Despite the abundance of genetic ma

Despite the abundance of genetic manipulation approaches, particularly for Escherichia coli, new techniques and
increased flexibility in the application of existing techniques are required to address novel aims. The most widely
used approaches for chromosomeediting are based on bacteriophage site-specific andλRed/RecET-mediated homologous
recombination. In the present study, these techniqueswere combined to develop a novel approach for
in vivo cloning and targeted long-length chromosomal insertion. This approach permits direct λRed-mediated
cloning of DNA fragment with lengths of 10 kb or greater from the E. coli chromosome into the plasmid vector
pGL2, which carries the ori of pSC101, the ϕ80-attP site of ϕ80 phage, and an excisable CmR marker bracketed
by λ-attL/attR sites. In pGL2-based recombinant plasmids, the origin of replication can be eliminated in vitro
via hydrolysis by SceI endonuclease and recircularization by DNA ligase. The resulting ori-less circular recombinant
DNA can be used for targeted insertion of the cloned sequence into the chromosome at a selected site via
ϕ80 phage-specific integrase-mediated recombination using the Dual-In/Out approach (Minaeva et al., 2008).
At the final stage of chromosomal editing, the CmR-marker can be excised from the chromosome due to expression
of the λint/xis genes. Notably, the desired fragment can be inserted as multiple copies in the chromosome by
combining insertions at different sites in one strain using the P1 general transduction technique (Moore, 2011).
The developed approach is useful for the construction of plasmidless, markerless recombinant strains for fundamental
and industrial purposes

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แม้ มีความอุดมสมบูรณ์ของแนวทางการจัดการทางพันธุกรรม โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ Escherichia coli เทคนิคใหม่ และเพิ่มความยืดหยุ่นในการประยุกต์ใช้เทคนิคที่มีอยู่จะต้องมีเป้าหมายใหม่อยู่ กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดวิธีใช้สำหรับ chromosomeediting อิงแบคทีเฉพาะ andλRed/RecET-สื่อเซทจะมีรวมตัวกัน ในการศึกษาปัจจุบัน techniqueswere เหล่านี้รวมกันเพื่อพัฒนาแนวทางใหม่สำหรับการโคลนในสัตว์ทดลองและเป้าหมายระยะยาวของโครโมโซมแทรก วิธีการนี้อนุญาตให้ตรงสื่อ λRedโคลนของชิ้นส่วนดีเอ็นเอมีความยาว ของ 10 กิโล หรือมากกว่าจากโครโมโซม E. coli ลงในเวกเตอร์ plasmidpGL2 ซึ่งดำเนิน ori pSC101 เว็บไซต์ ϕ80-attP ของ ϕ80 phage และหมาย CmR excisable เล็บโดยλ-attL/attR ไซต์ ใน pGL2 ใช้ plasmids recombinant มาของการจำลองแบบจะถูกกำจัดในหลอดทดลองผ่านการย่อยสลายโดย SceI endonuclease และ recircularization โดย DNA ligase ควบรวมวงกลม ori น้อยผลดีเอ็นเอสามารถใช้สำหรับแทรกลำดับโคลนเป็นโครโมโซมในไซต์ที่เลือกผ่านเป้าหมายΦ80 phage เฉพาะสื่อ integrase รวมตัวกันโดยใช้วิธี Dual/ออก (Minaeva et al. 2008)ในขั้นตอนสุดท้ายของการแก้ไขของโครโมโซม หมาย CmR สามารถ excised จากโครโมโซมเนื่องจากนิพจน์ของยีน λint/xis ยวด สามารถแทรกส่วนที่ต้องการเป็นหลายสำเนาในโครโมโซมโดยรวมแทรกในไซต์ที่แตกต่างในสายพันธุ์หนึ่งที่ใช้เทคนิคทั่วไปส่ง P1 (Moore, 2011)วิธีการพัฒนาจะเป็นประโยชน์สำหรับการก่อสร้างสายพันธุ์ recombinant plasmidless, markerless สำหรับพื้นฐานและอุตสาหกรรม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แม้จะมีความอุดมสมบูรณ์ของวิธีการจัดการทางพันธุกรรมโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ Escherichia coli, เทคนิคใหม่ ๆ และ
เพิ่มความยืดหยุ่นในการประยุกต์ใช้เทคนิคที่มีอยู่จะต้องมีจุดมุ่งหมายอยู่ที่นวนิยาย กันอย่างกว้างขวางที่สุด
วิธีใช้สำหรับ chromosomeediting จะขึ้นอยู่กับ bacteriophage เว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงandλRed / RecET พึ่งคล้ายคลึงกัน
รวมตัวกันอีก ในการศึกษาครั้งนี้ techniqueswere รวมกันเพื่อพัฒนาวิธีการใหม่สำหรับ
การโคลนในร่างกายและการกำหนดเป้าหมายระยะยาวที่มีความยาวของโครโมโซมแทรก วิธีการนี้จะอนุญาตให้โดยตรงλRedพึ่ง
โคลนชิ้นดีเอ็นเอที่มีความยาว 10 KB หรือมากกว่าจาก coli โครโมโซมอีเข้าไปในพลาสมิดเวกเตอร์
pGL2 ซึ่งถือ Ori ของ pSC101 เว็บไซต์φ80-attP ของφ80ทำลายจุลินทรีย์และโดยที่ต้องเสียภาษี CMR เครื่องหมายวงเล็บ
โดยλ-attl เว็บไซต์ / attr ใน pGL2 ตามพลาสมิด recombinant ต้นกำเนิดของการจำลองแบบสามารถตัดออกในหลอดทดลอง
ผ่านการย่อยสลายโดย SCEI endonuclease และ recircularization โดยลิกาเซดีเอ็นเอ ส่งผลให้ recombinant Ori น้อยวงกลม
ดีเอ็นเอสามารถนำมาใช้สำหรับการแทรกการกำหนดเป้าหมายของลำดับโคลนเข้าไปในโครโมโซมที่ไซต์ที่เลือกผ่าน
φ80 recombination integrase พึ่งทำลายจุลินทรีย์ที่เฉพาะเจาะจงโดยใช้แบบ Dual-in / out วิธี (Minaeva et al., 2008) .
ในขั้นตอนสุดท้ายของการแก้ไขโครโมโซมที่ CMR เครื่องหมายสามารถตัดจากโครโมโซมเนื่องจากการแสดงออก
ของλint / ยีน Xis โดยเฉพาะอย่างยิ่งชิ้นส่วนที่ต้องการสามารถแทรกเป็นหลายชุดในโครโมโซมโดย
รวมแทรกที่เว็บไซต์ที่แตกต่างกันในหนึ่งสายพันธุ์ที่ใช้ P1 เทคนิคพลังงานทั่วไป (มัวร์ 2011).
แนวทางการพัฒนาจะเป็นประโยชน์สำหรับการก่อสร้างของ plasmidless สายพันธุ์ recombinant Markerless สำหรับ พื้นฐาน
วัตถุประสงค์และอุตสาหกรรม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แม้จะมีความอุดมสมบูรณ์ของการจัดการทางพันธุกรรม วิธีการ โดยเฉพาะอย่างยิ่งใน Escherichia coli และเทคนิคใหม่เพิ่มความยืดหยุ่นในการประยุกต์ใช้เทคนิคที่มีอยู่ จะต้องมีที่อยู่ใหม่ อย่างกว้างขวางมากที่สุดใช้แนวทาง chromosomeediting อยู่บนพื้นฐานและโรงพยาบาลเฉพาะλสีแดง / recet ระดับโฮโมโลกัสการ . ในการศึกษานี้ techniqueswere รวมกันเพื่อพัฒนาวิธีการใหม่สำหรับฤทธิ์ในการโคลนและความยาวนานของการกำหนดเป้าหมาย . วิธีนี้ช่วยให้λโดยตรงโดยแดงการโคลนชิ้นดีเอ็นเอที่มีความยาว 10 กิโลหรือมากกว่าจาก E . coli โครโมโซมในเวกเตอร์พลาสมิดpgl2 ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ของ psc101 , ϕ 80 attp เว็บไซต์ของϕ 80 ฟาและเครื่องหมาย CMR excisable ในวงเล็บโดยλ - attl / attr เว็บไซต์ ใน pgl2 จากรีคอมบิแนนท์พลาสมิด ที่มาของการสามารถถูกตัดออกในหลอดทดลองผ่านการย่อยโดยเอนโดนิวคลีเอสและ scei recircularization โดยไลเกส ดีเอ็นเอ ผล กลม ขนาดคอมน้อยดีเอ็นเอสามารถใช้เป็นเป้าหมายสำหรับการแทรกของโคลนลำดับในโครโมโซมที่เลือกเว็บไซต์ผ่านทางϕ 80 ฟาเฉพาะอินทีเกรส ( การใช้ Dual / ออกแบบ ( minaeva et al . , 2008 )ในขั้นตอนสุดท้ายของการแก้ไขระดับ , CMR เครื่องหมายสามารถตัดจากโครโมโซมเนื่องจากนิพจน์ของλ int / ซิสยีน โดยเฉพาะชิ้นส่วนที่ต้องการสามารถแทรกในโครโมโซมหลายชุด โดยเป็นรวมเว็บไซต์ที่แตกต่างกันในหนึ่งสายพันธุ์ใหม่ที่ใช้ P1 ทั่วไปผ่านเทคนิค ( มัวร์ , 2011 )การพัฒนาแนวทางที่เป็นประโยชน์สำหรับการสร้าง plasmidless สายพันธุ์ของเซลล์ markerless สำหรับพื้นฐานและวัตถุประสงค์อุตสาหกรรม