2.4. Genomic DNA extraction and PCR

2.4. Genomic DNA extraction and PCR amplification
Fifteen regenerates (1–15) were selected randomly for genetic stability
assessment. Genomic DNA from leaves of regenerates and mother
plant (P) was extracted using CTAB protocol (Doyle and Doyle, 1990)
with slight modifications (Rathore et al., 2014). The total genomic DNA
was quantified spectrophotometrically (BioTek Instruments Inc. USA)
and aliquots were diluted to the final concentration of 10–15 ng μl
−1
.
PCR reactions for RAPD and ISSR were performed in a programmable
thermal cycler (Master cycle epgradient S, Eppendroff, Germany). PCRRAPD
amplifications were performed (Williams et al., 1990) using
decamer arbitrary primers (Operon Technologies Inc, and IDT, USA). Initially
for each RAPD and ISSR fingerprinting, 25 primers were screened.
The PCR reactions were carried out in a volume of 15 μl of reaction mixture
containing 25 ng template DNA, 1X PCR buffer (Fermentas, USA),
0.2 mM each dNTP's, 3.0 mM MgCl2, 0.4 μM primer, and 1 U Taq DNA polymerase
(Fermentas, USA). The PCR-RAPD amplification reactions were
carried out using the program of initial denaturation at 94 °C for 3 min
followed by 42 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, primer annealing
at 32 °C for 1 min, extension at 72 °C for 2.5 min and final extension at
72 °C for 4 min. The conditions for PCR-ISSR cycles consisted of an initial
denaturation at 94 °C for 5 min followed by 35 cycles of denaturation at
94 °C for 30 sec, annealing at optimum annealing temperature for particular
ISSR primer for 30 sec, extension at 72 °C for 1 min; and a final extension
at 72 °C for 7 min. The amplified PCR-RAPD and ISSR products were
electrophoresed in 1.5% agarose in 1X TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM
EDTA, pH 8.0) buffer. The gels were stained with ethidium bromide and
documented using gel documentation system (Syngene, UK).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. ออกสกัดดีเอ็นเอและกระบือสิบห้าเร่ง (1 – 15) ถูกเลือกแบบสุ่มสำหรับเสถียรภาพทางพันธุกรรมการตรวจประเมิน ดีเอ็นเอออกจากใบของเร่งและแม่โรงงาน (P) ถูกสกัดโดยใช้โพรโทคอล CTAB (ดอยล์และดอยล์ 1990)การแก้ไขเล็กน้อย (ห้องพักทุก et al. 2014) ดีเอ็นเอที่ออกทั้งหมดคือวัด spectrophotometrically (เครื่องมือ BioTek Inc. สหรัฐอเมริกา)และ aliquots ถูกเจือจางให้ความเข้มข้นสุดท้ายของ μl ฉบับ 10 – 15− 1.ปฏิกิริยา PCR สำหรับ RAPD และ ISSR ถูกดำเนินการในการตั้งค่าได้ความร้อน cycler (หลักวงจร epgradient S, Eppendroff เยอรมนี) PCRRAPDamplifications ใช้ดำเนินการ (Williams et al. 1990)decamer ตามอำเภอใจไพรเมอร์ (Operon เทคโนโลยี Inc และ IDT สหรัฐอเมริกา) ในตอนแรกสำหรับแต่ละ RAPD และ ISSR ลายพิมพ์ ไพรเมอร์ 25 คัดปฏิกิริยา PCR ดำเนินการปริมาณของ μl 15 ของส่วนผสมของปฏิกิริยาประกอบด้วย 25 ฉบับแม่แบบดีเอ็นเอ 1 X PCR บัฟเฟอร์ (Fermentas สหรัฐอเมริกา),0.2 mM แต่ละ dNTP ของ 3.0 มิลลิเมตร MgCl2, 0.4 ไมครอนรองพื้น และ 1 U Taq DNA พอลิเมอเรส(Fermentas สหรัฐอเมริกา) ปฏิกิริยา PCR RAPD ขยายได้ดำเนินการโดยใช้โปรแกรมของแปรสภาพเริ่มต้นที่ 94 ° C เป็นเวลา 3 นาทีตาม ด้วยรอบ 42 ของการแปรสภาพที่ 94 ° C สำหรับ 30 วินาที หลอมรองพื้นที่ 32 ° C เป็นเวลา 1 นาที นามสกุล 72 ° c 2.5 นาทีและสุดท้ายนามสกุลที่72 ° C เป็นเวลา 4 นาที ประกอบด้วยเงื่อนไขสำหรับ PCR ISSR รอบต้น94 ° c 5 นาทีตาม ด้วยรอบ 35 ของการแปรสภาพที่แปรสภาพ94 ° C เป็นเวลา 30 วินาที การหลอมที่หลอมอุณหภูมิเฉพาะที่เหมาะสมไพรเมอร์ ISSR สำหรับ 30 วินาที นามสกุลที่ 72 ° C เป็นเวลา 1 นาที และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้าย72 ° c สำหรับ 7 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR RAPD และ ISSR ที่ขยายได้electrophoresed ใน agarose 1.5% ใน 1 X TBE (90 mM ทริสเรทติ้ง borate, 2 มม.EDTA, pH 8.0) บัฟเฟอร์ เจลถูกย้อม ด้วยโบรไมด์ ethidium และเอกสารที่ใช้ระบบเอกสารเจล (Syngene, UK)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การสกัด DNA ของยีนและขยาย PCR
สิบห้า regenerates (1-15) ได้รับการสุ่มเลือกเพื่อความมั่นคงทางพันธุกรรม
การประเมิน ดีเอ็นเอจากใบของ regenerates และแม่ของ
พืช (P) ถูกสกัดโดยใช้ CTAB Protocol (ดอยล์และดอยล์, 1990)
ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย (Rathore et al., 2014) ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมด
ได้รับการวัด spectrophotometrically (Biotek Instruments Inc. USA)
และ aliquots เจือจางความเข้มข้นสุดท้ายของ NG 10-15 ไมโครลิตร
-1
.
ปฏิกิริยา PCR สำหรับการตรวจดีเอ็นเอและ ISSR ได้ดำเนินการในโปรแกรมได้
Cycler ความร้อน (Master วงจร epgradient S, Eppendroff, เยอรมนี) PCRRAPD
เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการ (วิลเลียมส์ et al., 1990) โดยใช้
decamer ไพรเมอร์โดยพลการ (Operon Technologies Inc และ IDT, สหรัฐอเมริกา) ในขั้นต้น
สำหรับแต่ละ RAPD และ ISSR พิมพ์ลายนิ้วมือ 25 ไพรเมอร์ที่ได้รับการคัดเลือก.
ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการในปริมาณ 15 ไมโครลิตรผสมปฏิกิริยา
ที่มี 25 NG แม่แบบดีเอ็นเอ 1X PCR บัฟเฟอร์ (Fermentas, USA)
0.2 มิลลิแต่ละ dNTP ของ 3.0 มิลลิ MgCl2 0.4 ไมครอนไพรเมอร์และ 1 U Taq DNA Polymerase
(Fermentas, สหรัฐอเมริกา) ปฏิกิริยาการขยาย PCR-RAPD ถูก
ดำเนินการโดยใช้โปรแกรมของการสูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาที
ตามด้วย 42 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, หลอมไพรเมอร์
ที่ 32 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีส่วนขยายที่ 72 ° C เป็นเวลา 2.5 นาทีสุดท้ายและการขยายที่
72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาที เงื่อนไขสำหรับรอบ PCR-ISSR ประกอบด้วยเบื้องต้น
denaturation ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่
94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, การอบที่อุณหภูมิการอบที่เหมาะสมสำหรับการโดยเฉพาะอย่างยิ่ง
ISSR ไพรเมอร์ 30 วินาทีส่วนขยายที่ 72 ° C เป็นเวลา 1 นาที; และขยายสุดท้าย
ที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 นาที ขยาย PCR-RAPD และ ISSR ผลิตภัณฑ์ถูก
electrophoresed 1.5% agarose ใน 1X TBE (90 mM Tris-borate, 2 mm
EDTA, ค่า pH 8.0) บัฟเฟอร์ เจลถูกย้อมด้วย ethidium bromide และ
เอกสารที่ใช้ระบบเอกสารเจล (Syngene สหราชอาณาจักร)