยาศาสตร์) ขั้นตอนการปรับเปลี่ยนสำหรับเต็มรูปแบบและความมั่นคงของรัฐที่มุ่งเน้น สั้น ๆ , เจลแถบถูก rehydrated สำหรับวันที่ 14-16 ที่อุณหภูมิห้องและโปรตีนที่ถูกแยกออกโดยใช้ขั้นตอนต่อไปนี้การเพิ่มขึ้นของแรงดันไฟฟ้าและทำงานครั้ง: 500 V เป็นเวลา 1 ชั่วโมง, 1000 V เป็นเวลา 1 ชั่วโมง, 6000 V 9 50 นาที เจลที่มุ่งเน้นแถบถูกบ่มเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องที่มีบัฟเฟอร์สมดุลฉัน (50 มิลลิ Tris-HCl, พีเอช 8.8, 6 M ยูเรีย, กลีเซอรีน 30%, 2% SDS, 1% DTT) และจากนั้น
โอนไปยังบัฟเฟอร์สมดุล II (50 มิลลิ Tris-HCl, พีเอช 8.8, 6 M ยูเรีย, กลีเซอรีน 30%, 2% SDS 2.5% iodoacetamide) หลังจากขั้นตอนสมดุลนี้เจลแถบถูกวางไว้บน 12.5% ​​เจลริลาไมด์ denaturing และปิดผนึกด้วย 0.5% agarose การแก้ปัญหา SDS-PAGE ได้ดำเนินการที่ 20 มิลลิแอมป์เป็นเวลา 30 นาทีและ 50 มิลลิแอมป์ 5 ชั่วโมง เจลที่ได้รับภายหลังการย้อมสี

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับ 2d-sds-page หลังจากการตกตะกอนโปรตีนด้วย TCA / อะซิโตน โปรตีนเม็ดผสมศึกษาวิธีแก้ปัญหา ( 8 M ยูเรียร้อยละ 3 แชป 2 % IPG บัฟเฟอร์ ( ชาม ชีววิทยาศาสตร์ อุปซอลา , สวีเดน ) , 50mm DTT , 0.01 % triton-x100 ) สำหรับไอโซอิเล็กทริก
เน้น ( IEF ) ตรึงแถบเจล ( pH 3 – 10nl 11 ซม.ไบโอ ราด ) ถูกใช้เพื่อแยก lysate 400 มิลลิกรัมของโปรตีนและถูกนำออกที่ 207c กับ ettan ( ชาม Biosciences ) ขั้นตอนการแก้ไขเต็มรูปแบบคงที่และเน้น สั้น ๆ , แผ่นเจลคือได้ทำการ รีไฮเดรทมสำหรับ 14-16 ที่อุณหภูมิห้องและโปรตีนที่แยกใช้ตามแบบเพิ่มแรงดัน และวิ่งครั้ง : 500 V 1 H , 1000 ใน 1 ชั่วโมง6000 V 9 50 นาที เน้นแถบเจลถูกบ่มเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องกับ equilibration บัฟเฟอร์ ( 50 มม. โดย HCl , พีเอช 8.8 , 6 M ยูเรีย กลีเซอรอล 30 % 2 % SDS , 1% ส่วน ) และจากนั้นโอนไปยังบัฟเฟอร์ equilibration
2 ( 50 มม. โดย HCl , พีเอช 8.8 , 6 M ยูเรีย 30% รอล 2 % SDS , 2.5% iodoacetamide ) หลังจากขั้นตอนนี้ equilibration , แถบเจลถูกวางไว้บน 125% อะคริลาไมด์เจลี่ และปิดผนึกด้วยโซลูชั่น ( 0.5 % การศึกษาดำเนินการโดย MA 20 30 นาทีและ 50 มา 5 ชั่วโมง เจลได้ในภายหลัง
staining