Transfer 1 mL of lysate to a 15 mL

Transfer 1 mL of lysate to a 15 mL conical tube.
2. Add 12.5 μL 1 M MgCl2. Mix gently.
3. Carefully add 0.4 μL DNAse I (2000 U/mL) and 1 μL RNAse A (100 mg/mL) to the lysate-MgCl2
mixture. Be careful not to contaminate the micropipettor.
4. Vortex briefly to mix, incubate at room temperature for ~30 minutes.
5. Add the following reagents/enzymes to the tube, in the order listed below.
a. 40 μL of 0.5 M EDTA.
b. 5 μL of Proteinase K (10 mg/mL).
c. 50 μL of 10% SDS.
6. Vortex the mixture vigorously.
7. Incubate at 55°C for 60 minutes. Vortex the mixture vigorously twice during incubation, at 20-
minute intervals.
8. Obtain two 1.5 mL microcentrifuge tubes. Transfer 500 μL of the mixture to each tube.
9. Put on gloves and transfer all materials to a chemical fume hood. Carefully transfer enough PCI
to a 15 mL conical tube or a microcentrifuge tube. Return the bottle of PCI to the appropriate
place.
10. Transfer equal amount of PCI (500 μL for the first time) to each tube with 500 μL of lysate. Invert
tubes several times to mix well.
11. Centrifuge for 5 minutes at room temperature at 13K rpm.
12. Remove the top aqueous layer above the white interphase.
a. If a low titer lysate is used, leave a buffer region between the aqueous layer and the white
interphase. In other words, avoid any protein or phenol contamination from the white
interphase and the bottom organic layer.
b. If a high titer lysate is used (titer greater than 109
pfu/mL), repeat steps #10 and #11 until the
white interphase is gone, each time removing as much of the top aqueous layer as possible.
Perform #12a (leave a buffer region) during the last round when the no interphase can be
seen anymore.
13. Precipitate the DNA.
a. Add 1 mL of 95% ethanol and 50 μL of 3M sodium acetate solution to the aqueous layer
obtained at the end of step #12.
b. Place the sample on ice for ~5 minutes. This aids with precipitation. Mix gently, and the DNA
will form a “cotton ball” like precipitate.
14. Centrifuge at room temperature for 10 minutes at 13K rpm. Place the cap fold to the outside as
an indicator to where the pellet would be.
15. Decant the tubes carefully, paying attention not to lose the pellet. Then add 500 μL of 70%
ethanol to wash the pellet. Do not dissolve the pellet, since it is nearly impossible to recover
dissolved pellets. Simply let ethanol run through the pellet.
16. Centrifuge for 10 minutes at 13K rpm at room temperature.
17. Decant the tubes, and carefully pipet out any remaining droplets. Once again, pay attention not
to lose the pellet (by pipetting or decanting).
18. Air dry the pellet (~10 – 20 minutes), but make sure the DNA is not over dried since it would
become hard to dissolve.
19. Dissolve DNA in ~50 μL dH2O. To ensure complete solvation, set the tubes in 37°C for 10
minutes.
20. DNA can be stored at 4°C for the short term. For long-term storage, store at –20°C.
21. Measure the concentration of DNA on the NanoDrop. (See TOOLBOX: Measuring DNA
Concentration).
22. In the event of phenol contamination, repeat the procedure once (only perform #10 – 12 once)
with just chloroform (i.e. no phenol and isoamyl).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การถ่ายโอน 1 มิลลิลิตรของ lysate ไปยังหลอดรูปกรวย 15 มล.
2 เพิ่ม 12.5 ไมโครลิตร M 1 MgCl2 ผสมเบา ๆ .
3 ระมัดระวังเพิ่ม 0.4 ไมโครลิตร DNase ฉัน (2000 U / มิลลิลิตร) และ 1 ไมโครลิตร RNase A (100 mg / ml) เพื่อ lysate-MgCl2
ส่วนผสม ระมัดระวังไม่ให้ปนเปื้อน micropipettor ได้.
4 Vortex เวลาสั้น ๆ ในการผสม, ฟักไข่ที่อุณหภูมิห้อง ~ 30 นาที.
5 เพิ่มต่อไปนี้น้ำยา / เอนไซม์หลอดในการสั่งซื้อที่ระบุไว้ด้านล่าง.
40 ไมโครลิตร 0.5 M EDTA.
B 5 ไมโครลิตรของ Proteinase K (10 mg / ml).
C 50 ไมโครลิตร 10% SDS.
6 Vortex ส่วนผสมอย่างจริงจังได้.
7 ฟักที่ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 60 นาที Vortex ผสมแรงสองครั้งในช่วงการบ่มที่ 20
นาที.
8 ได้รับสอง 1.5 มิลลิลิตรหลอดไมโคร โอน 500 ไมโครลิตรผสมกับแต่ละหลอด.
9 ใส่ถุงมือและโอนวัสดุทั้งหมดที่จะดูดควันสารเคมี อย่างรอบคอบโอน PCI เพียงพอ
กับมลหลอด 15 หลอดรูปกรวยหรือไมโคร กลับขวด PCI ที่จะเหมาะสม
สถานที่.
10 โอนเงินที่เท่ากันของ PCI (500 ไมโครลิตรเป็นครั้งแรก) ให้กับแต่ละหลอด 500 ไมโครลิตรของ lysate กลับ
หลอดหลาย ๆ ครั้งเพื่อผสมให้เข้ากัน.
11 เครื่องปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องที่ 13K RPM.
12 ถอดชั้นน้ำด้านบนข้างต้นอินเตอร์สีขาว.
ถ้า lysate titer ต่ำจะใช้ออกจากเขตกันชนระหว่างชั้นน้ำและสีขาว
อินเตอร์ ในคำอื่น ๆ หลีกเลี่ยงโปรตีนหรือฟีนอลปนเปื้อนใด ๆ จากสีขาว
ระหว่างเฟสและชั้นล่างอินทรีย์.
b ถ้า lysate titer สูงถูกนำมาใช้ (titer มากกว่า 109
PFU / มิลลิลิตร) ทำซ้ำขั้นตอน # 10 และ # 11 จนกระทั่ง
อินเตอร์สีขาวจะหายไปทุกครั้งที่เอาเท่าของชั้นน้ำด้านบนที่เป็นไปได้.
ดำเนิน # 12A (ออกจาก ภูมิภาคบัฟเฟอร์) ในรอบสุดท้ายเมื่อไม่มีอินเตอร์สามารถ
มองเห็นได้อีกต่อไป.
13 ตกตะกอนดีเอ็นเอ.
เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของเอทานอล 95% และ 50 ไมโครลิตรของ 3M สารละลายโซเดียมอะซิเตทชั้นในน้ำ
ที่ได้รับในตอนท้ายของขั้นตอนที่ 12.
ข วางตัวอย่างบนน้ำแข็งสำหรับ ~ 5 นาที นี้ช่วยให้มีการเร่งรัด ผสมเบา ๆ และดีเอ็นเอ
จะในรูปแบบ "สำลี" เช่นตะกอน.
14 centrifuge ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีที่ 13K RPM วางพับฝาครอบด้านนอกเป็น
ตัวบ่งชี้ไปยังที่ที่เม็ดจะเป็น.
15 ค่อยๆรินหลอดอย่างรอบคอบให้ความสนใจไม่ให้สูญเสียเม็ด แล้วเพิ่ม 500 ไมโครลิตร 70%
เอทานอลเพื่อล้างเม็ด ไม่ละลายเม็ดเพราะมันเป็นไปไม่ได้เกือบที่จะกู้คืน
เม็ดละลาย เพียงแค่ให้เรียกใช้เอทานอลผ่านเม็ด.
16 เครื่องปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 13K RPM ที่อุณหภูมิห้อง.
17 ค่อยๆรินหลอดและระมัดระวังการปิเปตจากหยดน้ำที่เหลืออยู่ อีกครั้งหนึ่งที่ให้ความสนใจไม่
ให้สูญเสียเม็ด (โดยปิเปตหรือ decanting).
18 อากาศแห้งเม็ด (~ 10-20 นาที) แต่ให้แน่ใจว่าดีเอ็นเอไม่เกินแห้งเพราะมันจะ
กลายเป็นเรื่องยากที่จะละลาย.
19 ละลายในดีเอ็นเอ ~ 50 ไมโครลิตร dH2O เพื่อให้แน่ใจว่า solvation สมบูรณ์ตั้งหลอดในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10
นาที.
20 ดีเอ็นเอสามารถเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสในระยะสั้น สำหรับการจัดเก็บระยะยาวเก็บที่อุณหภูมิ -20 ° C.
21 วัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอใน NanoDrop (ดูที่กล่องเครื่องมือ: การวัดดีเอ็นเอ
เข้มข้น).
22 ในกรณีที่มีการปนเปื้อนของฟีนอลที่ทำซ้ำขั้นตอนหนึ่งครั้ง (เฉพาะดำเนิน # 10-12 ครั้งเดียว)
มีเพียงคลอโรฟอร์ม (เช่นไม่มีฟีนอลและ isoamyl)