Functional fluorescence imagingAdul

Functional fluorescence imaging
Adult hemolymph-like saline (AHL) consisting of (in mM) 108 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 8.2 MgCl2, 4 NaHCO3,
1 NaH2PO4-H2O, 5 trehalose, 10 sucrose, 5 HEPES; pH 7.5 (Wang, 2003) was used to bathe the
brain, as previously described (Wang, 2003; Shang et al., 2011). For SuperClomeleon experiments,
the AHL pH was increased to 7.7 to optimize response magnitude. Test compounds adenosine
5′-triphosphate magnesium salt (ATP), carbamoylcholine chloride (CCh), picrotoxin (PTX), and
γ-aminobutyric acid (GABA) were purchased from Sigma–Aldrich (St Louis, MO), serotonin hydrochloride
(5HT) was purchased from Tocris Bioscience (Minneapolis, MN), and tetrodotoxin (TTX) was purchased
from Abcam Biochemicals (Cambridge, England). ATP, CCh, and TTX were dissolved in milliQ
water and frozen as aliquot stocks, which were then prepared for experiments by dilution in AHL.
PTX was dissolved and frozen in DMSO aliquots, which were diluted in AHL for experiments. All solutions
used in experiments with PTX were prepared with the same percentage of DMSO. GABA and
5HT were dissolved directly in AHL immediately prior to the experiment, and 5HT was kept in lightshielded
containers to prevent degradation.
Imaging experiments were performed using a naked brain preparation. Flies were anesthetized on
ice, and brains were dissected into cool AHL. Dissected brains were then pinned to a layer of Sylgard
(Dow Corning, Midland, MI) silicone under a small bath of AHL contained within a recording/perfusion
chamber (Warner Instruments, Hamden, CT). Brains expressing GCaMP3.0, Arclight, and SpH were
allowed to settle for 5 min after dissection to reduce movement. These brains were then exposed to
fluorescent light for approximately 30 s before imaging to allow for baseline fluorescence stabilization,
while brains expressing the FRET sensors Epac1-camps or SuperClomeleon were exposed an
extra 5 min to minimize differences in photobleaching rates between the CFP and YFP fluorophores,
as YFP has been described to photobleach more slowly than CFP (Shafer et al., 2008; Pirez et al.,
2013). Perfusion flow was established over the brain with a gravity-fed ValveLink perfusion system
(Automate Scientific, Berkeley, CA). ATP, CCh, GABA, or 5HT were delivered by switching perfusion
flow from the main AHL line to another channel containing diluted compound after 30 s of baseline
recording for desired durations followed by a return to AHL flow. To control for the effects of switching
channels, a vehicle control trial was performed by switching to another line containing AHL for the
same duration as the experimental trial.
Imaging was performed using an Olympus BX51WI fluorescence microscope (Olympus, Center
Valley, PA) under an Olympus x40 (0.80W, LUMPlanFl) or x60 (0.90W, LUMPlanFI) water-immersion
objective, and all recordings were captured using a charge-coupled device camera (Hamamatsu ORCA

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ภาพงาน fluorescenceผู้ใหญ่ hemolymph เหมือนน้ำเกลือ (AHL) ประกอบด้วย (ใน mM) 108 NaCl, 5 KCl, CaCl2, 8.2 MgCl2, NaHCO3, 4 21 NaH2PO4-H2O, 5 trehalose ซูโครส 10, 5 HEPES pH 7.5 (วัง 2003) ใช้ในการอาบน้ำสมอง เป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (วัง 2003 ซาง et al., 2011) สำหรับการทดลอง SuperClomeleonAHL pH ขึ้นไป 7.7 การปรับขนาดการตอบสนอง ทดสอบสารอะดี5′ โนซีนไตรฟอสเฟตแมกนีเซียมเกลือ (ATP), carbamoylcholine คลอไรด์ (CCh), picrotoxin (PTX), และซื้อจากซิก-Aldrich (St Louis, MO), serotonin ไฮโดรคลอไรด์γ-aminobutyric กรด(น้ำนมข้าวกล้องงอก)(5HT) ถูกซื้อจากซื้อ Tocris (มิ MN), และร้าน tetrodotoxin (TTX)จาก Abcam Biochemicals (เคมบริดจ์ อังกฤษ) ATP, CCh และ TTX ถูกละลายใน milliQน้ำ และแช่แข็งเป็นหุ้น aliquot ซึ่งได้เตรียมไว้แล้วสำหรับทดลอง โดยเจือจางใน AHLPTX ส่วนยุบ และแช่แข็งใน DMSO aliquots ซึ่งถูกทำให้เจือจางใน AHL สำหรับการทดลอง โซลูชั่นทั้งหมดใช้ในการทดลองกับ PTX ถูกเตรียม ด้วยเปอร์เซ็นต์ของ DMSO เดียวกัน น้ำนมข้าวกล้องงอก และ5HT ถูกละลายโดยตรงใน AHL ทันทีก่อนทดลอง และ 5HT ถูกเก็บไว้ใน lightshieldedภาชนะบรรจุเพื่อป้องกันการสลายตัวภาพการทดลองถูกดำเนินการโดยใช้การเตรียมสมองเปล่า แมลงได้ด้วยในน้ำแข็ง และสมองถูก dissected เป็น AHL เย็น สมอง dissected ถูกตรึงไว้กับชั้นของ Sylgard แล้ว(คอร์นทำดาว คอร์ปอร์เร MI) ซิลิโคนใต้น้ำขนาดเล็กของ AHL อยู่ในบันทึก/การกำซาบหอ (เครื่องมือวอร์เนอร์ แฮม CT) มีสมองที่แสดง GCaMP3.0, Arclight และ SpHอนุญาตให้จ่ายใน 5 นาทีหลังจากชำแหละเพื่อลดการเคลื่อนไหว แล้วก็ตากสมองเหล่านี้ไฟเรืองแสงประมาณ 30 s ก่อนภาพให้เสถียรภาพพื้นฐาน fluorescenceในขณะที่สมองกำลังเซ็นเซอร์ไม่สบายใจค่าย Epac1 หรือ SuperClomeleon ได้เปิดเผยตัวเกิน 5 นาทีเพื่อลดความแตกต่างในอัตรา photobleaching ระหว่าง fluorophores CFP และ YFPดังที่ YFP ได้รับการ photobleach ช้ากว่า CFP (Shafer et al., 2008 Pirez et al.,2013) การก่อกระแสการกำซาบผ่านสมองกับแรงโน้มถ่วงเลี้ยง ValveLink การกำซาบระบบ(ทำวิทยาศาสตร์ เบิร์กลีย์ CA) ATP, CCh สารกาบา หรือ 5HT ถูกส่ง โดยการสลับการกำซาบกระแสจากบรรทัด AHL หลักช่องอื่นที่ประกอบด้วยสารประกอบแตกออกหลังจาก 30 ของพื้นฐานบันทึกในช่วงเวลาที่ต้องตาม ด้วยกระแส AHL การควบคุมผลกระทบของการเปลี่ยนทำ โดยการสลับไปยังอีกบรรทัดหนึ่งประกอบด้วย AHL สำหรับช่อง การทดลองควบคุมยานพาหนะระยะเวลาเดียวกันเป็นการทดลองทดลองทำภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์การ fluorescence Olympus BX51WI (โอลิมปัส ศูนย์วัลเลย์ PA) ภายใต้การแช่น้ำของที่โอลิมปัส x 40 (0.80W, LUMPlanFl) หรือ x 60 (0.90W, LUMPlanFI)วัตถุประสงค์ และบันทึกทั้งหมดถูกจับใช้กล้องอุปกรณ์จุ–ค่าธรรมเนียม (ORCA ฮามามัตสึ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การถ่ายภาพเรืองแสงทำงาน
ผู้ใหญ่เลือดเหมือนน้ำเกลือ (อาห์) ซึ่งประกอบด้วย (ในมิลลิ) 108 NaCl 5 KCl 2 CaCl2 8.2 MgCl2 4 NaHCO3,
1 NaH2PO4-H2O 5 ทรีฮาโล 10 ซูโครส 5 HEPES; พีเอช 7.5 (วัง 2003) ถูกใช้ในการอาบน้ำ
สมองตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (วัง 2003. ชาง et al, 2011) สำหรับการทดลอง SuperClomeleon,
พีเอชอาห์เพิ่มขึ้นเป็น 7.7 เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการตอบสนองขนาด ทดสอบสาร adenosine
triphosphate 5'-เกลือแมกนีเซียม (เอทีพี) คลอไรด์ carbamoylcholine (CCH) picrotoxin (PTX) และ
กรดγ-aminobutyric (GABA) ที่ซื้อมาจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์, มิสซูรี่), ไฮโดรคลอไร serotonin
(5HT) ซื้อมาจาก Tocris ชีววิทยาศาสตร์ (มินนิอาโปลิส) และ tetrodotoxin (TTX) ถูกซื้อ
จาก Abcam ชีวเคมี (เคมบริดจ์อังกฤษ) เอทีพี CCH และ TTX ถูกกลืนหายไปใน milliQ
น้ำและแช่แข็งเป็นหุ้น aliquot ซึ่งได้จัดทำแล้วสำหรับการทดลองโดยการลดสัดส่วนในอาห์.
PTX กำลังละลายและแช่แข็งใน aliquots DMSO ซึ่งถูกเจือจางในอาห์สำหรับการทดลอง การแก้ปัญหาทั้งหมด
ที่ใช้ในการทดลองกับ PTX ได้จัดทำขึ้นมีเปอร์เซ็นต์เดียวกันของ DMSO กาบาและ
5HT ละลายโดยตรงในอาห์ทันทีก่อนที่จะทดลองและ 5HT ถูกเก็บไว้ใน lightshielded
ภาชนะบรรจุเพื่อป้องกันไม่ให้การย่อยสลาย.
การทดลองถ่ายภาพถูกดำเนินการโดยใช้การเตรียมสมองเปล่า แมลงวันถูกอสัญญีบน
น้ำแข็งและสมองถูกชำแหละออกเป็นเย็นอาห์ สมองชำแหละแล้วถูกตรึงอยู่กับชั้นของ Sylgard
(Dow Corning ประเทศ, MI) ซิลิโคนอยู่ภายใต้การอาบน้ำเล็ก ๆ ของอาห์ที่อยู่ในบันทึก / ปะ
ห้อง (วอร์เนอร์ Instruments, แฮมเดน, CT) สมองแสดง GCaMP3.0, Arclight และ SPH ถูก
รับอนุญาตให้ตั้งเป็นเวลา 5 นาทีหลังจากผ่าเพื่อลดการเคลื่อนไหว สมองเหล่านี้ได้สัมผัสแล้ว
ไฟเรืองแสงประมาณ 30 วินาทีก่อนที่จะถ่ายภาพเพื่อให้สามารถรักษาเสถียรภาพเรืองแสงพื้นฐาน
ในขณะที่สมองแสดงเซ็นเซอร์ฉลุ Epac1 ค่ายหรือ SuperClomeleon ได้สัมผัส
พิเศษ 5 นาทีเพื่อลดความแตกต่างในอัตรา photobleaching ระหว่าง CFP และ YFP fluorophores ,
เป็น YFP ได้รับการอธิบายเพื่อ photobleach ช้ากว่า CFP (เช et al, 2008;.. Pirez, et al,
2013) การไหลเวียนของเลือดไปเลี้ยงได้รับการก่อตั้งมานานกว่าสมองที่มีแรงโน้มถ่วงที่เลี้ยงระบบปะ ValveLink
(อัตโนมัติวิทยาศาสตร์เบิร์กลีย์) เอทีพี CCH, GABA หรือ 5HT ที่ถูกส่งมาโดยการเปลี่ยนปะ
ไหลจากสายหลักที่จะอาห์อีกช่องทางหนึ่งที่มีสารเจือจางหลังจาก 30 ของพื้นฐาน
การบันทึกสำหรับระยะเวลาที่ต้องการตามด้วยผลตอบแทนให้กับการไหลของอาห์ ในการควบคุมผลกระทบของการเปลี่ยน
ช่องทดลองการควบคุมรถได้ดำเนินการโดยการเปลี่ยนไปใช้สายอื่นที่มีอาห์สำหรับ
ระยะเวลาเดียวกับการทดลองการทดลอง.
การถ่ายภาพได้รับการดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง Olympus BX51WI (โอลิมปัศูนย์
วัลเลย์, PA) ภายใต้ โอลิมปั x40 (0.80W, LUMPlanFl) หรือ x60 (0.90W, LUMPlanFI) น้ำแช่
วัตถุประสงค์และการบันทึกทั้งหมดถูกจับโดยใช้กล้องของอุปกรณ์ชาร์จคู่ (Hamamatsu ORCA

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การทำงานการการถ่ายภาพ
ผู้ใหญ่สามารถชอบเกลือ ( AHL ) ประกอบด้วย ( มม. ) 108 เกลือ , 5 . 2 ชุด , CaCl2 , 8.2 , โซเดี่ยม nah2po4-h2o
1 , 4 , 5 การ 10 น้ำตาลซูโครส 5 ฮีเปส ; pH 7.5 ( วัง , 2003 ) คืออาบน้ำ
สมอง ( ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ วัง , 2003 ; Shang et al . , 2011 ) สำหรับ superclomeleon การทดลอง
อาห์ pH เพิ่มขึ้นเป็น 7.7 เพื่อปรับขนาดการตอบสนองทดสอบสารอะดีโนซีนไตรฟอสเฟต เกลือแมกนีเซียม
5 ’ - ( ATP ) carbamoylcholine คลอไรด์ ( CCH ) พิโครท็ ซิน ( อีก ) แล้ว
γอะมิโนบูทิริกแอซิด ( GABA ) ซื้อจาก Sigma –ดิช ( เซนต์หลุยส์ โม ) , serotonin และ
( สามารถ ) ซื้อมาจาก tocris BIOSCIENCE ( Minneapolis , MN ) เตโตรโดท็อกซิน ( ทีทีเ กซ์ ) และซื้อ
จาก ABCAM อัลลิซิน ( เคมบริดจ์ ประเทศอังกฤษ ) เอทีพี CCH , ,ทีทีเ กซ์และละลายในน้ำ milliq
และแช่แข็งเป็นส่วนลงตัวหุ้น ซึ่งก็เตรียมไว้สำหรับการทดลองโดยการเจือจางในอาห์ .
อีกถูกยุบและแช่แข็งใน DMSO เฉยๆ ซึ่งเจือจางในอาห์สำหรับการทดลอง โซลูชั่นทั้งหมดที่ใช้ในการทดลองกับอีก
เตรียมกับร้อยละเดียวกันของ DMSO . GABA และสามารถละลายได้โดยตรงใน
อาห์ทันทีก่อนการทดลองและ สามารถเก็บไว้ในภาชนะเพื่อป้องกันการย่อยสลาย lightshielded
.
ภาพทดลองโดยใช้การเตรียมสมองเปลือย บินถูกวางยาสลบใน
น้ำแข็ง และสมองที่ถูกตัดลงในเย็นอาห์ . ผ่าสมองแล้วกดไปยังชั้นของของต้น
( Dow Corning , ภาคกลาง , MI ) ซิลิโคนใต้อ่างขนาดเล็กของอาห์ที่มีอยู่ภายในบันทึก /
( ห้องสูง เครื่องมือ วอร์เนอร์แฮม , CT ) แสดง gcamp3.0 arclight สมอง , และเวลาถูก
อนุญาตให้ตั้งถิ่นฐานเป็นเวลา 5 นาทีหลังการผ่าตัดเพื่อลดการเคลื่อนไหว สมองพวกนี้แล้วตาก
แสง fluorescent ประมาณ 30 วินาทีก่อนการถ่ายภาพเพื่อให้พื้นฐานการเสถียรภาพ
ในขณะที่สมองแสดงกังวลเซ็นเซอร์ epac1 แคมป์ หรือ superclomeleon ได้รับการ
พิเศษ 5 นาที เพื่อลดความแตกต่างในราคาระหว่าง photobleaching CFP และ yfp fluorophores
เป็น yfp , ได้รับการอธิบายเพื่อ photobleach ช้ากว่า CFP ( Shafer et al . , 2008 ; pirez et al . ,
2013 ) ผ่านการก่อตั้งกว่าสมองกับแรงโน้มถ่วงสูง เลี้ยง valvelink
( อัตโนมัติระบบทางวิทยาศาสตร์ , Berkeley , CA ) เอทีพี CCH GABA , , , หรือ สามารถถูกส่งโดยการเปลี่ยนผ่าน
ไหลจากเส้นอาห์หลักช่องอื่น ซึ่งหลังจาก 30 ของสารประกอบพื้นฐาน
บันทึกระยะเวลาที่ต้องการตามด้วย กลับไปออลไหล ควบคุมผลของการสลับ
ช่อง ควบคุมรถทดลองกระทำโดยสลับไปอีกสายที่มีอาห์สำหรับระยะเวลาเช่นเดียวกับการทดลอง
.
ภาพแสดงการใช้กล้องจุลทรรศน์โอลิมปัส ( Olympus bx51wi ศูนย์
Valley , PA ) ภายใต้โอลิมปัส x40 ( 0.80w lumplanfl x60 ( , ) หรือ 0.90w แช่น้ำ , มี lumplanfi )
, และบันทึกทั้งหมดถูกจับโดยใช้ประจุคู่อุปกรณ์กล้อง ( Hamamatsu ปลาวาฬ