MATERIALS AND METHODSMicroalga, oil

MATERIALS AND METHODS
Microalga, oil, lipases and chemicals Wet paste biomass of the marine
microalga N. gaditana was used as an oil-rich substrate. This biomass was facilitated
by the Estación experimental de Las Palmerillas (Cajamar, El Ejido, Spain). Cells were
grown in an outdoor tubular photobioreactor, centrifuged at 7000 rpm for 10 min,
and then stored at 20
C until use. This wet biomass contained 24.2%  0.7% w/w of
dry biomass and 29.1  0.0 wt% of total lipids on dry biomass. The total fatty acid
content (or saponifiable lipids as equivalent fatty acids) in the biomass was
12.1 0.2 wt% on dry biomass. Free fatty acids (FFAs) from used vegetable oil (UVO)
were also used. This oil was provides by the biodiesel manufacturer company
Albabío (Nijar, Spain). Table 1 shows the fatty acid composition of both oils. The
esterification reaction was catalysed by the lipase Novozym 435 from Candida
antarctica (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark). This lipase is immobilized on a
macroporous acrylic resin and it is positionally non-specific.
Ethanol (96%, analysis quality) and hexane (95% purity, synthesis quality), both
of Panreac (Barcelona, Spain), were used to extract FFAs from the microalga and to
saponify the UVO. HCl (37%, Panreac S.A., Barcelona, Spain), methanol (99.9% purity,
Carlo Erba Reagents, Rodano, Italy), NaOH and KOH (85% purity, J.T. Baker, Deventer,
Holland), all of analytical quality, were also used. All reagents used in the analytical
determinations were also of analytical grade.
Obtaining of FFAs from UVO and microalgal biomass FFAs fromUVO were
obtained by saponification of the oil. The reaction mixture contained 350 mL of oil
and 700 mL of a hydroalcoholic solution of NaOH, which was prepared dissolving
120 g of NaOH in 400 mL of water and 400 mL of ethanol (96% v/v). The saponification
was carried out shaking this mixture at 200 rpm, at 60
C for 30 min. The
mixture was then cooled at room temperature, 140 mL of water were added and the
pH was adjusted to values between 1 and 2 using 37% HCl. FFAs were extracted with
300 mL of hexane, shaking at 200 rpm for 30 min. Finally the hydroalcoholic and
hexane phases were separated by decantation and the hexanic phase was washed
twice with water.
FFAs from the microalga N. gaditana were obtained following a modification of
the three-step procedure developed by Ibáñez González et al. (11) (Fig. 1). 0.50 kg of
wet biomass was treated with 3.63 L of ethanol (96% v/v) (30 mL ethanol (96%)/g dry
biomass), containing 24.2 g of KOH (85% purity) in a 10 L reactor, which was jacketed
for temperature control. Direct saponification was carried out at 60
C for 1 h with
constant stirring at 200 rpm with a propeller stirrer (Eurostar digital, IKA Staufen,
Germany), in argon atmosphere and covered with aluminium foil to protect from
light. The biomass residue was then separated from the hydroalcoholic solution by
filtration using a porous glass plate (pore diameter 100 mm, Pobel, Madrid, Spain).
This biomass residue was washed with 1.4 L of ethanol (96% v/v) (14 mL ethanol
(96%)/g dry biomass), to increase the fatty acid recovery yield and this washing
solution was added to the hydroalcoholic fatty acid solution from the main extraction.
In the following step, water (674 mL) was added to the hydroalcoholic phase to
reach 30% wt in water, to increase the immiscibility of the hydroalcoholic solution
and hexane, and the unsaponifiable contents were extracted with 4.30 L hexane
(hexane/hydroalcoholic solution ratio 1:1 v/v). This extraction was carried out stirring
at 200 rpm for 10 min. Subsequently, the solutionwas decanted for 30 min. The
unsaponifiable hexanic solution was removed, leaving the lower hydroalcoholic
phase in the extractor. Next, concentrated HCl was added to the hydroalcoholic
phase to pH 5, to form the FFAs. These FFAs were extracted with hexane (4.3 L), and
the mixture was stirred at 200 rpm for 10 min. It was then allowed to decant for
30 min and two phases were obtained, a bottom one that was discarded and the
upper hexanic phase containing the FFAs. This FFA solution was evaporated in a
rotary evaporator (Buchi, R210, with vacuum pumpV-700 and controller V-850,
Switzerland) to remove and recover the solvent and the FFAs.
Esterification of FFAs catalysed by lipase Novozym 435 In this reaction
FFAs react with methanol to produce methyl esters (biodiesel) and water in the
presence of the lipase Novozym 435 which acts as catalyst. Experiments were carried
out with 4 g of FFAs, 0.86 mL of methanol (methanol/FFA molar ratio 1.5:1) and
different Novozym 435/FFA ratios. The esterification reaction was carried out in
50 mL Erlenmeyer flasks with silicone-capped stoppers. In a typical experiment the
mixture was incubated at 40
C and stirred in an orbital shaking air-bath (Inkubator
1000, Unimax 1010 Heidolph, Klein, Germany) at 200 rpm for 24 h. The reactions
were stopped by separation of Novozym 435 by filtration. The final reaction mixture
was conserved at 4
C until analysis. Experiments were carried out modifying the
following variables: reaction time, temperature, stirring velocity, methanol/FFA
molar ratio and Novozym 435 amount. All reactions and their corresponding analyses
were carried out in duplicate, and each value recorded is therefore the arithmetic
mean of four experimental data (data shown as mean value  standard
deviation).
Analysis of reaction products The identification of the reaction products
(FFAs, methyl esters and to lesser extent acylglycerols) was carried out by thin layer
chromatography (TLC), followed by gas chromatography (GC), to determine quantitatively
the species present. The fatty acid profile of the oilswas also determined by
GC. TLC was carried out on plates of silica-gel (Precoated TLC plates, SIL G-25;
MachereyeNagel, SigmaeAldrich), activated by heating at 105
C for 30 min. The
samples were spotted directly on the plate by adding 0.2 mL of reaction product
mixture. The mobile phase used was chloroform/acetone/methanol (95:4.5:0.5 v/v/
v). Spots of each lipid were visualized by spraying the plate with iodine vapour in a
nitrogen steam. The position of the spot corresponding to each lipidic species is
characterized by the response factor. Each lipid type was scraped from the plates and
methylated according to the method of Rodriguez-Ruiz et al. (12). Fatty acid methyl
esters were analysed by GC with an Agilent Technology 6890 gas chromatograph
(Avondale, PA, USA) using a capillary column of fused silica OmegawaxTM
(0.25 mm  30 mm, 0.25 mm standard film, Supelco, Bellefonte, PA, USA), and a
FID (flame-ionization detector). Nitrogen was the carrier gas. Nonadecanoic acid
(19:0) (SigmaeAldrich) was used as internal standard for quantitative
determination of fatty acids. Matreya (Pleasant Gap, PA, USA) n-3 PUFAs
(polyunsaturated fatty acids) standard (catalogue number 1177) was used for the
quantitative determination of fatty acids.
The esterification degree (ED) represents the percentage of initial FFAs
consumed by methylation. ED was determined by acid-base titration after checking
that the results were similar to those obtained by TLC and GC, which take longer. The
samples were diluted with acetone (ratio 1:1 v/v) and phenolphthalein was used as
indicator. The samples from esterification of microalgal FFAs were washed with
alumina, diluted with acetone (fatty acid/acetone ratio 1:20 v/v) and titrated, using
thymol blue as indicator. Previously the acidity of the initial reaction mixture had
been determined under the same conditions in which the acidity was measured,
once the reaction had finished. ED was calculated by the equation:
where V0 and V are the volumes of 1 or 0.1 N NaOH solution used in the titration of
the initial mixture and esterification product, respectively. To determine the purity
of the FFAs and methyl ester from the FFA microalgal extract and esterification reaction
products, respectively, a sample of known weight was analysed by GC. Purity
(wt%) was determined as the ratio between the methyl ester weight obtained by GC
and the sample weight.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการMicroalga น้ำมัน lipases และเคมีเปียกวางชีวมวลของทางทะเลmicroalga gaditana ตอนเหนือถูกใช้เป็นพื้นผิวอุดมไปด้วยน้ำมัน ชีวมวลนี้ได้อำนวยความสะดวกโดยเดทดลอง Estación ลา Palmerillas (Cajamar เอ Ejido สเปน) เซลล์ได้ปลูก photobioreactor ท่อกลางแจ้ง centrifuged ที่ 7000 rpm สำหรับ 10 นาทีแล้ว เก็บไว้ที่ 20 C จนถึงใช้ ชีวมวลนี้เปียกอยู่ 24.2% 0.7% w/w ของชีวมวลที่แห้งและ wt 29.1 0.0% ของโครงการทั้งหมดในชีวมวลที่แห้ง กรดไขมันทั้งหมดเนื้อหา (หรือโครงการ saponifiable เป็นเทียบเท่ากรดไขมัน) ในชีวมวล12.1 0.2 wt %ในชีวมวลที่แห้ง ฟรีกรดไขมัน (FFAs) จากน้ำมันพืชใช้ (UVO)นอกจากนี้ยังใช้ น้ำมันนี้ถูกแสดง โดยบริษัทผู้ผลิตไบโอดีเซลAlbabío (Nijar สเปน) ตารางที่ 1 แสดงองค์ประกอบกรดไขมันของน้ำมันทั้งสอง ที่ปฏิกิริยา esterification เป็น catalysed โดยเอนไซม์ไลเปส Novozym 435 จากโรคทวีปแอนตาร์กติกา (a/s Novozymes, Bagsvaerd เดนมาร์ก) เอนไซม์ไลเปสนี้ถูกตรึงบนตัวmacroporous resin อะครีลิคและเป็น positionally ไม่ใช่เฉพาะเอทานอล (96% วิเคราะห์คุณภาพ) และเฮกเซน (บริสุทธิ์ 95% คุณภาพสังเคราะห์), ทั้งสองของ Panreac (บาร์เซโลนา สเปน), ใช้คว้าน FFAs จากการ microalga และการsaponify UVO HCl (37%, Panreac S.A. บาร์เซโลนา สเปน), เมทานอล (ความบริสุทธิ์ 99.9%Carlo Erba Reagents, Rodano อิตาลี), NaOH และเกาะ (85% ความบริสุทธิ์ J.T. เบเกอร์ Deventerฮอลแลนด์), วิเคราะห์คุณภาพ ทั้งหมดยังใช้ Reagents ทั้งหมดที่ใช้ในการวิเคราะห์ทางdeterminations ยังมีเกรดวิเคราะห์รับของ FFAs จากชีวมวล UVO และ microalgal FFAs ถูก fromUVOได้ โดยสะพอนิฟิของน้ำมัน 350 มล.น้ำมันประกอบด้วยส่วนผสมของปฏิกิริยาและ 700 mL ของโซลูชัน hydroalcoholic ของ NaOH ซึ่งถูกเตรียมยุบ120 g ของ NaOH ใน 400 mL น้ำ และ 400 mL ของเอทานอล (96% v/v) การสะพอนิฟิทำออกมาเขย่าส่วนผสมนี้ที่ 200 rpm ที่ 60 C ใน 30 นาทีส่วนผสมได้แล้วระบายความร้อนด้วยอุณหภูมิห้อง 140 mL น้ำเพิ่มและปรับ pH มีค่าระหว่าง 1 และ 2 ใช้ 37% HCl FFAs ถูกสกัดด้วย300 mL ของเฮกเซน เขย่าที่ 200 รอบต่อนาทีสำหรับ 30 นาที สุดท้าย hydroalcoholic และโพลีเฟสถูกคั่น ด้วย decantation และระยะ hexanic ถูกล้างสองน้ำFFAs จาก gaditana ตอนเหนือ microalga ได้รับการปรับเปลี่ยนต่อไปนี้ขั้นตอนสามขั้นพัฒนาโดย Ibáñez González et al. (11) (Fig. 1) 0.50 กิโลกรัมของชีวมวลเปียกได้รับเอทานอล (96% v/v) 3.63 L (30 mL เอทานอล (96%)/g แห้งชีวมวล), ประกอบด้วย 24.2 g ของเกาะ (ความบริสุทธิ์ 85%) ในเครื่องปฏิกรณ์แบบ 10 L ซึ่งถูก jacketedสำหรับควบคุมอุณหภูมิ สะพอนิฟิโดยตรงได้รับการดำเนินที่ 60 C สำหรับ h 1 กับค่าคงที่ที่ 200 rpm กวน ด้วยช้อนคนใบพัด (ยูโรดิจิตอล IKA Staufenเยอรมนี), ในบรรยากาศอาร์กอน และปกคลุม ด้วยอลูมิเนียมฟอยล์เพื่อป้องกันแสง สารตกค้างชีวมวลแยกออกแล้วจากโซลูชัน hydroalcoholic โดยเครื่องกรองที่ใช้จานแก้ว porous (รูเส้นผ่าศูนย์กลาง 100 mm, Pobel มาดริด สเปน)สารตกค้างนี้ชีวมวลถูกล้าง ด้วยเอทานอล (96% v/v) 1.4 ลิตร (มล 14 เอทานอล(96%)/g แห้งชีวมวล), กรดไขมันเพิ่มขึ้นผลตอบแทนในการกู้คืนและล้างนี้โซลูชันมีเพิ่มเพื่อแก้ปัญหากรดไขมัน hydroalcoholic จากแยกหลักในขั้นตอนต่อไปนี้ เพิ่มน้ำ (674 มล) ระยะ hydroalcoholic เพื่อถึง 30% wt ในน้ำ เพิ่ม immiscibility โซลูชัน hydroalcoholicและเฮกเซน และรายการ unsaponifiable ถูกสกัด ด้วยเฮกเซน 4.30 L(เฮก เซน/hydroalcoholic โซลูชันอัตราส่วน 1:1 v/v) แยกนี้ถูกดำเนินการกวนที่ 200 รอบต่อนาทีใน 10 นาที ในเวลาต่อมา solutionwas decanted ใน 30 นาทีโซลูชั่น hexanic unsaponifiable ถูกลบ hydroalcoholic ล่างออกระยะในการระบาย HCl เข้มข้น หน้าถูกเพิ่ม hydroalcoholicตอนการ pH 5 ฟอร์ม FFAs เหล่านี้ FFAs ถูกสกัด ด้วยเฮกเซน (4.3 L), และมีกวนผสมที่ 200 rpm สำหรับ 10 นาที แล้วจะได้รับอนุญาตให้รินสำหรับ30 นาทีและระยะที่สองได้รับ ล่างที่ถูกละทิ้งและด้านบน hexanic ระยะประกอบด้วย FFAs โซลูชันนี้ FFA ได้หายไปในตัวโรตารี่ evaporator (Buchi, R210 สูญญากา pumpV-700 และควบคุม V-850สวิตเซอร์แลนด์) เพื่อลบ และกู้คืนในตัวทำละลายและ FFAsEsterification FFAs catalysed โดยเอนไซม์ไลเปส Novozym 435 ในปฏิกิริยานี้FFAs ทำปฏิกิริยากับเมทานอลผลิต methyl esters (ไบโอดีเซล) และน้ำในการสถานะของเอนไซม์ไลเปส 435 Novozym ซึ่งเป็นเศษ ได้ดำเนินการทดลองออกกับ 4g ของ FFAs, mL 0.86 ของเมทานอล (เมทานอ ล/FFA อัตราส่วนสบ 1.5:1) และอัตราส่วน 435/FFA ของ Novozym แตกต่างกัน ปฏิกิริยา esterification ถูกดำเนินการในนำ Erlenmeyer 50 mL พร้อมจุกซิลิโคนปรบมือ ในการทดลองทั่วไปส่วนผสม incubated ที่ 40 C และกวนในออร์บิทัลมีสั่น (Inkubator แอร์-ห้องน้ำ1000, Unimax 1010 Heidolph, Klein เยอรมนี) ที่ 200 rpm ใน 24 ชม ปฏิกิริยาที่ได้ถูกหยุด โดยแบ่งแยก Novozym 435 โดยการกรอง ส่วนผสมปฏิกิริยาขั้นสุดท้ายที่อยู่ที่ 4 C จนถึงการวิเคราะห์ ทดลองได้ดำเนินการปรับเปลี่ยนการตัวแปรตาม: เวลาตอบสนอง อุณหภูมิ ความเร็วการกวน เมทานอ ล/FFAอัตราส่วนสบและยอด Novozym 435 ปฏิกิริยาทั้งหมดและการวิเคราะห์ความสอดคล้องกันได้ดำเนินการออกซ้ำ และแต่ละค่าที่บันทึกจึงหมายเลขคณิตค่าเฉลี่ยของข้อมูลทดลอง 4 (ข้อมูลที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ยมาตรฐานความแตกต่าง)วิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยารหัสผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา(FFAs, methyl esters และน้อยกว่าขอบเขต acylglycerols) ที่ดำเนินการ โดยบางชั้นchromatography (TLC), ตาม ด้วยก๊าซ chromatography (GC), กำหนด quantitativelyพันธุ์ที่มี โพรไฟล์กรดไขมันของ oilswas ที่มี กำหนดโดยGC TLC ถูกดำเนินการบนแผ่นซิลิก้าเจล (Precoated TLC แผ่น ภาษาศาสตร์ G-25MachereyeNagel, SigmaeAldrich), เปิดใช้งาน โดยความร้อนที่ 105 C ใน 30 นาทีตัวอย่างถูกด่างบนแผ่นโดยตรง โดยเพิ่ม 0.2 mL ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาส่วนผสมของ ระยะเคลื่อนที่ใช้เป็นคลอโรฟอร์มอะซีโตน/เม (95:4.5:0.5 v/v /v) จุดของแต่ละกระบวนมี visualized โดยพ่นแผ่นด้วยไอของไอโอดีนในการไอน้ำไนโตรเจน ตำแหน่งของจุดตรงกับแต่ละสายพันธุ์ lipidic คือลักษณะ โดยตัวตอบสนอง ไขมันแต่ละชนิดถูกขูดจากแผ่น และmethylated ตามวิธีของร็อดริเกซ-Ruiz et al. (12) กรดไขมัน methylesters ถูก analysed โดย GC กับ chromatograph การแก๊ส Agilent เทคโนโลยี 6890(Avondale, PA สหรัฐอเมริกา) โดยใช้คอลัมน์รูพรุนของซิลิก้า fused OmegawaxTM(0.25 มม. 30 mm, 0.25 mm มาตรฐานฟิล์ม Supelco, Bellefonte, PA สหรัฐอเมริกา), และสลัก (เครื่องตรวจจับเปลวไฟ ionization) ไนโตรเจนเป็นก๊าซผู้ขนส่ง กรด Nonadecanoic(19:0) (SigmaeAldrich) ถูกใช้เป็นมาตรฐานภายในเชิงปริมาณเรื่องของกรดไขมัน PUFAs n-3 Matreya (ดีช่องว่าง PA สหรัฐอเมริกา)(กรดไขมันไม่อิ่มตัว) มาตรฐาน (แคตตาล็อกหมายเลข 1177) ใช้สำหรับการกำหนดปริมาณของกรดไขมันปริญญา esterification (ED) แสดงถึงเปอร์เซ็นต์ของ FFAs เริ่มต้นใช้ โดยปรับ ED ถูกกำหนด โดยการไทเทรตกรด-ฐานหลังจากการตรวจสอบให้ผลได้คล้ายกับผู้รับ โดย TLC และ GC ซึ่งใช้เวลานาน ที่ตัวอย่างที่ผสมกับอะซีโตน (อัตราส่วน 1:1 v/v) และใช้ phenolphthalein เป็นindicator. The samples from esterification of microalgal FFAs were washed withalumina, diluted with acetone (fatty acid/acetone ratio 1:20 v/v) and titrated, usingthymol blue as indicator. Previously the acidity of the initial reaction mixture hadbeen determined under the same conditions in which the acidity was measured,once the reaction had finished. ED was calculated by the equation:where V0 and V are the volumes of 1 or 0.1 N NaOH solution used in the titration ofthe initial mixture and esterification product, respectively. To determine the purityof the FFAs and methyl ester from the FFA microalgal extract and esterification reactionproducts, respectively, a sample of known weight was analysed by GC. Purity(wt%) was determined as the ratio between the methyl ester weight obtained by GCand the sample weight.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการสาหร่ายน้ำมันไลเปสและสารเคมีชีวมวลเปียกวางของทะเลสาหร่ายเอ็นgaditana ถูกใช้เป็นสารตั้งต้นที่อุดมไปด้วยน้ำมัน ชีวมวลนี้ได้รับการอำนวยความสะดวกโดยการทดลองEstaciónเดอลา Palmerillas (Cajamar, El Ejido, สเปน) เซลล์ที่ถูกปลูกใน photobioreactor ท่อน้ำกลางแจ้ง, หมุนเหวี่ยงที่ 7000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีแล้วเก็บไว้ที่20 องศาเซลเซียสจนการใช้งาน นี้เปียกชีวมวลที่มีอยู่ 24.2%? 0.7% w / w การของชีวมวลแห้งและ29.1? 0.0% โดยน้ำหนักของไขมันรวมชีวมวลแห้ง กรดไขมันทั้งหมดเนื้อหา (หรือไขมัน saponifiable เป็นกรดไขมันที่เทียบเท่า) ในชีวมวลเป็น 12.1? 0.2% โดยน้ำหนักแห้งชีวมวล กรดไขมันอิสระ (FFAs) จากน้ำมันพืชใช้แล้ว (UVO) นอกจากนี้ยังถูกนำมาใช้ น้ำมันนี้เป็นให้โดย บริษัทผู้ผลิตไบโอดีเซลAlbabío (Nijar, สเปน) ตารางที่ 1 แสดงองค์ประกอบของกรดไขมันของน้ำมันทั้ง ปฏิกิริยา esterification ถูกตัวเร่งปฏิกิริยาโดยเอนไซม์ไลเปส Novozym 435 จาก Candida แอนตาร์กติกา (Novozymes A / S, Bagsvaerd, เดนมาร์ก) เอนไซม์ไลเปสนี้จะตรึงบนเรซินอะคริลิ macroporous และมันก็เป็น positionally ไม่เฉพาะเจาะจง. เอทานอล (96% คุณภาพการวิเคราะห์) และเฮกเซน (ความบริสุทธิ์ 95%, ที่มีคุณภาพสังเคราะห์) ทั้งของPanreac (บาร์เซโลน่า, สเปน) ถูกนำมาใช้ในการสกัด FFAs จากสาหร่ายและสบู่UVO HCl (37%, Panreac SA, บาร์เซโลนา, สเปน), เมทานอล (ความบริสุทธิ์ 99.9%, คาร์โลเออร์บารีเอเจนต์, Rodano, อิตาลี), NaOH และเกาะ (85% บริสุทธิ์ JT เบเกอร์เวนเตอร์, ฮอลแลนด์) ทั้งหมดที่มีคุณภาพในการวิเคราะห์เป็น นอกจากนี้ยังใช้ สารเคมีที่ใช้ในการวิเคราะห์หาความยังเป็นของเกรดวิเคราะห์. ขอรับใบ FFAs จาก UVO และ FFAs ชีวมวลสาหร่าย fromUVO ถูกที่ได้จากการสะพอน้ำมัน ผสมปฏิกิริยาที่มีอยู่ 350 มิลลิลิตรน้ำมันและ700 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหาของ hydroalcoholic NaOH ซึ่งถูกจัดทำละลาย120 กรัม NaOH ใน 400 มิลลิลิตรของน้ำและ 400 มิลลิลิตรของเอทานอล (96% v / v) สะพอได้ดำเนินการเขย่าผสมนี้ที่ 200 รอบต่อนาทีที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที ส่วนผสมเย็นแล้วที่อุณหภูมิห้อง 140 มิลลิลิตรของน้ำมีการเพิ่มและค่าpH ปรับค่าระหว่าง 1 และ 2 โดยใช้ 37% HCl FFAs ถูกสกัดด้วย300 มลเฮกเซนเขย่าที่ 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาที ในที่สุด hydroalcoholic และขั้นตอนเฮกเซนที่ถูกแยกจากกันโดยdecantation และระยะ hexanic ถูกล้างสองครั้งด้วยน้ำ. FFAs จาก gaditana เอ็นสาหร่ายที่ได้รับการปรับเปลี่ยนต่อไปนี้ของขั้นตอนที่สามขั้นตอนการพัฒนาโดยIbáñezGonzález et al, (11) (รูปที่ 1). 0.50 กิโลกรัมของชีวมวลเปียกรับการรักษาด้วย3.63 L เอทานอล (96% v / v) (เอทานอล 30 มิลลิลิตร (96%) / กรัมแห้งชีวมวล) ที่มี 24.2 กรัมของ KOH (85% บริสุทธิ์) ในเครื่องปฏิกรณ์ L 10 ซึ่ง ได้รับเสื้อสำหรับการควบคุมอุณหภูมิ สะพอโดยตรงได้ดำเนินการที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงกับกวนคงที่ที่200 รอบต่อนาทีกับใบพัดกวน (ยูโรสตาร์ดิจิตอล IKA Staufen, เยอรมนี) ในชั้นบรรยากาศอาร์กอนและปกคลุมด้วยอลูมิเนียมเพื่อป้องกันแสง ที่เหลือชีวมวลถูกแยกออกมาแล้วจากการแก้ปัญหา hydroalcoholic โดยการกรองโดยใช้แผ่นกระจกที่มีรูพรุน(เส้นผ่าศูนย์กลางรูขุมขน 100 มม Pobel, มาดริด, สเปน). ตกค้างชีวมวลนี้ถูกล้างด้วย 1.4 ลิตรเอทานอล (96% v / v) (14 มิลลิลิตร เอทานอล(96%) / g ชีวมวลแห้ง) เพื่อเพิ่มผลผลิตการกู้คืนกรดไขมันและซักผ้านี้แก้ปัญหาที่ถูกเพิ่มลงในสารละลายกรดไขมันhydroalcoholic จากการสกัดหลัก. ในขั้นตอนต่อไปนี้น้ำ (674 มิลลิลิตร) ถูกบันทึกอยู่ใน hydroalcoholic ขั้นตอนที่จะถึง30% โดยน้ำหนักในน้ำเพื่อเพิ่ม immiscibility ของการแก้ปัญหา hydroalcoholic และเฮกเซนและเนื้อหา unsaponifiable ถูกสกัดด้วยเฮกเซน 4.30 L (อัตราส่วนเฮกเซน / แก้ปัญหา hydroalcoholic 1: 1 v / v) สกัดนี้ได้รับการดำเนินการกวน200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที ต่อมา solutionwas decanted เป็นเวลา 30 นาที แก้ปัญหา hexanic unsaponifiable ถูกลบออกออกจาก hydroalcoholic ต่ำกว่าขั้นตอนในการระบาย ถัดไปเข้มข้น HCl ถูกเพิ่มลงใน hydroalcoholic เฟสค่าพีเอช 5 ในรูปแบบ FFAs FFAs เหล่านี้ถูกสกัดด้วยเฮกเซน (4.3 ลิตร) และส่วนผสมที่ถูกกวนที่200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที มันได้รับการอนุญาตแล้วจะค่อยๆรินสำหรับ30 นาทีและสองขั้นตอนที่ได้รับเป็นหนึ่งด้านล่างที่ถูกทิ้งและเฟสhexanic บนมี FFAs วิธีการแก้ปัญหา FFA นี้ได้รับการระเหยในเครื่องระเหยแบบหมุน(Buchi, R210 มีสูญญากาศ pumpV-700 และควบคุม V-850, วิตเซอร์แลนด์) ในการลบและกู้คืนตัวทำละลายและ FFAs ได้. esterification ของ FFAs ตัวเร่งปฏิกิริยาโดยเอนไซม์ไลเปส Novozym 435 ในปฏิกิริยานี้FFAs ตอบสนอง กับเมทานอลในการผลิตเมทิลเอสเตอร์ (ไบโอดีเซล) และน้ำในการปรากฏตัวของไลเปสNovozym 435 ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา การทดลองได้ดำเนินการออกมาพร้อมกับ 4 กรัม FFAs, 0.86 มลเมทานอล (เมทานอล / FFA อัตราส่วน 1.5: 1) และ Novozym ที่แตกต่างกัน 435 / FFA อัตราส่วน ปฏิกิริยา esterification ได้ดำเนินการใน50 มล Erlenmeyer Flasks กับ stoppers ซิลิโคนที่ปกคลุม ในการทดลองโดยทั่วไปส่วนผสมที่ถูกบ่มที่ 40 องศาเซลเซียสและกวนในวงโคจรการเขย่าเครื่องอาบน้ำ (Inkubator 1000 Unimax 1010 Heidolph ไคลน์, เยอรมนี) ที่ 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ปฏิกิริยาถูกหยุดการทำงานโดยแยก Novozym 435 โดยการกรอง ผสมปฏิกิริยาสุดท้ายได้รับการอนุรักษ์ที่ 4 องศาเซลเซียสจนการวิเคราะห์ การทดลองได้ดำเนินการปรับเปลี่ยนตัวแปรต่อไปนี้: เวลาปฏิกิริยาอุณหภูมิกวนความเร็วเมทานอล / FFA อัตราส่วนโดยโมลและ Novozym 435 จำนวน ปฏิกิริยาทั้งหมดและการวิเคราะห์ที่สอดคล้องกันของพวกเขาได้ดำเนินการในที่ซ้ำกันและแต่ละค่าที่บันทึกไว้จึงเป็นทางคณิตศาสตร์เฉลี่ยของสี่ข้อมูลการทดลอง(ข้อมูลที่แสดงให้เห็นว่าค่าเฉลี่ย? มาตรฐานเบี่ยงเบน). การวิเคราะห์ของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาบัตรประจำตัวของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาที่(FFAs, เมธิล เอสเทอและระดับน้อย acylglycerols) ได้ดำเนินการโดยชั้นบางโค(TLC) ตามด้วยแก๊ส chromatography (GC) เพื่อตรวจสอบปริมาณสายพันธุ์ปัจจุบัน รายละเอียดของกรดไขมันใน oilswas ที่กำหนดโดยGC TLC ได้ดำเนินการบนจานของซิลิกาเจล (แผ่น Precoated เอาใจใส่ SIL G-25; MachereyeNagel, SigmaeAldrich) เปิดใช้งานโดยใช้ความร้อนที่ 105 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที ตัวอย่างเป็นด่างโดยตรงบนจานโดยการเพิ่ม 0.2 มิลลิลิตรของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาส่วนผสม ขั้นตอนการใช้โทรศัพท์มือถือเป็นคลอโรฟอร์ม / อะซิโตน / เมทานอล (95: 4.5: 0.5 v / v / V) สปอตของแต่ละไขมันถูกมองเห็นโดยการฉีดพ่นแผ่นที่มีไอสารไอโอดีนในอบไอน้ำไนโตรเจน ตำแหน่งของจุดที่สอดคล้องกับชนิด lipidic แต่ละที่เป็นที่โดดเด่นด้วยการตอบสนองปัจจัย ประเภทไขมันแต่ละคนได้คัดลอกมาจากจานและmethylated ตามวิธีการของโรดริเก-รุยซ์และอัล (12) ไขมันเมธิลกรดเอสเทอวิเคราะห์ GC กับก๊าซ Chromatograph Agilent เทคโนโลยี 6890 (Avondale, PA, สหรัฐอเมริกา) โดยใช้คอลัมน์ฝอยของ OmegawaxTM ซิลิกาหลอมละลาย(0.25 มม 30 มม, 0.25 มมฟิล์มมาตรฐาน Supelco, เบลลาฟอน, PA, สหรัฐอเมริกา) และFID (เครื่องตรวจจับเปลวไฟไอออนไนซ์) ไนโตรเจนเป็นก๊าซที่ผู้ให้บริการ กรด Nonadecanoic (19: 0) (SigmaeAldrich) ถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐานภายในสำหรับปริมาณความมุ่งมั่นของกรดไขมัน Matreya (Pleasant Gap, PA, สหรัฐอเมริกา) n-3 PUFAs (กรดไขมันไม่อิ่มตัว) มาตรฐาน (ชื่อหมายเลข 1177) ใช้สำหรับหาปริมาณของกรดไขมัน. การศึกษาระดับปริญญา esterification (ที่ ED) แสดงให้เห็นถึงอัตราร้อยละของ FFAs เริ่มต้นบริโภคโดยmethylation ED ถูกกำหนดโดยการไทเทรตกรดเบสหลังจากการตรวจสอบว่าผลมีความคล้ายคลึงกับผู้ที่ได้รับจากการเอาใจใส่และGC ซึ่งใช้เวลานาน ตัวอย่างที่ถูกเจือจางด้วยอะซิโตน (อัตราส่วน 1: 1 v / v) และ phenolphthalein ถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ ตัวอย่างจาก esterification ของ FFAs สาหร่ายถูกล้างด้วยอลูมิเจือจางด้วยอะซิโตน(กรดไขมัน / อะซิโตนอัตราส่วน 1:20 v / v) และปรับขนาดโดยใช้ไทมอลสีฟ้าเป็นตัวบ่งชี้ ก่อนหน้านี้ความเป็นกรดของส่วนผสมปฏิกิริยาเริ่มต้นได้รับการพิจารณาภายใต้เงื่อนไขเดียวกันที่ความเป็นกรดได้รับการวัดครั้งเดียวปฏิกิริยาเสร็จ ED ที่คำนวณได้จากสมการที่V0 และ V เป็นเล่มที่ 1 หรือ 0.1 ยังไม่มีการแก้ปัญหา NaOH ที่ใช้ในการไตเตรทของส่วนผสมที่เริ่มต้นและผลิตภัณฑ์ esterification ตามลำดับ การตรวจสอบความบริสุทธิ์ของ FFAs และเมทิลเอสเตอร์จากสารสกัดจากสาหร่าย FFA และปฏิกิริยา esterification ผลิตภัณฑ์ตามลำดับตัวอย่างของน้ำหนักรู้จักวิเคราะห์ GC ความบริสุทธิ์(น้ำหนัก%) ถูกกำหนดเป็นอัตราส่วนระหว่างน้ำหนักเมทิลเอสเตอร์ที่ได้จากประชาคมโลกและน้ำหนักตัวอย่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ
สาหร่าย , น้ำมัน , ไลเปสและสารเคมีชีวมวลวางเปียกของทะเล
สาหร่าย . gaditana ถูกใช้เป็นริชพื้นผิว ระบบนี้สะดวก
โดย estaci เลอองทดลอง de las palmerillas ( Cajamar เอลจิโด้ , สเปน ) เซลล์มีการปลูกในท่อ
photobioreactor กลางแจ้งที่ระดับ 7 , 000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที แล้วเก็บรักษา 
ที่ 20
C จนใช้ชีวมวลเปียกนี้ประกอบด้วย 40 %  0.7 % w / w ของ
ชีวมวลแห้งและไม่  0.0 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนักของไขมันทั้งหมดในมวลชีวภาพแห้ง เนื้อหาทั้งหมดกรด
ไขมัน ( หรือ saponifiable ไขมันเทียบเท่ากับกรดไขมันในชีวมวลเป็น 0.2 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนักใน 
12.1 มวลชีวภาพแห้ง กรดไขมันอิสระ ( ffas ) จากน้ำมันพืชใช้แล้ว ( uvo )
ยังใช้ น้ำมันนี้มีให้โดยผู้ผลิตไบโอดีเซล บริษัท albab í o
( ไนเจอร์ , สเปน )ตารางที่ 1 แสดงองค์ประกอบของกรดไขมันของน้ำมัน ปฏิกิริยาเอสเทอริฟิเคชัน
catalysed โดยไลเปสจาก Candida โนโวไซม์ 435
แอนตาร์กติกา ( กุ้ง / S , bagsvaerd , เดนมาร์ก ) เมื่อถูกตรึงบน
ยางอะคริลิก macroporous และเป็น positionally เฉพาะ .
เอทานอล ( การวิเคราะห์คุณภาพ 96% ) เฮกเซน ( คุณภาพและความบริสุทธิ์ 95% ) ทั้ง
ของ panreac ( บาร์เซโลนา ) ,ใช้สารสกัดจากสาหร่าย และ ffas

ทำให้เป็นสบู่ที่ uvo . กรดไฮโดรคลอริก ( 37% panreac S.A . , บาร์เซโลนา , สเปน ) , เมทานอล ( 99.9% บริสุทธิ์
คาร์โลมา rodano reagents , อิตาลี ) , NaOH และเกาะ ( 85% ความบริสุทธิ์ , J.T . Baker , Deventer
, ฮอลแลนด์ ) , คุณภาพวิเคราะห์ ยังใช้ ทั้งหมดเพื่อใช้ในการวิเคราะห์ข้างต้นยังวิเคราะห์

เกรดได้รับของ ffas จาก uvo สาหร่ายชีวมวลและ ffas fromuvo ถูก
ได้โดยการออกซิเดชันทางเคมีของน้ำมัน ปฏิกิริยาผสมที่มีอยู่ 350 มล. ของน้ำมัน
และ 700 มิลลิลิตรของสารละลาย hydroalcoholic NaOH ที่เตรียมละลาย
120 กรัม 400 มิลลิลิตร และมีน้ำ 400 มิลลิลิตรเอทานอล ( 96 % v / v ) การออกซิเดชันทางเคมี
ทำการเขย่าส่วนผสมนี้ที่ 200 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 60

C เป็นเวลา 30 นาทีส่วนผสมก็เย็นที่อุณหภูมิห้อง , 140 มล. ของน้ำเพิ่ม
pH ปรับค่าระหว่าง 1 และ 2 ใช้ 37 % HCL . ffas ถูกสกัดด้วยเฮกเซน
300 มิลลิลิตร เขย่าที่ความเร็วรอบ 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาที ในที่สุด hydroalcoholic
เฟสและเฮกเซนแยกได้จาก decantation และเฟส hexanic ล้าง

ffas สองครั้งด้วยน้ำ จากสาหร่าย )gaditana ได้ตามการเปลี่ยนแปลงของกระบวนการพัฒนาโดย IB
3 áñ EZ . kgm gonz lez et al . ( 11 ) ( รูปที่ 1 ) 0.50 กก.
ชีวมวลเปียกถูกปฏิบัติด้วย 3.63 ลิตรเอทานอล ( 96 % v / v ) ( 30 มิลลิลิตรเอทานอล ( 96 ) / ก. มวลชีวภาพแห้ง
) ที่มี 40 กรัมของเกาะ ( ความบริสุทธิ์ 85% ) ในถัง 10 ลิตร ซึ่งคือ Jacketed
สำหรับการควบคุมอุณหภูมิ สปอนนิฟิเคชั่นโดยตรงถูกดำเนินการที่ 60 องศาเซลเซียสนาน 1 ชั่วโมง

คงที่ที่ความเร็วรอบ 200 รอบต่อนาทีกวนด้วยใบพัดหมุน ( Eurostar ดิจิตอล ไอกะ Staufen
, เยอรมัน ) , ในบรรยากาศอาร์กอนและปกคลุมด้วยอลูมิเนียมฟอยล์เพื่อป้องกัน
แสง ชีวมวลที่ตกค้างแล้วแยกออกจากสารละลาย hydroalcoholic โดย
การกรองใช้จานแก้วพรุน ( เส้นผ่าศูนย์กลางรูขุมขน 100 มิลลิเมตร pobel , มาดริด , สเปน )
นี้กากชีวมวลถูกล้างด้วย 14 ลิตรเอทานอล ( 96 % v / v ) ( 14 มิลลิลิตรเอทานอล
( 96 ) / ก. มวลชีวภาพแห้ง เพื่อเพิ่มผลผลิตและการกู้คืนไขมันกรดซักนี้
โซลูชั่นถูกเพิ่มเข้าไป hydroalcoholic แก้ปัญหากรดไขมันจากการสกัดหลัก .
ในขั้นตอนต่อไปนี้ น้ำ ( คุณมล ) คือเพิ่ม ไประยะ hydroalcoholic

ถึง 30 เปอร์เซ็นต์ โดยน้ำหนักในน้ำ เพื่อเพิ่ม immiscibility ของโซลูชั่นและ hydroalcoholic
เฮกเซนและเนื้อหา unsaponifiable ถูกสกัดด้วยเฮกเซน หรือ L
( เฮกเซน / hydroalcoholic โซลูชั่นที่อัตราส่วน 1 : 1 v / v ) การสกัดการกวน
ที่ 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีต่อมา , solutionwas รินเป็นเวลา 30 นาที hexanic
โซลูชั่น unsaponifiable ออกออกจากล่าง hydroalcoholic
เฟสในระบาย ถัดไป , HCl เข้มข้นถูกเพิ่มเข้าไป hydroalcoholic