ProcedureDesign Primers:These prime

Procedure

Design Primers:
These primers are like bridges between the two parts you want to assemble together.
You will order two primers which are complements of one another.
These primers will each have a 60°C Tm with one part and a 60°C Tm with the other part.
The "end primers" will not have any complements and will likely only have restriction sites.
"Extension PCR" PCR amplify the necessary fragments separately
Use a proofreading polymerase enzyme.
Use an annealing temp of 60°C.
Clean up the product using a DNA column.
"Overlap PCR" Use cleaned up fragments as template in a PCR reaction:
About 1/2 to 3/4 volume of the Overlap PCR reaction should be equimolar amounts of purified fragments.
Do not use Phusion polymerase. Try Pfu Turbo.
Do not add any primers; the templates will prime each-other.
Run 15 PCR cycles without primers.
Use an annealing temp of 60°C.
"Purification PCR" Add end primers to the Overlap PCR reaction:
Continue cycling for another 15-20 rounds.
Use an annealing temp of 72°C
Gel extract the correct size fragment.
Clone into the desired vector.
Digest
Ligate
Transform
Select
Sequence

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ไพรเมอร์ขั้นตอนการออกแบบ

.
. ไพรเมอร์เหล่านี้เป็นเหมือนสะพานระหว่างสองส่วนที่คุณต้องการที่จะประกอบเข้าด้วยกัน
คุณจะสั่งซื้อสองไพรเมอร์ที่เติมเต็มของอีกคนหนึ่ง
ไพรเมอร์เหล่านี้จะแต่ละคนมีค TM 60 °ด้วยส่วนหนึ่งและ ค TM 60 °กับส่วนอื่น ๆ .
"ไพรเมอร์จบ" จะไม่ต้องเสริมใด ๆ และมีแนวโน้มที่จะมีเพียงเว็บไซต์ จำกัด .
"ขยาย pcr" pcr ขยายชิ้นส่วนที่จำเป็นแยก
ใช้เอนไซม์พิสูจน์อักษรโพลิเมอร์.
ใช้อุณหภูมิการหลอม 60 ° c.
ทำความสะอาดผลิตภัณฑ์โดยใช้คอลัมน์ dna.
"pcr ทับซ้อน" การใช้ทำความสะอาดเศษเป็นแม่แบบใน pcr ปฏิกิริยา:
ประมาณ 1/2 ถึง 3/4 ของปริมาณการเกิดปฏิกิริยา pcr ทับซ้อนควรจะเป็นจำนวนเงินที่ equimolar เศษบริสุทธิ์
ไม่ได้ใช้ Phusion โพลิเมอร์. ลอง pfu เทอร์โบ.
.. ไม่เพิ่มไพรเมอร์ใด ๆ แม่จะสำคัญแต่ละอื่น ๆ
วิ่ง 15 รอบ PCR โดยใช้ไพรเมอร์
อุณหภูมิการหลอม 60 ° c
"บริสุทธิ์ pcr" เพิ่มไพรเมอร์จบปฏิกิริยาทับซ้อน pcr:
ต่อการขี่จักรยานเพื่อ. 15-20 อีกรอบ.
ใช้อุณหภูมิการหลอมจาก 72 ° c
เจลสารสกัดจากส่วนขนาดที่ถูกต้อง.
โคลนลงในเวกเตอร์ที่ต้องการ.

ย่อยมัด

เลือกเปลี่ยน
ลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขั้นตอน

ออกแบบไพรเมอร์:
ไพรเมอร์เหล่านี้เป็นเหมือนสะพานระหว่างสองส่วนต้องประกอบกัน
คุณจะสั่งสองไพรเมอร์ที่เติมเต็มกัน
ไพรเมอร์เหล่านี้จะได้เป็น 60° C Tm ด้วยส่วนหนึ่งและ 60° C Tm กับ part.อื่น ๆ
"จบไพรเมอร์" จะไม่มีการเติมเต็มใด ๆ และจะมีแนวโน้มจะจำกัดไซต์
"ขยาย PCR" PCR ขยายชิ้นส่วนจำเป็นต่างหาก
การการ proofreading พอลิเมอเรสเอนไซม์
ใช้อุณหภูมิการหลอมของ 60 ° C.
ทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ที่ใช้คอลัมน์ดีเอ็นเอ
"เหลื่อม PCR" ใช้ล้างในชิ้นส่วนเป็นต้นแบบในปฏิกิริยา PCR:
เกี่ยวกับปริมาณ 1/2 3/4 ของ PCR ซ้อน ปฏิกิริยาควรจะ equimolar เงินบริสุทธิ์บางส่วนของการ
ใช้ Phusion พอลิเมอเรส ลอง Pfu Turbo
เพิ่มไพรเมอร์ใด ๆ แบบจะนายกแต่ละอื่น ๆ .
ทำ PCR 15 รอบ โดยไพรเมอร์
ใช้อุณหภูมิการหลอมของ 60 ° C.
ไพรเมอร์จบ "ฟอก PCR" เพิ่มการปฏิกิริยา PCR ที่ทับซ้อน:
Continue ขี่ในอีก 15-20 รอบ
ใช้อุณหภูมิการหลอมของ 72° C
เจแยกส่วนขนาดที่ถูกต้อง
โคลนเป็นการระบุแบบเวกเตอร์
ย่อย
Ligate
แปลง
เลือก
ลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ขั้นตอนการ ออกแบบ

primers :
เหล่านี้ primers เป็นเหมือนเช่นสะพานระหว่างที่สองส่วนคุณต้องการประกอบด้วยกัน.
คุณจะสั่งซื้อทั้งสอง primers ซึ่งมีช่วยเพิ่มคุณค่าให้กับของอีกอันหนึ่ง.
เหล่านี้ primers จะแต่ละห้องมีที่ 60 ° C TM พร้อมด้วยหนึ่งและเป็นส่วนหนึ่งที่ 60 ° C TM ด้วยอีกส่วนหนึ่ง.
"ปลาย primers "จะไม่มีเฟอร์นิเจอร์และจะมีเพียงการจำกัดสถานที่.
"การขยาย pcr " pcr เพิ่มที่จำเป็นเศษแยกต่างหาก
ใช้ proofreading polymerase เอนไซม์.
ใช้ annealing อุณหภูมิ 60 ° C .
ทำความสะอาด ผลิตภัณฑ์ โดยใช้ดีเอ็นเอคอลัมน์.
"ทับซ้อนกัน pcr "ใช้ทำความสะอาดขึ้นมาเองเป็นเทมเพลตใน pcr ปฏิกริยา:
เกี่ยวกับ 1/2 เพื่อ 3/4 3/4 3/4 ระดับของสองส่วนทับซ้อนกันพอดี pcr ปฏิกริยาควร equimolar จำนวนของบริสุทธิ์เศษ.
ไม่ใช้ phusion polymerase . ลอง pfu Turbo .
ไม่ต้องเพิ่มใดๆ primers ;แม่แบบจะดีเยี่ยมแต่ละครั้งอื่นๆ.
วิ่ง 15 รอบโดยไม่ pcr primers .
ใช้ annealing อุณหภูมิ 60 ° C .
"บริสุทธิ์ pcr "เพิ่มปลาย primers เพื่อเหลื่อมกัน pcr ปฏิกริยา:
ดำเนินการต่อการขี่จักรยานสำหรับอีกรอบ 15-20 15-20 15-20 .
ใช้ annealing อุณหภูมิ ของ 72 ° C
เจลแยกที่ถูกต้องขนาดสักเท่าไหร่.
การถอดแบบข้อมูล( Clone )เข้าไปในที่ต้องการเวกเตอร์.

ไดเจสต์ ligate

ซึ่งจะช่วยปรับเปลี่ยนเลือก
ตามลำดับ