The development of an initial fatty

The development of an initial fatty acid overproducing strain followed the metabolic
engineering strategy presented in Figure 1. First, to prevent catabolism of free fatty acids,
the gene encoding acyl-CoA synthetase (fadD) was deleted from the chromosome. Second,
to prevent consumption of the inducing agent L-arabinose, the araBAD operon was deleted.
This operon encodes three genes involved in the initial steps of L-arabinose degradation: Lribulokinase,
L-arabinose isomerase, and L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase. The resulting
strain, K-12 MG1655 ΔfadD ΔaraBAD, is designated as strain RL08. Finally, to hydrolyze
free fatty acids from acyl-ACP, a codon-optimized plant acyl-ACP thioesterase (BTE) from
U. californica was cloned into various arabinose-inducible plasmids and transformed into
strain RL08. The four selected plasmids were pBAD34 (pUC origin), pBAD18 (pBR322
origin without rop), pBAD33 (pACYC origin), and pBAD35 (pBBR1 origin). These
plasmids range from very high reported copy number with the pUC origin (pBAD34;
Yanisch-Perron et al., 1985), to medium copy number in pBAD18 (Cronan, 2006; Guzman
et al., 1995) to low copy number in pBAD33 (Chang and Cohen, 1978; Guzman et al.,
1995). The only reported copy number of the pBBR1 origin in E. coli is 30–40 copies per
cell (Antoine and Locht, 1992). An identical set of plasmids expressing a nonfunctional
version of BTE with histidine-204 mutagenized to an alanine were also transformed into
strain RL08 to serve as negative controls.
To determine the optimal plasmid copy number for expressing BTE, cultures of strain RL08
harboring each plasmid (with both functional and nonfunctional BTE) were grown in shake
flasks containing 50 mL of LB medium supplemented with 0.4% (v/v) glycerol. The OD600
was monitored (Fig. 2), and relative copy numbers of each plasmid were determined by
qPCR from cell cultures immediately before induction of transcription at OD 0.2, and during
early stationary phase after an elapsed time of 7.7 h from inoculation (Table III).
Dramatically lower cell densities were observed after approximately 5 h when BTE was
expressed on plasmids pBAD34 and pBAD18 (Fig. 2). Nonfunctional BTE-H204A did not
exhibit similarly reduced cell densities, strongly suggesting that the decreased cell densities
were a result of thioesterase activity.
Relative copy numbers trended as expected (Table III), with pBAD34 exhibiting the highest
number of copies per copy of the selected chromosomal internal standard, ompA, during

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การพัฒนาต้องใช้ overproducing เป็นกรดไขมันที่เริ่มต้นด้วยการเผาผลาญวิศวกรรมกลยุทธ์ที่แสดงในรูปที่ 1 ครั้งแรก เพื่อป้องกันแคแทบอลิซึมของกรดไขมันอิสระยีนที่เข้ารหัส acyl CoA synthetase (fadD) ถูกลบออกจากโครโมโซม วินาทีเพื่อป้องกันการใช้ตัวแทน inducing L arabinose, araBAD operon ถูกลบOperon นี้จแมป 3 ยีนที่เกี่ยวข้องในขั้นตอนเริ่มต้นของย่อยสลาย L arabinose: Lribulokinaseไอโซเมอเรส L arabinose และ L-ribulose-5-ฟอสเฟต 4-epimerase การส่งผลต้องใช้ K-12 MG1655 ΔfadD ΔaraBAD จะถูกกำหนดเป็นสายพันธุ์ RL08 ในที่สุด การ hydrolyzeกรดไขมันอิสระจาก acyl-ACP การปรับรหัสพันธุกรรมพืช acyl ACP thioesterase (BTE) จากประเทศ californica โคลนเป็น plasmids arabinose inducible ต่าง ๆ และเปลี่ยนเป็นสายพันธุ์ RL08 Plasmids เลือกสี่ถูก pBAD34 (pUC กำเนิด), pBAD18 (pBR322กำเนิด โดย rop), pBAD33 (pACYC จุดเริ่มต้น), และ pBAD35 (pBBR1 จุดเริ่มต้น) เหล่านี้plasmids ตั้งแต่หมายเลขสำเนารายงานสูงมากกับจุดกำเนิด pUC (pBAD34Yanisch-Perron และ al., 1985), หมายเลขสำเนากลางใน pBAD18 (Cronan, 2006 Guzmanและ al., 1995) หมายเลขสำเนาต่ำใน pBAD33 (ช้างและโคเฮน 1978 Guzman et al.,1995) การสำเนารายงานส่งสำเนา 30 – 40 ต่อมีจำนวนกำเนิด pBBR1 ใน E. coliเซลล์ (Antoine และ Locht, 1992) ชุด plasmids แสดงการ nonfunctional อาจเป็นเหมือนกันรุ่น BTE กับ histidine-204 mutagenized กับอะลานีนยังถูกเปลี่ยนเป็นสายพันธุ์ RL08 เป็นตัวควบคุมค่าลบเพื่อกำหนดจำนวนสำเนา plasmid ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับกำลัง BTE วัฒนธรรมของต้องใช้ RL08harboring plasmid ละ (พร้อมทั้งทำงาน และ nonfunctional อาจ BTE) ถูกปลูกปั่นน้ำที่ประกอบด้วย 50 mL ของปอนด์กลางเสริม ด้วยกลีเซอร 0.4% (v/v) OD600ตรวจสอบ (Fig. 2), และสำเนาญาติได้ไปตามหมายเลขของแต่ละ plasmidqPCR จากวัฒนธรรมเซลล์ทันทีก่อนที่จะเหนี่ยวนำของราชบัณฑิตยสถาน OD 0.2 และระหว่างระยะเครื่องเขียนเริ่มต้นหลังจากเวลาผ่านไป h 7.7 จาก inoculation (ตาราง III)ความหนาแน่นของเซลล์ลดลงอย่างมากได้สังเกตหลังจากประมาณ 5 h เมื่อ BTEแสดง plasmids pBAD34 และ pBAD18 (Fig. 2) H204A BTE nonfunctional อาจไม่แสดงในทำนองเดียวกันลดลงความหนาแน่นของเซลล์ ขอแนะนำที่ความหนาแน่นเซลล์ลดลงผลลัพธ์ของกิจกรรม thioesterase ได้ญาติสำเนาหมายเลข trended เป็นต้น (ตาราง III), กับ pBAD34 อย่างมีระดับที่สูงที่สุดจากหมายเลขต่อของการเลือกของโครโมโซมภายในมาตรฐาน ompA ระหว่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การพัฒนาของกรดไขมันเริ่มต้น overproducing
ความเครียดตามการเผาผลาญกลยุทธ์วิศวกรรมที่นำเสนอในรูปที่1 เป็นครั้งแรกเพื่อป้องกันการ catabolism ของกรดไขมันอิสระ,
การเข้ารหัสยีน synthetase acyl-CoA (fadD) ถูกลบออกจากโครโมโซม ประการที่สอง. เพื่อป้องกันไม่ให้การบริโภคของตัวแทนการกระตุ้นให้เกิด L-arabinose ที่ operon araBAD ถูกลบ operon นี้ encodes สามยีนที่เกี่ยวข้องกับขั้นตอนการเริ่มต้นของการย่อยสลาย L-arabinose: Lribulokinase, isomerase L-arabinose และ L-ribulose-5-ฟอสเฟต 4 epimerase ส่งผลให้สายพันธุ์ K-12 MG1655 ΔfadDΔaraBAD, ถูกกำหนดให้เป็นสายพันธุ์ RL08 สุดท้ายเพื่อย่อยสลายกรดไขมันอิสระจาก acyl-ACP โรงงาน codon ที่เหมาะสม acyl-ACP thioesterase (BTE) จาก U. californica เป็นโคลนเข้าไปในพลาสมิดอราบิโน-inducible ต่างๆและกลายเป็นสายพันธุ์RL08 สี่พลาสมิดที่เลือกได้ pBAD34 (ต้นกำเนิด PUC) pBAD18 (pBR322 แหล่งที่มาโดยไม่ต้อง ROP) pBAD33 (pACYC ต้นกำเนิด) และ pBAD35 (ต้นกำเนิด pBBR1) เหล่านี้พลาสมิดช่วงจากจำนวนสำเนารายงานสูงมากที่มีต้นกำเนิด PUC (pBAD34;. Yanisch-Perron, et al, 1985) จำนวนสำเนาขนาดกลางใน pBAD18 (Cronan 2006; Guzman., et al, 1995) จำนวนสำเนาต่ำ pBAD33 (ช้างและโคเฮน, 1978. Guzman, et al, 1995) จำนวนสำเนารายงานเพียงจุดเริ่มต้นของ pBBR1 ในเชื้อ E. coli เป็น 30-40 เล่มต่อเซลล์(แอนทอนและ LOCHT, 1992) ชุดที่เหมือนกันของพลาสมิดแสดง nonfunctional รุ่น BTE กับฮิสติดีน-204 mutagenized กับอะลานีนถูกเปลี่ยนออกเป็นRL08 สายพันธุ์ที่จะให้บริการการควบคุมเชิงลบ. เพื่อกำหนดจำนวนสำเนาพลาสมิดที่ดีที่สุดสำหรับการแสดง BTE วัฒนธรรมของสายพันธุ์ RL08 เก็บงำแต่ละพลาสมิด ( ที่มีทั้งการทำงานและ nonfunctional BTE) ได้รับการปลูกในสั่นขวดมี50 มลของกลาง LB เสริมด้วย 0.4% (v / v) กลีเซอรอล OD600 ได้รับการตรวจสอบ (รูปที่. 2) และตัวเลขสำเนาญาติของพลาสมิดแต่ละถูกกำหนดโดยqPCR จากเซลล์เพาะเลี้ยงทันทีก่อนที่จะเหนี่ยวนำของการถอดความที่ OD 0.2 และในช่วงเฟสต้นหลังจากเวลาที่ผ่านไป7.7 ชั่วโมงจากการฉีดวัคซีน (ตารางที่สาม ). อย่างมากที่ต่ำกว่าความหนาแน่นของเซลล์ถูกตั้งข้อสังเกตหลังจากนั้นประมาณ 5 ชั่วโมงเมื่อ BTE ถูกแสดงบนพลาสมิดpBAD34 และ pBAD18 (รูปที่. 2) nonfunctional BTE-H204A ไม่ได้แสดงลดลงในทำนองเดียวกันความหนาแน่นของเซลล์ขอบอกว่าความหนาแน่นของเซลล์ลดลงเป็นผลมาจากกิจกรรมthioesterase ได้. หมายเลขสำเนาญาติมีแนวโน้มเป็นไปตามคาด (ตารางที่ III) ด้วย pBAD34 แสดงสูงสุดจำนวนสำเนาต่อสำเนาที่เลือกโครโมโซมมาตรฐานภายใน OMPA ระหว่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การพัฒนาเริ่มต้นของกรดไขมัน overproducing ความเครียดตามการสลาย
วิศวกรรมกลยุทธ์นำเสนอในรูปที่ 1 ก่อน เพื่อป้องกันไม่ให้กระบวนการสลายกรดไขมันอิสระ
ยีน , COA เทสการเข้ารหัส ( fadd ) ถูกลบออกจากโครโมโซม 2
เพื่อป้องกันการบริโภคของกระตุ้นตัวแทน l-arabinose , arabad
โอเปอรอนถูกลบไปโอเปอร์รอนนี้เข้ารหัส 3 ยีนที่เกี่ยวข้องในขั้นตอนเริ่มต้นของการ l-arabinose : lribulokinase
l-arabinose , จาก , และ l-ribulose-5-phosphate 4-epimerase . ผล
เมื่อยภาคบังคับ mg1655 Δ fadd Δ arabad เขต rl08 , ความเครียด ในที่สุด , ,
กรดไขมันอิสระจาก , ACP , พืช , codon ( ACP thioesterase ( BTE )
Ucalifornica ถูกโคลนเข้าสู่พลาสมิด และกลายเป็นน้ำตาลต่าง ๆ inducible
rl08 สายพันธุ์ 4 ) เลือกได้ pbad34 ( โภคที่มา ) , pbad18 ( pbr322
ที่มาโดยรอบ ) , pbad33 ( pacyc ต้น ) และ pbad35 ( pbbr1 กำเนิด ) พลาสมิดนี้
ช่วงจากสูงมากมีจำนวนสำเนาด้วยโภคของ pbad34 ;
yanisch เปอรอง et al . , 1985 ) , กลาง ( โครแนนจำนวนสำเนาใน pbad18 ,2006 ; Guzman
et al . , 1995 ) จำนวนสำเนาใน pbad33 ( ช้างและโคเฮน , 1978 ; Guzman et al . ,
1995 ) แต่รายงานจำนวนสำเนาของที่มา pbbr1 ใน E . coli คือ 30 – 40 แผ่นต่อเซลล์ ( แอน และ locht
, 1992 ) การตั้งค่าที่เหมือนกันของพลาสมิดที่แสดงรุ่น nonfunctional
ของ BTE กับ histidine-204 mutagenized กับอะลานีนยังกลายเป็น
สายพันธุ์ rl08 เพื่อเป็นการควบคุมลบ .
หาที่ดีที่สุด คัดเลข ในการแสดง BTE วัฒนธรรมของแต่ละสายพันธุ์ rl08
harboring พลาสมิด ( ที่มีทั้งการทำงานและ nonfunctional BTE ) ปลูกในขวดเขย่า
ผสม 50 มิลลิลิตร ปอนด์เติม 0.4 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) กลีเซอรอล . การ od600
ถูกตรวจสอบ ( รูปที่ 2 ) และญาติคัดลอกตัวเลขของแต่ละสายพันธุ์ถูกกำหนดโดย
qpcr จากเซลล์วัฒนธรรมทันทีก่อนการถอดความ OD 0.2 และในช่วงระยะหลังเครื่องเขียน
เร็วเวลา 7.7 H จากการฉีดวัคซีน ( ตารางที่ 3 ) พบว่าเซลล์มีความหนาแน่น
ลดลงอย่างมากหลังประมาณ 5 ชั่วโมงเมื่อ BTE เป็น
แสดงในพลาสมิดและ pbad34 pbad18 ( รูปที่ 2 ) bte-h204a nonfunctional ไม่ได้
แสดงในเซลล์มีความหนาแน่นลดลง ,ขอแนะนำว่า เซลล์มีความหนาแน่นลดลง ผลของกิจกรรม thioesterase
.
หมายเลขคัดลอกสัมพัทธ์มีแนวโน้มตามที่คาดไว้ ( ตารางที่ 3 ) pbad34 จัดแสดงจำนวนสูงสุดของชุดต่อ
สำเนาเลือกโครโมโซมภายในมาตรฐานสูงสุด ในระหว่าง