The cDNA corresponding to lcc1 was

The cDNA corresponding to lcc1 was obtained
by RT-PCR using the Superscript one-step RT-PCR kit
(Invitrogen) with the primer pair Lcc1F and Lcc1R. These primers contain additional non-specific
50 flanking regions (italic) that encode BamH1 and AvrII restriction
sites (underlined) for directional in-frame cloning. These primers
were designed from the T. versicolor lcc1 gene (GenBank accession
number X84683.1). The resulting cDNA product was then doubledigested
by BamHI/AvrII and inserted into plasmid JMP62Ura3d1
ExpTEFHis. The ligation product was then transformed into E. coli
TOP10. The resulting plasmid (JMP62Ura3d1ExpTEF-lcc1-His)
was digested by NotI to yield a linear cassette flanked by zeta
regions and containing the Ura3d1 selection marker and the
lcc1-(His)6 fusion gene under the control of the strong constitutive
pTEF promoter. This cassette was then transformed into the Y.
lipolytica JMY1212 for single-copy integration into the genome at
a zeta-docking platform (Bordes et al., 2007). To allow multiplecopy
integration of lcc1 expression cassette into Y. lipolytica
JMY1165, the replacement of the non-defective Ura3d1 allele by
the defective Ura3d4 allele was done (Le Dall et al., 1994). The plasmid
JMP6 (Pignède et al., 2000) were generously provided by Dr.
M. Nicaud and Prof. A. Marty (INSA, Toulouse, France). Briefly,
the JMP6 plasmid was double-digested by NheI/ClaI to extract a
DNA fragment containing Ura3d4. This fragment was then cloned
into JMP62Ura3d1ExpTEF-lcc1-His at the same sites to replace
Ura3d1. Upon NotI digestion of the resulting plasmid
(JMP62Ura3d4ExpTEF-lcc1-His), the linear lcc1 expression cassette
containing Ura3d4 was transformed for multiple-copy integration
into the genome of Y. lipolytica JMY1165. A single copy of this
defective gene is not able to restore the growing of Y. lipolytica.
Only transformants that have inserted more than one copy of this
gene are able to grow on YNB medium. Ura-positive transformants
were selected on YNB agar plate after 1–2 weeks.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

cDNA ที่สอดคล้องกับ lcc1
ได้โดยRT-PCR โดยใช้ขั้นตอนเดียวยกชุด RT-PCR
(Invitrogen) กับคู่ไพรเมอร์และ Lcc1R Lcc1F ไพรเมอร์เหล่านี้มีไม่เฉพาะเจาะจงเพิ่มเติม
50 ภูมิภาคขนาบ (ตัวเอียง) ที่เข้ารหัส BamH1 AvrII และข้อ จำกัด
เว็บไซต์ (ขีดเส้นใต้) สำหรับการโคลนทิศทางในกรอบ ไพรเมอร์เหล่านี้ได้รับการออกแบบจาก T. versicolor ยีน lcc1 (GenBank เข้าจำนวนX84683.1) ผลิตภัณฑ์ยีนส่งผลให้ได้รับการ doubledigested แล้วโดยBamHI / AvrII และแทรกเข้าไปในพลาสมิด JMP62Ura3d1 ExpTEFHis ligation สินค้าที่ได้รับการเปลี่ยนแล้วเป็นเชื้อ E. coli TOP10 พลาสมิดที่เกิด (JMP62Ura3d1ExpTEF-lcc1-ของเขา) ถูกย่อยโดย Noti ให้ผลผลิตเทปเชิงเส้นขนาบข้างด้วยซีตาภูมิภาคและมีเครื่องหมายเลือกUra3d1 และlcc1- (ของเขา) 6 ยีนฟิวชั่นภายใต้การควบคุมของส่วนประกอบที่แข็งแกร่งก่อการpTEF เทปนี้ถูกเปลี่ยนแล้วเข้าสู่วายlipolytica JMY1212 เพื่อบูรณาการการคัดลอกเดียวในจีโนมที่เป็นแพลตฟอร์มที่เชื่อมต่อซีตา(Bordes et al., 2007) ที่จะอนุญาตให้ multiplecopy การรวมกลุ่มของเทปการแสดงออก lcc1 เข้าวาย lipolytica JMY1165, การเปลี่ยนของอัลลีล Ura3d1 ไม่เสียโดยอัลลีลUra3d4 มีข้อบกพร่องก็ทำ (Le ดอลล์ et al., 1994) พลาสมิดJMP6 (Pignède et al., 2000) ได้ให้เห็นแก่ตัวโดยดร. เอ็ม Nicaud และศอร์ตี้ (ตัณหา, ตูลูส, ฝรั่งเศส) สั้น ๆ , พลาสมิด JMP6 ถูกดับเบิลย่อยโดย NheI / CLAI ที่จะแยกชิ้นดีเอ็นเอที่มีUra3d4 ส่วนนี้เป็นโคลนจากนั้นเข้าสู่ JMP62Ura3d1ExpTEF-lcc1-ของเขาในเว็บไซต์เดียวกันเพื่อแทนที่ Ura3d1 เมื่อการย่อยอาหาร Noti ของพลาสมิดที่เกิด(JMP62Ura3d4ExpTEF-lcc1-ของเขา) ที่เทปการแสดงออก lcc1 เชิงเส้นที่มีUra3d4 ถูกเปลี่ยนเพื่อบูรณาการหลายสำเนาลงในจีโนมของวายlipolytica JMY1165 สำเนาเดียวของนี้ยีนบกพร่องจะไม่สามารถที่จะเรียกคืนการเจริญเติบโตของวาย lipolytica ได้. transformants เฉพาะที่มีการแทรกมากกว่าหนึ่งสำเนานี้ยีนสามารถที่จะเติบโตในสื่อYNB transformants Ura บวกได้รับการคัดเลือกในจานอาหารเลี้ยงเชื้อYNB หลังจาก 1-2 สัปดาห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีที่สอดคล้องกับ lcc1 ได้
โดย RT-PCR โดยใช้ลวดหนาม Real-Time RT-PCR Kit
( Invitrogen ) ด้วยไพรเมอร์คู่และ lcc1f lcc1r . ไพรเมอร์เหล่านี้ประกอบด้วยเพิ่มเติมเฉพาะ
50 flanking ภูมิภาค ( ตัวเอียง ) และเว็บไซต์ที่เข้ารหัส bamh1 จำกัด
avrii ( ขีดเส้นใต้ ) สำหรับทิศทางในกรอบการโคลน . ไพรเมอร์เหล่านี้
ถูกออกแบบจากยีนโรค lcc1 ขนาดเข้า
( Tหมายเลข x84683.1 ) ผลดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์ก็ doubledigested
ด้วย BamHI / avrii และสอดเข้าในพลาสมิด jmp62ura3d1
exptefhis . ผลิตภัณฑ์ Ligation แล้วแปลงเป็น E . coli
TOP10 . ผลของพลาสมิด ( jmp62ura3d1exptef-lcc1-his )
ถูกย่อยโดยเก็บไว้ตรงไหนก็ได้ที่จะทำให้เส้นเทปขนาบภูมิภาคซีตา
และบรรจุ ura3d1 และเลือกเครื่องหมาย
โดยlcc1 - ( ของเขา ) 6 ฟิวชั่นยีนอยู่ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ ptef แข็งแรงและ

เทปนี้แล้วเปลี่ยนเป็น Y
lipolytica jmy1212 การคัดลอกเดี่ยวเข้าไปในจีโนมที่
Zeta docking แพลตฟอร์ม ( บอเดส et al . , 2007 ) เพื่อให้รวม multiplecopy
ของ lcc1 การแสดงออกเทปเป็น Y lipolytica
jmy1165 การแทนที่ของไม่บกพร่อง ura3d1 อัลลีลโดย
กลุ่ม ura3d4 รุดา ( Le ดอล et al . , 1994 ) การ jmp6 พลาสมิด
( pign è de et al . , 2000 ) อย่างไม่เห็นแก่ตัวโดยดร.
M nicaud และ ศ. ก. มาร์ตี้ ( อินสะตูลูส , ฝรั่งเศส ) สั้น ๆ ,
jmp6 พลาสมิดคู่ย่อย nhei / clai เพื่อแยก
ดีเอ็นเอที่มี ura3d4 . ส่วนนี้คือโคลน
เป็น jmp62ura3d1exptef-lcc1-his ที่เว็บไซต์เดียวกันแทน
ura3d1 .เมื่อการย่อยอาหารของพลาสมิดเก็บไว้ตรงไหนก็ได้ )
( jmp62ura3d4exptef-lcc1-his ) , lcc1 การแสดงออกเชิงเส้นเทป
ที่มี ura3d4 ถูกเปลี่ยนเพื่อคัดลอกหลายบูรณาการ
ในจีโนมของ Y lipolytica jmy1165 . สำเนาเดียวของยีนที่บกพร่องนี้
ไม่สามารถเรียกคืนการเจริญเติบโตของ Y lipolytica .
transformants เท่านั้นที่ได้แทรกมากกว่าหนึ่งสำเนานี้
ยีนจะสามารถเติบโตบน ynb ปานกลาง ส่วนตัวบวกถูกเลือกบนพลาสมิด
ynb agar plate หลัง 1 – 2 สัปดาห์