PCR was carried out in 25 ll reacti

PCR was carried out in 25 ll reactions consisting of 2 ll template DNA (50 ng/ll),
1 ll each primer (10 lmol/l), 2.5 ll 10 9 buffer, 1.5 ll Mg2? (25 mmol/l), 0.2 ll
Taq DNA polymerase (5 U/ll), 2 ll dNTPs (2 mmol/l), and 14.8 ll sterilized water.
The amplification conditions were denaturation at 94C for 6 min; followed by 30
cycles of denaturation at 94C for 30 s, annealing at 56C for 30 s, and extension at
72C for 30 s; and a final elongation step at 72C for 10 min. Each amplification
product was verified by electrophoresis on a 1.2% agarose gel (5 V/cm) in 0.5 9 TBE
buffer. Gels were stained with ethidium bromide.
Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis
For single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis, 2 ll of each
amplification product was added to 7 ll denaturing buffer: 98% formamide, 0.025%
bromophenol blue, 0.025% xylene cyanole FF, 10 mmol/l EDTA (pH 8.0), and 10%
glycerol. The samples were heat-denatured at 98C for 10 min and then chilled on
ice for 5 min. Electrophoresis was performed at 150 V on 10% nondenaturing
polyacrylamide gel (29:1) for 11–13 h at 16C. SSCP patterns on the gels were
visualized by silver staining.
PCR products of homozygous/heterozygous individuals of different genotypes
were purified with a DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit. The purified
PCR products were ligated to pGEM-T Easy vector and transformed into DH5-a
Escherichia coli. Positive recombinant colonies for each genotype were chosen. The
sequencing reactions were completed by Shanghai Invitrogen Biotechnology Co.
(The PCR products of heterozygous individuals for MYOE1-3 were directly
sequenced.)
Statistical Analysis
The general linear model (GLM) was established to analyze the genotype effects of
the myostatin gene on body weight traits. The following linear model was used:
yij = l ? Gi ? e, where yij is the body weight traits, l is the overall mean, Gi is the
genotypic effect of the myostatin gene, and e is the residual error. These statistical
analyses were carried out using SPSS 11.0 software.
Results
PCR Amplification and SSCP Analysis
The PCR products amplified by the eight pairs of primers were ideal (not shown).
Three pairs of primers (MYOE1-3, MYOE3-2, and MYOE3-3) displayed
polymorphisms. For primer MYOE1-3, three genotypes were detected in Bian,
Jinghai, and Youxi chickens and named DD, DE, and EE (Fig. 2); the Arbor Acre
breed displayed only two genotypes (DE and EE). For primer MYOE3-2, the
genotypes FF and FG were detected in Bian, Jinghai, and Youxi chickens (Fig. 3).
For primer MYOE3-3, the genotypes HH and HI were detected in Bian, Jinghai, and

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

PCR ได้ดำเนินการใน 25 ll ปฏิกิริยาประกอบด้วย 2 ll แม่แบบดีเอ็นเอ (50 ng/ll),1 ll ละไพรเมอร์ (10 lmol/l), บัฟเฟอร์ ll 10 9 2.5, 1.5 ll Mg2 (25 มิลลิโมล/ลิตร), 0.2 llTaq DNA พอลิเมอเรส (5 U ll), 2 ll dNTPs (2 mmol/l), และน้ำเชื้อจะ 14.8เงื่อนไขขยายถูกแปรสภาพ 94 c เป็นเวลา 6 นาที ตาม ด้วย 30รอบของการแปรสภาพที่ 94 C 30 s หลอมที่ 56 C 30 s และนามสกุลที่C 72 30 s และขั้นตอนสุดท้ายยืด 72 c เป็นเวลา 10 นาที ขยายแต่ละผลิตภัณฑ์ได้รับการตรวจ โดยอิบนเจล 1.2% agarose (5 V/cm) ใน 0.5 9 TBEบัฟเฟอร์ เจถูกย้อม ด้วยโบรไมด์ ethidiumวิเคราะห์ความแตกต่างโครงสร้างสาระเดียวสำหรับการวิเคราะห์ความแตกต่าง (SSCP) โครงสร้างสาระเดี่ยว 2 ll ของแต่ละขยายสินค้าถูก 7 ll denaturing บัฟเฟอร์: formamide 98%, 0.025%bromophenol blue, 0.025% พารา cyanole FF, 10 mmol/l EDTA (pH 8.0), และ 10%กลีเซอรอล ตัวอย่างเอทิลแอลกอฮอล์ความร้อน 98 c เป็นเวลา 10 นาที และแช่เย็นจากนั้น บนทำน้ำแข็งสำหรับ 5 นาทีอิ 150 V nondenaturing 10%ตรวจสอบวิเคราะห์เจล (คง) สำหรับ 11 – 13 ชั่วโมงในรูปแบบ SSCP 16 C. บนเจได้แสดงเป็นภาพ โดยการย้อมสีเงินผลิตภัณฑ์ PCR ของบุคคล homozygous heterozygous ของพันธุ์ต่าง ๆได้บริสุทธิ์ ด้วยดีเอ็นเอส่วนชุดฟอก/กู้คืนอย่างรวดเร็ว ที่บริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์ PCR กเดี่ยวกับเวกเตอร์ pGEM T ง่าย และแปรสภาพ DH5-ที่Escherichia coli บวก recombinant อาณานิคมสำหรับจีโนไทป์แต่ละรับเลือกใน การลำดับปฏิกิริยาเสร็จ โดยเซี่ยงไฮ้ Invitrogen เทคโนโลยีชีวภาพ จำกัด(ผลิตภัณฑ์ PCR ของ heterozygous สำหรับ MYOE1 3 ได้โดยตรงเรียงลำดับ)การวิเคราะห์ทางสถิติแบบจำลองเชิงเส้นทั่วไป (จีแอลเอ็มเมอริเดียน) ก่อตั้งขึ้นเพื่อวิเคราะห์ผลกระทบของจีโนไทป์ยีน myostatin ในลักษณะน้ำหนักร่างกาย ใช้แบบจำลองเชิงเส้นต่อไปนี้:yij = l อาหาร e, yij เป็น ลักษณะน้ำหนักร่างกาย l หมายถึงอะไรโดยรวม Gi เป็นการผลจีโนไทป์ของยีน myostatin และ e คือ ข้อผิดพลาดที่เหลือ สถิติเหล่านี้ได้ดำเนินการวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS 11.0ผลลัพธ์กระบือและ SSCP วิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ขยาย โดยคู่แปดของไพรเมอร์เหมาะ (ไม่แสดง)3 คู่ไพรเมอร์ (MYOE1-3, MYOE3-2 และ MYOE3 3) แสดงครั้งที่สอง รองพื้นที่ MYOE1-3 ศึกษาจีโนไทป์สามพบใน Bianจิ้ง ไห่ และ Youxi ไก่ และชื่อ DD, DE และ EE (รูป 2); เอเคอร์ซุ้มสายพันธุ์แสดงศึกษาจีโนไทป์สองเท่า (DE และ EE) รองพื้น MYOE3-2 การศึกษาจีโนไทป์ FF และ FG พบในไก่ Bian จิ้งไห่ และ Youxi (3 รูป)รองพื้นที่ MYOE3-3 ศึกษาจีโนไทป์ HH และสูงพบใน Bian จิ้งไห่ และ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

PCR ได้ดำเนินการใน 25 LL ปฏิกิริยาประกอบด้วย 2 LL แม่แบบดีเอ็นเอ (50 ng / LL),
1 LL แต่ละไพรเมอร์ (10 lmol / L) 2.5 LL 10 9 บัฟเฟอร์ 1.5 LL Mg2? (25 มิลลิโมล / ลิตร) 0.2 LL
Taq DNA Polymerase (5 U / LL) 2 dNTPs LL (2 มิลลิโมล / ลิตร) และ 14.8 LL น้ำฆ่าเชื้อ.
เงื่อนไขขยายเป็น denaturation ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 6 นาที; ตามด้วย 30
รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, การอบที่ 56 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและส่วนขยายที่?
72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที; และขั้นตอนการยืดตัวสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ขยายแต่ละ
ผลิตภัณฑ์ได้รับการตรวจสอบโดย electrophoresis บน 1.2% agarose เจล (5 V / เซนติเมตร) 0.5 9 TBE
บัฟเฟอร์ เจลถูกย้อมด้วย ethidium bromide.
เดี่ยว Strand คล้อยตามการวิเคราะห์ความแตกต่าง
สำหรับเดียว Strand โครงสร้าง polymorphism (SSCP) การวิเคราะห์ 2 LL ของแต่ละ
ผลิตภัณฑ์เครื่องขยายเสียงถูกบันทึกอยู่ใน 7 LL denaturing บัฟเฟอร์: 98% formamide, 0.025%
bromophenol สีฟ้า, 0.025% ไซลีน cyanole FF 10 มิลลิโมล / ลิตร EDTA (pH 8.0) และ 10%
กลีเซอรอล ตัวอย่างถูกความร้อนเอทิลแอลกอฮอล์ที่ 98 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีแล้วแช่เย็น
น้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที อิเล็กได้รับการดำเนินการใน 150 V บน 10% nondenaturing
เจลอะคริเลต (29: 1)? สำหรับ 11-13 ชั่วโมงที่ 16 C รูปแบบ SSCP ในเจลที่ถูก
มองเห็นโดยการย้อมสีเงิน.
ผลิตภัณฑ์ PCR ของบุคคล homozygous / heterozygous ของยีนที่แตกต่างกัน
ทำให้บริสุทธิ์ด้วยดีเอ็นเอ Fragment ด่วนบริสุทธิ์ / กู้คืน Kit บริสุทธิ์
ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกผูกเวกเตอร์ pGEM-T ง่ายและเปลี่ยนเป็น DH5-A
เชื้อ Escherichia coli บวกอาณานิคม recombinant สำหรับแต่ละจีโนไทป์ได้รับการแต่งตั้ง
ปฏิกิริยาลำดับเสร็จสมบูรณ์โดยเซี่ยงไฮ้ Invitrogen เทคโนโลยีชีวภาพ จำกัด
(ผลิตภัณฑ์ PCR ของบุคคล heterozygous สำหรับ MYOE1-3 ถูกโดยตรง
ติดใจ.)
การวิเคราะห์ทางสถิติ
แบบจำลองเชิงเส้นทั่วไป (GLM) ก่อตั้งขึ้นในการวิเคราะห์ผลกระทบจีโนไทป์ของ
ยีน myostatin บนน้ำหนักตัว ลักษณะ รูปแบบเชิงเส้นต่อไปนี้ถูกนำมาใช้:
yij = L? Gi? E ที่ yij เป็นลักษณะน้ำหนักตัว L เป็นค่าเฉลี่ยโดยรวม Gi เป็น
ผลกระทบทางพันธุกรรมของยีน myostatin และ E เป็นข้อผิดพลาดที่เหลือ เหล่านี้สถิติ
การวิเคราะห์ถูกดำเนินการโดยใช้โปรแกรม SPSS 11.0 ซอฟต์แวร์.
ผลการ
ขยาย PCR และ SSCP วิเคราะห์
PCR ผลิตภัณฑ์ขยายโดยแปดคู่ของไพรเมอร์เป็นที่เหมาะ (ไม่แสดง).
สามคู่ไพรเมอร์ (MYOE1-3, MYOE3-2 และ MYOE3- 3) ที่แสดง
ความหลากหลาย สำหรับไพรเมอร์ MYOE1-3 สามยีนถูกตรวจพบในเบียน
Jinghai และไก่ Youxi และตั้งชื่อ DD, DE และ EE (รูปที่ 2.); อาร์เบอร์เอเคอร์
พันธุ์แสดงเพียงสองจีโนไทป์ (และ EE) สำหรับไพรเมอร์ MYOE3-2 ที่
FF จีโนไทป์และ FG ถูกตรวจพบในเบียน Jinghai และไก่ Youxi (รูปที่. 3).
สำหรับไพรเมอร์ MYOE3-3 ที่ HH จีโนไทป์และ Hi ถูกตรวจพบในเบียน Jinghai และ