Many expression plasmids contain ta

Many expression plasmids contain tags as part of their DNA sequence (Table 1), and it is straightforward to add a range of others [30] by gene synthesis or polymerase chain reaction. Frequently-used tags for recombinant membrane proteins are polyhistidine (hexa-, octa- and decahistine tags are all common), green fluorescent protein (GFP) and T4L. These and others have been reviewed extensively elsewhere [31] and [32]. Briefly, polyhistidine tags are routinely fused to recombinantly-produced membrane proteins to facilitate rapid purification by metal chelate chromatography using Ni–NTA resins. In many cases, the tag is not removed prior to crystallization trials, although protease cleavage sites can be engineered into the expression plasmid if this is desired [5]. GFP tags are used differently, typically to assess functional yield or homogeneity of the purified recombinant protein prior to crystallization trials. In the former case, caution must be exercised because GFP tags remain fluorescent in eukaryotic cells irrespective of whether the partner membrane protein is correctly folded in the plasma membrane [33]. GFP is therefore an inappropriate marker to assess the folding status of recombinant membrane proteins produced in yeast prior to extraction, although it is still useful in analyzing the stability of a purified membrane protein by fluorescence size-exclusion chromatography [34]. Finally, most GPCR crystal structures have been obtained using a fusion protein strategy where the flexible third intracellular loop is replaced by T4L, with modified T4L variants having been developed to optimize crystal quality or promote alternative packing interactions [8]. Overall, the precise combination and location (at either terminus or within the protein sequence itself) of any tags needs to be decided based upon their proposed use (for targeting, as an epitope, for purification or as a tool to assess protein quality) and the biochemistry of the recombinant membrane protein (since the exact fusion site may have a major impact on protein yield and quality).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หลายนิพจน์ plasmids ประกอบด้วยแท็กที่เป็นส่วนหนึ่งของลำดับดีเอ็นเอ (ตารางที่ 1), และก็ตรงไปตรงมาจะเพิ่มช่วงของอื่น ๆ [30] โดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสหรือสังเคราะห์ยีน แท็กที่ใช้บ่อยสำหรับเมมเบรน recombinant โปรตีนเป็น polyhistidine (เฮกซ่า- แปด - decahistine แท็ก และมีทั่วไปทั้งหมด), สีเขียวโปรตีนฟลูออเรสเซนต์ (GFP) และ T4L เหล่านี้และอื่น ๆ มีการสอบทานอื่น ๆ [31] และ [32] อย่างกว้างขวาง สั้น ๆ แท็ก polyhistidine อยู่เป็นประจำเข้าด้วยกับผลิต recombinantly เมมเบรนโปรตีนเพื่ออำนวยความสะดวกให้บริสุทธิ์อย่างรวดเร็ว chromatography แอซิดโลหะที่ใช้เรซิ่น Ni – มูลค่า ในหลายกรณี แท็กจะไม่ถูกเอาออกก่อนการทดลองตกผลึก ถึงแม้ว่าโปรติเอสความแตกแยกไซต์สามารถวิศวกรรมเป็น plasmid นิพจน์ถ้าเป็นที่ต้องการ [5] GFP แท็กไว้แตกต่างกัน โดยทั่วไปการประเมินผลผลิตที่ทำงานหรือ homogeneity ของ recombinant โปรตีนบริสุทธิ์ก่อนการทดลองตกผลึก ในกรณีอดีต ข้อควรระวังต้องใช้สิทธิเนื่องจากแท็ก GFP ยังคงเรืองแสงใน eukaryotic เซลล์โดยไม่คำนึงถึงว่าคู่เมมเบรนโปรตีนถูกพับในเยื่อ [33] GFP จึงหมายไม่เหมาะสมเพื่อประเมินสถานะการพับของเยื่อ recombinant โปรตีนผลิตในยีสต์ก่อนสกัด แม้ว่ามันจะยังคงเป็นประโยชน์ในการวิเคราะห์เสถียรภาพของโปรตีนเยื่อบริสุทธิ์โดยเรืองแสงยกเว้นขนาด chromatography [34] ในที่สุด โครงสร้างผลึกของ GPCR ส่วนใหญ่ได้ถูกรับใช้กลยุทธ์ผสมผสานโปรตีนที่ยืดหยุ่นสามวงภายในเซลล์ถูกแทนที่ ด้วย T4L กับตัวแปร T4L แก้ไขที่มีการพัฒนาเพื่อปรับปรุงคุณภาพคริสตัล หรือส่งเสริมปฏิสัมพันธ์ทางเลือกบรรจุ [8] โดยรวม แม่นยำผสมและตำแหน่ง (ที่เทอมินัสอย่างใดอย่างหนึ่ง หรือภาย ในลำดับโปรตีนเอง) ของแท็กใด ๆ ต้องได้รับการตัดสินตามการใช้นำเสนอ (สำหรับการกำหนดเป้าหมาย epitope การทำให้บริสุทธิ์ หรือ เป็นเครื่องมือในการประเมินคุณภาพโปรตีน) และชีวเคมีของเมมเบรน recombinant โปรตีน (เนื่องจากเว็บไซต์ฟิวชั่นที่แน่นอนอาจมีผลกระทบสำคัญโปรตีนผลผลิตและคุณภาพ)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

พลาสมิดแสดงออกหลายคนมีแท็กเป็นส่วนหนึ่งของลำดับดีเอ็นเอของพวกเขา (ตารางที่ 1) และมันเป็นเรื่องง่ายที่จะเพิ่มช่วงของคนอื่น ๆ [30] โดยการสังเคราะห์ยีนหรือวิธี Polymerase chain reaction แท็กที่ใช้บ่อยสำหรับโปรตีน recombinant มี polyhistidine (hexa-, octa- และ decahistine แท็กทั้งหมดทั่วไป), สีเขียวเรืองโปรตีน (GFP) และ T4L คนอื่น ๆ เหล่านี้และได้รับการทบทวนอย่างกว้างขวางอื่น ๆ [31] และ [32] สั้น ๆ , แท็ก polyhistidine กำลังหลอมละลายประจำเพื่อ recombinantly ผลิตโปรตีนเพื่ออำนวยความสะดวกให้บริสุทธิ์อย่างรวดเร็วโดยโครมาโตโลหะคีเลตโดยใช้เรซิน Ni-NTA ในหลายกรณีแท็กไม่ถูกลบออกก่อนที่จะมีการทดลองการตกผลึกแม้ว่าเว็บไซต์น้ำย่อยความแตกแยกสามารถวิศวกรรมเข้าไปในพลาสมิดแสดงออกว่านี้เป็นที่ต้องการ [5] แท็ก GFP มีการใช้ที่แตกต่างกันโดยทั่วไปในการประเมินผลตอบแทนการทำงานหรือความเป็นเนื้อเดียวกันของโปรตีนบริสุทธิ์ก่อนที่จะมีการทดลองการตกผลึก ในกรณีที่อดีตระมัดระวังจะต้องใช้สิทธิเพราะแท็ก GFP ยังคงเรืองแสงในเซลล์ยูคาริโอโดยไม่คำนึงถึงว่าเยื่อหุ้มเซลล์โปรตีนพันธมิตรพับอย่างถูกต้องในเยื่อหุ้มพลาสม่า [33] GFP จึงเป็นเครื่องหมายที่ไม่เหมาะสมในการประเมินสถานะการพับของโปรตีน recombinant ผลิตในยีสต์ก่อนที่จะมีการสกัดแม้ว่ามันจะยังคงมีประโยชน์ในการวิเคราะห์เสถียรภาพของเยื่อหุ้มเซลล์โปรตีนบริสุทธิ์โดยการเรืองแสงขนาดยกเว้นโครมาโต [34] ในที่สุดส่วนใหญ่โครงสร้าง GPCR คริสตัลได้รับการรับใช้กลยุทธ์โปรตีนฟิวชั่นที่มีความยืดหยุ่นห่วงเซลล์ที่สามจะถูกแทนที่ด้วย T4L กับการแก้ไข T4L สายพันธุ์ที่ได้รับการพัฒนาเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพคุณภาพคริสตัลหรือส่งเสริมปฏิสัมพันธ์ทางเลือกบรรจุ [8] โดยรวม, การรวมกันได้อย่างแม่นยำและสถานที่ตั้ง (ที่ทั้งสถานีหรือภายในลำดับโปรตีนเอง) ของแท็กใด ๆ ที่จะต้องมีการตัดสินใจขึ้นอยู่กับการใช้งานที่นำเสนอของพวกเขา (สำหรับการกำหนดเป้าหมายเป็น epitope สำหรับการทำให้บริสุทธิ์หรือเป็นเครื่องมือในการประเมินคุณภาพโปรตีน) และ ชีวเคมีของเยื่อหุ้มเซลล์โปรตีน recombinant นี้ (ตั้งแต่ฟิวชั่นเว็บไซต์ที่ถูกต้องอาจมีผลกระทบสำคัญต่อผลผลิตและคุณภาพของโปรตีน)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เพื่อการแสดงออกมากประกอบด้วยแท็กเป็นส่วนหนึ่งของดีเอ็นเอลำดับ ( ตารางที่ 1 ) และมันเป็นตรงไปตรงมาเพื่อเพิ่มช่วงของผู้อื่น [ 30 ] โดยยีนสังเคราะห์หรือปฏิกิริยาลูกโซ่ . แท็กที่ใช้บ่อยสำหรับเซลล์เมมเบรนโปรตีนเป็น polyhistidine ( หก - แปด - decahistine แท็กทั้งหมดทั่วไป ) , โปรตีนเรืองแสงสีเขียว ( GFP ) และ t4l เหล่านี้และคนอื่น ๆได้รับการตรวจทานอย่างกว้างขวางที่อื่น [ 31 ] และ [ 32 ] สั้น ๆ , polyhistidine แท็กตรวจฟิวส์เพื่อ recombinantly ผลิตโปรตีนเมมเบรนเพื่ออำนวยความสะดวกรวดเร็วบริสุทธิ์โดยวิธีโครมาโทกราฟี คีเลตโลหะโดยใช้เรซินผม - ค้าขาย . ในหลายกรณี , แท็กไม่ได้เอาออกก่อนการทดลองการตกผลึก แม้ว่าเว็บไซต์แยกออกโปรสามารถปรับในการแสดงออก ในถ้านี้เป็นที่ต้องการ [ 5 ] GFP แท็กใช้แตกต่างกัน โดยทั่วไปในการประเมินการทำงานของผลผลิตหรือรวมตัวและรีคอมบิแนนท์โปรตีนก่อนการทดลองการตกผลึก ใน กรณีอดีต ต้องใช้ความระมัดระวังเนื่องจาก GFP ใน eukaryotic เซลล์แท็กยังคงเรืองแสงไม่ว่าพันธมิตรเมมเบรนโปรตีนเป็นอย่างถูกต้องพับในเยื่อหุ้มเซลล์ [ 33 ] GFP จึงเป็นเครื่องหมายที่ไม่เหมาะสมเพื่อประเมินสถานะของรีคอมบิแนนท์โปรตีนพับแผ่นผลิตในยีสต์ก่อนการสกัด แม้ว่าจะยังเป็นประโยชน์ในการวิเคราะห์เสถียรภาพของเมมเบรนโปรตีนบริสุทธิ์โดยวิธีฟลูออเรสเซนต์ขนาดยกเว้นโครม [ 34 ] สุดท้าย โครงสร้างของผลึก gpcr ที่สุดได้รับการใช้กลยุทธ์ที่ยืดหยุ่นของโปรตีนภายในเซลล์จะถูกแทนที่ด้วย t4l สามห่วง , t4l ดัดแปลงพันธุ์ที่ได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพคุณภาพคริสตัลหรือส่งเสริมปฏิสัมพันธ์บรรจุทดแทน [ 8 ] โดยรวม , การรวมกันที่ถูกต้องและสถานที่ ( ที่เครื่องปลายทางหรือภายในโปรตีนลำดับตัวเอง ) แท็กใด ๆ ต้องตัดสินใจตามเสนอใช้ ( สำหรับเป้าหมายเป็นไวรัส , การทำให้บริสุทธิ์หรือเป็นเครื่องมือในการประเมินคุณภาพของโปรตีน ) และชีวเคมีของรีคอมบิแนนท์โปรตีนเมมเบรน ( ตั้งแต่เว็บไซต์ฟิวชั่นที่แน่นอนอาจ มีผลกระทบที่สำคัญต่อผลผลิตโปรตีนและคุณภาพ )