Bacterial cultures and growth condi

Bacterial cultures and growth conditions
Native strains of B. licheniformis MCC2514 and MCC2512
previously characterized in the laboratory for their probiotic
properties [17] were grown in Luria Bertani (LB) medium at
37 C under constant shaking (120 rpm). For antimicrobial
activity, the indicator organisms such as Micrococcus luteus
ATCC9341, Yersinia enterocolitica MTCC859, Aeromonas
hydrophila NRRL B445, Staphylococcus aureus FRI722,
Salmonella typhimurium MTCC1251, Escherichia coli CFR02
and Klebsiella sp. were procured from the American Type
Culture Collection (ATCC), USA or the Microbial Type Culture
Collection Center (MTCC) Chandigarh, India. Listeria
monocytogenes ScottA was kindly provided by Dr. A.K.
Bhunia, USA. All indicator cultures were grown in brain heart
Infusion (BHI) media at 37 C under constant shaking
(120 rpm). Reference standard culture B. subtilis 168 and
whole cell biosensor B. subtilis 168.BS2 (W168 amyETPSpaS:lacZ,
PSpaRK-SpaRK), a subtilin-specific reporter, were
kindly provided by Prof. K.D. Entian, Germany. The reporter
strain B. subtilis BSF2470 (CU1065 lialTpMUTIN) [22] was
used for confirming cell-wall stress-producing antimicrobial
substances. B. subtilis ATCC6633 and Bacillus flexus
MCC2011 were used as positive and negative controls,
respectively, for cell-wall stress-inducing antimicrobial
compounds.
2.3. Antimicrobial activity of Bacillus isolates
2.3.1. Preparation of the antimicrobial compound (AMC)
Bacillus cultures individually grown in LB broth were
centrifuged at 10,000 rpm for 15 min at 4 C. The cell-free
supernatant or crude AMC was filter-sterilized (0.2 mm
membrane) and stored at 4 C until use.
2.3.2. Inhibitory activity of the AMC
Antimicrobial activity of Bacillus isolates against various
indicator organisms was tested by the agar well diffusion assay
as described by Xie et al. [23]. The antibacterial activity was
further quantified by the twofold serial dilution method and
results were expressed as AU ml1
. A unit is defined as the
reciprocal value of the highest dilution at which the zone of
inhibition was observed.
2.4. Effect of enzymes on antimicrobial activity
The effect of enzymes including pepsin, trypsin, proteinase
K and a-amylase was tested on cell-free supernatant of Bacillus
spp. An aliquot of cell-free supernatant or crude AMC
was treated with the respective enzymes at a final concentration
of 2 mg ml1 at 37 C for 30 min. After incubation, the
activity was quantified and expressed as AU ml1 as described
elsewhere. An untreated cell-free supernatant and the enzymes
alone in the buffer (pH 7.0) served as controls.
2.5. Purification of the AMC
2.5.1. Optimization of the extraction procedure
AMC in the cell-free supernatant (CFS) of test cultures was
extracted by various methods to determine a suitable protocol
for maximum recovery. Method 1: CFS was precipitated with
P. Shobharani et al. / Research in Microbiology 166 (2015) 546e554 547
ice-cold ethanol (1:1 v/v) overnight at 4 C. The precipitate
thus obtained was air-dried, resuspended in phosphate buffer
(pH 7.0) and checked for inhibitory activity. Method 2: CFS
was mixed with 2 volumes of chloroform, stirred thoroughly
on a magnetic stirrer for 1 h and left at room temperature for
phase separation. The chloroform layer was separated, evaporated
under nitrogen and the residue dissolved in phosphate
buffer (pH 7.0) was checked for the activity. Method 3:
Ammonium sulfate was added to the CFS to a saturation level
of 60% under constant stirring. The precipitate obtained was
dialyzed against phosphate buffer (pH 7.0) and then monitored
for inhibitory activity. Method 4: the CFS was thoroughly
mixed with butanol (1:0.5 v/v) and left at room temperature
for phase separation. The butanol layer was evaporated and the
residue suspended in phosphate buffer (pH 7.0) was tested for
activity. Throughout the method, M. luteus ATCC9341 was
used as an indicator organism to analyze antagonistic activity.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Bacterial cultures and growth conditionsNative strains of B. licheniformis MCC2514 and MCC2512previously characterized in the laboratory for their probioticproperties [17] were grown in Luria Bertani (LB) medium at37 C under constant shaking (120 rpm). For antimicrobialactivity, the indicator organisms such as Micrococcus luteusATCC9341, Yersinia enterocolitica MTCC859, Aeromonashydrophila NRRL B445, Staphylococcus aureus FRI722,Salmonella typhimurium MTCC1251, Escherichia coli CFR02and Klebsiella sp. were procured from the American TypeCulture Collection (ATCC), USA or the Microbial Type CultureCollection Center (MTCC) Chandigarh, India. Listeriamonocytogenes ScottA was kindly provided by Dr. A.K.Bhunia, USA. All indicator cultures were grown in brain heartInfusion (BHI) media at 37 C under constant shaking(120 rpm). Reference standard culture B. subtilis 168 andwhole cell biosensor B. subtilis 168.BS2 (W168 amyETPSpaS:lacZ,PSpaRK-SpaRK), a subtilin-specific reporter, werekindly provided by Prof. K.D. Entian, Germany. The reporterstrain B. subtilis BSF2470 (CU1065 lialTpMUTIN) [22] wasused for confirming cell-wall stress-producing antimicrobialsubstances. B. subtilis ATCC6633 and Bacillus flexusMCC2011 were used as positive and negative controls,respectively, for cell-wall stress-inducing antimicrobialcompounds.2.3. Antimicrobial activity of Bacillus isolates2.3.1. Preparation of the antimicrobial compound (AMC)Bacillus cultures individually grown in LB broth werecentrifuged at 10,000 rpm for 15 min at 4 C. The cell-freesupernatant or crude AMC was filter-sterilized (0.2 mmmembrane) and stored at 4 C until use.2.3.2. Inhibitory activity of the AMCAntimicrobial activity of Bacillus isolates against variousindicator organisms was tested by the agar well diffusion assayas described by Xie et al. [23]. The antibacterial activity wasfurther quantified by the twofold serial dilution method andresults were expressed as AU ml1. A unit is defined as thereciprocal value of the highest dilution at which the zone ofinhibition was observed.2.4. Effect of enzymes on antimicrobial activityThe effect of enzymes including pepsin, trypsin, proteinaseK and a-amylase was tested on cell-free supernatant of Bacillusspp. An aliquot of cell-free supernatant or crude AMCwas treated with the respective enzymes at a final concentrationof 2 mg ml1 at 37 C for 30 min. After incubation, theactivity was quantified and expressed as AU ml1 as describedelsewhere. An untreated cell-free supernatant and the enzymesalone in the buffer (pH 7.0) served as controls.2.5. Purification of the AMC2.5.1. Optimization of the extraction procedureAMC in the cell-free supernatant (CFS) of test cultures wasextracted by various methods to determine a suitable protocolfor maximum recovery. Method 1: CFS was precipitated withP. Shobharani et al. / Research in Microbiology 166 (2015) 546e554 547ฉ่ำเอทานอล (1:1 v/v) ค้างคืนที่ซี 4 การ precipitateจึง ได้มี air-dried, resuspended ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์(pH 7.0) และลิปกลอสไขกิจกรรมการตรวจสอบ วิธีที่ 2: CFSถูกผสมกับวอลุ่ม 2 ของคลอโรฟอร์ม กวนอย่างละเอียดบนช้อนคนเหล็ก 1 h และซ้ายที่อุณหภูมิห้องในขั้นตอนการแยก มีแบ่งชั้นคลอโรฟอร์ม หายไปไนโตรเจนและสารตกค้างที่ละลายฟอสเฟตในบัฟเฟอร์ (pH 7.0) มีการตรวจสอบสำหรับกิจกรรม วิธีที่ 3:แอมโมเนียมซัลเฟตมีเพิ่ม CFS ที่ระดับความเข้ม60% ภายใต้คงกวน Precipitate ได้ถูกdialyzed กับฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.0) และตรวจสอบแล้วสำหรับกิจกรรมลิปกลอสไข วิธีที่ 4: CFS ถูกต้องผสมกับบิวทานอ (v 1:0.5 v) และซ้ายที่อุณหภูมิห้องสำหรับขั้นตอนแยก ชั้นบิวทานอได้หายไปและทดสอบสารตกค้างที่ถูกระงับในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.0) สำหรับกิจกรรมการ ตลอดทั้งวิธี M. luteus ATCC9341 ถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ชีวิตเพื่อวิเคราะห์กิจกรรมต่อต้าน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัฒนธรรมแบคทีเรียและเงื่อนไขการเจริญเติบโตของสายพันธุ์พื้นเมืองของ B. licheniformis MCC2514 และ MCC2512 โดดเด่นก่อนหน้านี้ในห้องปฏิบัติการสำหรับโปรไบโอติกของพวกเขาคุณสมบัติ [17] ถูกปลูกใน Luria Bertani (LB) กลางที่ 37 C ภายใต้คงสั่น (120 รอบต่อนาที) สำหรับยาต้านจุลชีพกิจกรรมมีชีวิตตัวบ่งชี้เช่น Micrococcus luteus ATCC9341, Yersinia enterocolitica MTCC859, Aeromonas hydrophila NRRL B445, Staphylococcus aureus FRI722, Salmonella typhimurium MTCC1251, อีโค CFR02 และ Klebsiella SP ได้รับการจัดหาจากประเภทอเมริกันวัฒนธรรมสะสม (ATCC) ประเทศสหรัฐอเมริกาหรือวัฒนธรรมประเภทจุลินทรีย์ศูนย์สะสม(MTCC) Chandigarh อินเดีย Listeria monocytogenes ScottA ให้ความกรุณาโดยดร. อลาสกาBhunia, สหรัฐอเมริกา วัฒนธรรมตัวบ่งชี้ทั้งหมดถูกปลูกในหัวใจสมองInfusion (BHI) สื่อที่ 37 C ภายใต้คงสั่น(120 รอบต่อนาที) อ้างอิงวัฒนธรรม B. subtilis 168 และมาตรฐานมือถือทั้งไบโอเซนเซอร์B. subtilis 168.BS2 (W168 amyETPSpaS: lacZ, PSpaRK-Spark) ผู้สื่อข่าว subtilin เฉพาะได้ให้ความกรุณาโดยศKD Entian เยอรมนี นักข่าวสายพันธุ์บี subtilis BSF2470 (CU1065 lialTpMUTIN) [22] ถูกใช้สำหรับการยืนยันผนังเซลล์ความเครียดการผลิตยาต้านจุลชีพสาร B. subtilis ATCC6633 และ Bacillus flexus MCC2011 ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมบวกและลบตามลำดับสำหรับผนังเซลล์ความเครียดชักนำยาต้านจุลชีพสาร. 2.3 ฤทธิ์ต้านจุลชีพของเชื้อ Bacillus แยก2.3.1 การเตรียมสารต้านจุลชีพ (AMC) วัฒนธรรม Bacillus เติบโตขึ้นเป็นรายบุคคลในน้ำซุป LB ถูกหมุนเหวี่ยงที่10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียสมือถือฟรีใสหรือบบส. เป็นน้ำมันดิบกรองฆ่าเชื้อ (0.2 มมเมมเบรน) และเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสจน การใช้งาน. 2.3.2 กิจกรรมการยับยั้งของบบส. กิจกรรมต้านจุลชีพของเชื้อ Bacillus แยกต่างๆกับชีวิตตัวบ่งชี้ที่ได้รับการทดสอบโดยการทดสอบการแพร่กระจายได้ดีวุ้นตามที่อธิบายXie et al, [23] กิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียที่ได้รับการวัดต่อไปโดยวิธีเจือจางอนุกรมสองเท่าและผลการวิจัยที่แสดงเป็นAU ML1 หน่วยถูกกำหนดให้เป็นค่าซึ่งกันและกันของการลดสัดส่วนสูงสุดที่โซนของการยับยั้งพบว่า. 2.4 ผลของเอนไซม์ในฤทธิ์ต้านจุลชีพผลของเอนไซม์รวมทั้งน้ำย่อย, trypsin, โปร K และอะไมเลสได้รับการทดสอบในสารละลายปราศจากเซลล์ของแบคทีเรีย Bacillus spp aliquot ของสารละลายมือถือฟรีหรือน้ำมันดิบบบส. ได้รับการรักษาด้วยเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องในความเข้มข้นสุดท้ายของ 2 มิลลิกรัม ML1 ที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที หลังจากการบ่มที่กิจกรรมที่ได้รับการวัดและแสดงความเป็นออสเตรเลีย ML1 ตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น ใสปราศจากเซลล์ได้รับการรักษาและเอนไซม์อยู่คนเดียวในบัฟเฟอร์ (pH 7.0) ทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุม. 2.5 การทำให้บริสุทธิ์ของบบส. 2.5.1 การเพิ่มประสิทธิภาพของขั้นตอนการสกัดบบส. ในสารละลายเซลล์ฟรี (CFS) ของวัฒนธรรมที่ได้รับการทดสอบการสกัดโดยวิธีการต่างๆ เพื่อตรวจสอบโปรโตคอลที่เหมาะสมสำหรับการกู้คืนสูงสุด วิธีที่ 1: CFS ถูกตกตะกอนกับพี Shobharani et al, / วิจัยจุลชีววิทยา 166 (2015) 546e554 547 เอทานอลเย็น (1: 1 v / v) ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียสตกตะกอนจึงได้ถูกอากาศแห้ง, resuspended ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์(pH 7.0) และการตรวจสอบการยับยั้ง วิธีที่ 2: CFS ผสมกับ 2 เล่มคลอโรฟอร์มกวนอย่างทั่วถึงในกวนแม่เหล็กเป็นเวลา1 ชั่วโมงและทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องแยกเฟส ชั้นคลอโรฟอร์มที่ถูกแยกออกจากกันระเหยภายใต้ไนโตรเจนและสารตกค้างที่ละลายในฟอสเฟตบัฟเฟอร์(pH 7.0) ได้รับการตรวจสอบกิจกรรม วิธีที่ 3: แอมโมเนียมซัลเฟตถูกบันทึกอยู่ใน CFS ในระดับอิ่มตัว60% ภายใต้ตื่นเต้นอย่างต่อเนื่อง ตะกอนที่ได้มาdialyzed กับฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.0) และตรวจสอบแล้วว่าเป็นกิจกรรมที่ยับยั้ง วิธีที่ 4: CFS ถูกอย่างละเอียดผสมกับบิวทานอ(1: 0.5 v / v) และทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องสำหรับการแยกเฟส ชั้นบิวทานอได้รับการระเหยและสารตกค้างที่ลอยอยู่ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.0) ได้รับการทดสอบสำหรับกิจกรรม ตลอดวิธีการที่เอ็ม luteus ATCC9341 ถูกนำมาใช้เป็นสิ่งมีชีวิตตัวบ่งชี้ในการวิเคราะห์กิจกรรมที่เป็นปฏิปักษ์