2.3. DNA extraction, PCR and electr

2.3. DNA extraction, PCR and electrophoresis
For molecular and chemical analyses, only the rice plants
grown in 2010 spring were used. The genomic DNA was extracted
from leaf samples (0.1 g) of the tested rice mutants using
a genomic DNA purification kit (Promega, USA) according to the
manufacturer’s instructions. DNA concentrations were determined
by measuring the absorbance of diluted DNA solution at 260 nm.
The extracted DNA samples were refrigerated at
20 C for further
PCR analyses.
To analyze the Ra gene expression, DNA was amplified by PCR
using 1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA). A CAPS marker within
the exon 7 of the Ra gene, Ra(CAPS)BamHI, was designed according
to the genomic sequences with a forward primer CAPSRaF 50-
CGTCCATTCACAGGGTA-30, and a reverse primer CAPSRaR 50-CAGCAGATGAGGCAAACT-
30. PCRs were performed in 20 ml volumes
containing approximately 100 ng genomic DNA following the
procedures detailed by Wang and Shu (2007). Similar PCR procedures
were also used for analyzing the Rc gene expression, but with
a forward primer RID12-F (50-TACAGGGGAGCAGAAACACC-30) and
a reverse primer RID12-R (50-AAAGGTACCAAAGATCGCAGAA-30)
(Sweeney et al., 2006). The PCR products (7 ml) were run on a 1.5%agarose gel with 50 mg ml
1 Safe View DNA staining (GeneMark,
Hopegen Biotechnology Development Enterprise, Taiwan, ROC).
To analyze the expression of the Rd gene, the following cycling
parameters were utilized for amplification: 1 cycle of 3 min at 94 C,
35 cycles of 45 s at 94 C/45 s at 55 C/1 min at 72 C, and 1 cycle of
3 min at 72 C. Amplification of Rd alleles was carried out by using
a forward primer AB003495-1F (50-CCATCACCAAGTGCAAGGTA-30)
and a reverse primer AB003495-1R (50-AGTCGTCGTGGTCGTAGGAG-
30) (Konishi et al., 2008). DNA sequencing was performed on
an ABI 373 automated sequencer according to the manufacturer’s
instruction (Applied Biosystems, Inc., USA) with the Dye Terminator
Cycle Sequence Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Co., USA). The Rd
sequence of a naturally-mutated red rice variety Murasaki-ine was
used to serve as a comparative reference.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. DNA สกัด PCR และ electrophoresisสำหรับโมเลกุล และเคมีวิเคราะห์ พืชข้าวเท่านั้นปลูกในฤดูใบไม้ผลิ 2010 ใช้ มีสกัดดีเอ็นเอ genomicจากตัวอย่างใบไม้ (0.1 g) ของสายพันธุ์ข้าวที่ผ่านการทดสอบโดยใช้genomic DNA ฟอกชุด (Promega สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต มีกำหนดความเข้มข้นของดีเอ็นเอโดยการวัด absorbance ของโซลูชั่นดีเอ็นเอแตกออกที่ 260 nmตัวอย่างดีเอ็นเอที่แยกได้รเออร์ที่ 20 C สำหรับเพิ่มเติมPCR วิเคราะห์การวิเคราะห์ยีนของ Ra ดีเอ็นเอถูกขยาย ด้วย PCRใช้ 1000 ร้อน Cycler (Bio Rad สหรัฐอเมริกา) เครื่องหมายหมวกภายในexon 7 ของยีน Ra, Ra (หมวก) BamHI ถูกออกแบบตามการลำดับ genomic กับพื้นไปข้างหน้า CAPSRaF 50-CGTCCATTCACAGGGTA-30 และพื้นกลับ CAPSRaR 50-CAGCAGATGAGGCAAACT -30. PCRs ดำเนินในปริมาณ 20 mlประกอบด้วยประมาณ 100 ng genomic DNA ต่อไปนี้ขั้นตอนรายละเอียดทางวังชู (2007) PCR ขั้นตอนที่คล้ายกันนอกจากนี้ยังใช้ สำหรับการวิเคราะห์ยีน Rc แต่ด้วยรองพื้นไปข้างหน้า RID12-F (50-TACAGGGGAGCAGAAACACC-30) และรองพื้นกลับ RID12-R (50-AAAGGTACCAAAGATCGCAGAA-30)(Sweeney และ al., 2006) ผลิตภัณฑ์ PCR (7 ml) ถูกเรียกใช้บนเจ 1.5%agarose กับ 50 มิลลิกรัมมล. 1 ดีเอ็นเอดูปลอดภัยย้อมสี (GeneMarkHopegen เทคโนโลยีชีวภาพพัฒนาองค์กร ไต้หวัน ROC)การวิเคราะห์ค่าของยีนถนน การขี่จักรยานต่อไปนี้พารามิเตอร์ที่ใช้สำหรับขยาย: 1 รอบ 3 นาทีที่ 94 Cรอบ 35 ของ 45 s ที่ 94 C/45 s ที่ 55 C/1 นาทีที่ 72 C และ 1 รอบของ3 นาทีที่ 72 ขยายถนน C. alleles ที่ดำเนินการโดยรองพื้นไปข้างหน้า AB003495-1F (50-CCATCACCAAGTGCAAGGTA-30)และพื้นกลับ AB003495-1R (50 - AGTCGTCGTGGTCGTAGGAG-30) (Konishi et al., 2008) ทำตามลำดับดีเอ็นเอsequencer ที่ 373 ABI อัตโนมัติตามของผู้ผลิตคำแนะนำ (ประยุกต์ Biosystems, Inc., USA) มีเทอร์มิเนเตอร์ย้อมวงจรลำดับปฏิกิริยาพร้อมชุด (บริษัทเอลเมอเพอร์ สหรัฐอเมริกา) ถนนมีลำดับของข้าวแดงธรรมชาติกลายมุ ineใช้เป็นการอ้างอิงเปรียบเทียบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 การสกัดดีเอ็นเอ PCR และอิเล็ก
สำหรับการวิเคราะห์โมเลกุลและสารเคมีเพียงต้นข้าว
ที่ปลูกในฤดูใบไม้ผลิ 2010 ถูกนำมาใช้ ดีเอ็นเอเป็นสารสกัด
จากตัวอย่างใบ (0.1 กรัม) ของการกลายพันธุ์ข้าวที่ผ่านการทดสอบโดยใช้
ชุดฟอกดีเอ็นเอ (Promega, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ตาม
คำแนะนำของผู้ผลิต ความเข้มข้นของดีเอ็นเอถูกกำหนด
โดยการวัดการดูดกลืนแสงของสารละลายเจือจางดีเอ็นเอที่ 260 นาโนเมตร.
ตัวอย่างดีเอ็นเอถูกตู้เย็นที่สกัด? 20? C เป็นเวลาเพิ่มเติม
PCR วิเคราะห์.
เพื่อวิเคราะห์การแสดงออกของยีน Ra ดีเอ็นเอขยายโดยวิธี PCR
โดยใช้ 1000? ความร้อน Cycler (Bio-Rad, ประเทศสหรัฐอเมริกา) เครื่องหมาย CAPS ภายใน
เอกซ์ซอน 7 ของยีนรารา (CAPS) BamHI ได้รับการออกแบบตาม
การลำดับจีโนมที่มีไพรเมอร์ไปข้างหน้า CAPSRaF 50
CGTCCATTCACAGGGTA-30 และไพรเมอร์กลับ CAPSRaR 50 CAGCAGATGAGGCAAACT-
30 PCRs ได้ดำเนินการในปริมาณ 20 มล.
ที่มีประมาณ 100 ศึกษาดีเอ็นเอดังต่อไปนี้
ขั้นตอนรายละเอียดโดยวังและเอส (2007) ขั้นตอนวิธี PCR ที่คล้ายกัน
นอกจากนี้ยังถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน Rc แต่ด้วย
ไพรเมอร์ไปข้างหน้า RID12-F (50 TACAGGGGAGCAGAAACACC-30) และ
ไพรเมอร์กลับ RID12-R (50 AAAGGTACCAAAGATCGCAGAA-30)
(สวีนีย์ et al., 2006) . ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ (7 มล.) ได้รับการทำงานในเจล agarose 1.5% มี 50 มกมล 1 ปลอดภัยดูการย้อมสีดีเอ็นเอ (GeneMark,
Hopegen เทคโนโลยีชีวภาพพัฒนาวิสาหกิจ, ไต้หวัน, ROC).
เพื่อวิเคราะห์การแสดงออกของยีนถ, ขี่จักรยานต่อไปนี้
พารามิเตอร์ถูกนำมาใช้สำหรับการขยาย: 1 รอบ 3 นาทีที่ 94 C,?
35 รอบ 45 s ที่ 94 C / 45 S ที่ 55 C / 1 นาทีที่ 72 C และ 1 รอบของ?
3 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส . การขยายของอัลลีลถได้รับการดำเนินการโดยใช้
ไพรเมอร์ AB003495-1F ไปข้างหน้า (50 CCATCACCAAGTGCAAGGTA-30)
และไพรเมอร์กลับ AB003495-1R (50 AGTCGTCGTGGTCGTAGGAG-
30) (Konishi et al., 2008) ลำดับดีเอ็นเอที่ได้ดำเนินการใน
ABI 373 ซีเควนโดยอัตโนมัติตามที่ผู้ผลิตของ
การเรียนการสอน (Applied Biosystems, Inc, USA) กับ Terminator ย้อม
วงจรลำดับพร้อมปฏิกิริยา Kit (Perkin Elmer Co. , USA) ถ
ลำดับของข้าวแดงธรรมชาติกลายพันธุ์หลากหลายมูราซากิ-ครับถูก
นำมาใช้เพื่อใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงในการเปรียบเทียบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การสกัด DNA PCR และ electrophoresis
การวิเคราะห์โมเลกุลเคมี และเฉพาะข้าวพืช
โตในฤดูใบไม้ผลิ 2010 มาใช้ ดีเอ็นเอจีโนมสกัด
จากตัวอย่างใบ ( 0.1 กรัม ) ของข้าวสายพันธุ์ที่ใช้ทดสอบการดีเอ็นเอบริสุทธิ์ Kit ( promega , USA )
ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความเข้มข้นสารละลาย
ดีเอ็นเอโดยวัดค่าการดูดกลืนแสงของสารละลายที่เจือจางดีเอ็นเอ 260 nm .
สกัดดีเอ็นเอจำนวนบริษัทที่
20  C สำหรับการวิเคราะห์ PCR ต่อไป
.
วิเคราะห์การแสดงออกของยีน ดีเอ็นเอ รา , ขยายโดยวิธี PCR โดยใช้  Thermal cycler 1
( สหรัฐอเมริกาไบแรด ) เป็นหมวกเครื่องหมายภายใน 8
7 แห่ง รา ยีน รา ( หมวก ) BamHI ออกแบบตามลำดับจีโนม
ต่อด้วยรองพื้น capsraf ส่งต่อ 50 -
cgtccattcacagggta-30 และย้อนกลับ ไพรเมอร์ capsrar 50-cagcagatgaggcaaact -
30 pcrs จำนวน 20 เล่ม มล.
ที่มีประมาณ 100 ของ genomic DNA ต่อไปนี้
ขั้นตอนรายละเอียดโดยหวังชู ( 2007 ) คล้ายกระบวนการ PCR
ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนใน RC แต่ด้วยการรองพื้น rid12-f ไปข้างหน้า (
50-tacaggggagcagaaacacc-30 ) และรองพื้นแบบ rid12-r ( 50-aaaggtaccaaagatcgcagaa-30 )
( Sweeney et al . , 2006 ) ผลิตภัณฑ์ PCR ( 7 มล. ) ใช้เจล หรือ 1.5% กับ 50 มิลลิกรัม ml
1 ปลอดภัยดู DNA คราบ ( genemark
hopegen การพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ , องค์กร , ไต้หวัน , ROC ) .
วิเคราะห์การแสดงออกของยีน Rd , ต่อไปนี้จักรยาน
พารามิเตอร์ถูกใช้สำหรับเด็ก : 1 รอบ 3 นาที ที่ 94 
C35 รอบ 45 S ที่ 94  C / 45 S 55  C / 1 นาทีที่ 72  C และ 1 รอบ
3 นาทีที่ 72  C แบบ 1 อัลลีลโดยใช้ไพรเมอร์ : ab003495-1f ไปข้างหน้าและย้อนกลับ 50-ccatcaccaagtgcaaggta-30 )
รองพื้น ab003495-1r ( 50-agtcgtcgtggtcgtaggag -
30 ) ( Konishi et al . , 2008 ) การจัดลำดับดีเอ็นเอคือใช้
เป็น ABI 373 มูลค่าตามของผู้ผลิต
การสอน ( Applied Biosystems , Inc . , USA ) กับสี Terminator
วงจรปฏิกิริยา ( เพอร์กินเอลเมอร์ลำดับพร้อมชุด Co . , USA ) RD
ลำดับตามธรรมชาติที่กลายพันธุ์แดงข้าวพันธุ์มุราซากิ ine คือ
ใช้เป็นอ้างอิงเปรียบเทียบ