Introduction For some time, lactose

Introduction
For some time, lactose in whey has been recognized as an ideal substrate for the production of both fuel and potable ethanol via fermentation. ’ Efficient conversion and process design have been hindered by the facts that the concentra- tion of lactose in whey is relatively low and that relatively few fermenting yeasts are capable of lactose utilization. The most common alternatives to using conventional strains of Saccharomyces cerevisiae together with exogenously added
Address reprint requests to Dr. McHale, Biotechnology Group, School of Applied Biological and Chemical Sciences, University of Ulster, Cole- raine, BT52 ISA, Co. Londonderry, Northern Ireland Received 29 July 1994; revised 8 November 1994; accepted November 18, 1994
enzymes include strains of Kluyveromyces, although these are incapable of functioning at temperatures >37”C. It has been suggested that the use of whey concentrates would be expected to overcome problems associated with low con- centrations of lactose2; however, this causes problems as- sociated with lactose intolerance of previously used strains of Kluyveromyces marxianus.3 Hence, there is a require- ment for yeast strains capable of functioning at elevated temperatures. As a result of continuous ethanol recovery from whey fermentations at elevated temperatures, the re- quirement for concentration of whey preparations would be negated. A series of thermotolerant strains of K. marxianus have been isolated,4 and one of those strains, IMB3, has been reported to be capable of ethanol production at 45°C during growth on glucose, cellobiose,5 sucrose,6 and lactose- containing media.’ With respect to growth on lactose-
Enzyme and Microbial Technology 17:69&699, 1995 0 1995 by Elsevier Science Inc. 655 Avenue of the Americas, New York, NY 10010
0141-0229/95/$10.00 SSDI 0141-0229(94)00115-8
P-Galactosidase activity production: 0. Brady et al.
Gels were transferred to a UV transilluminator for visualization and photography.
containing media, the organism produced significant quan- tities of ethanol, although conversion was somewhat lim- ited, even though the organism was shown to produce a cell-associated P-galactosidase activity (EC 3.2.1.23). ’ It was shown during the study that supplementation of the medium with enzyme derived from homogenized cells of K. marxianus IMB3 resulted in increased ethanol production from lactose, and the limitation in ethanol production in unsupplemented media was postulated to result from inac- tivation of the exogenously added enzyme at 45°C. In this study we describe the isolation of the P-galactosidase ac- tivity from K. marxianus IMB3 grown on lactose- containing media at 45”C, and report on the partial charac- terization of that activity.
Materials and methods Growth of microorganism
Kluyveromyces marxianus IMB3 was maintained on malt extract agar at 45°C. The organism was grown in submerged culture in shake-flasks containing yeast growth medium as described previ- 0us1y,~ except that sucrose was replaced by lactose [2% (w/v)]. Flasks were incubated in an orbital shaker at 45°C.
Extraction of P-galactosidase
Cells were harvested by centrifugation at 36 h and washed in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.0. Cells were homogenized in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.0, using a Braun homoge- nizer together with glass beads as described previously.’ Homoge- nates were clarified by centrifugation at 10,000 g for 30 mins and concentrated by passage through a 100,000 KDa cutoff ultrafiltra- tion membrane. The extract was stored at - 20°C.
@Galactosidase assay
Activity was determined by assay at 30°C using the substrate o-ni- trophenyl-P-D-galactoside in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Enzyme activity is expressed as kmoles a-nitrophenol pro- duced per minute per milliliter of sample. Protein concentration was determined using a previously described method.8 Using lac- tose as substrate, reactions consisted of the relevant concentration of substrate in 50 mu sodium phosphate buffer, pH 7.0. Assays were performed at 3O”C, after which the concentration of glucose produced was determined using the glucose oxidase-peroxidase kit produced by Boehringer Mannheim, GmbH (Germany) in ac- cordance with the manufacturer’s instructions.
Nondenaturing pofyacrylamide gradient gel electrophoresis
Polyacrylamide gradient gel electrophoresis (PAGGE) was per- formed essentially as described previously.9 Electrophoresis was carried out using 4-15% gels at 200 V for IO min following application of the sample. Subsequently, running conditions were changed to 150 V and electrophoresis was allowed to continue for 1.5 h.
P-Galactosidase zymogram staining procedure
Gels to be stained were placed in substrate solution (5 mu meth- ylumbelliferyl-P-D-galactoside in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) and incubated for 2 to 5 h at room temperature.
Determination of ethanol
Samples harvested from fermentations were analyzed for ethanol content using a gas chromatograph (GLC 8410; Perkin Elmer) as described previously.6
Results Production of P-galactosidase during growth of K. marxianus IMB3 on glucose and lactose-containing media
The organism was grown on media containing 2% (w/v) lactose and glucose, and samples harvested at various times were analyzed for cell associated P-galactosidase activity. The results are shown in Figure 1. The organism was shown to produce maximum amounts of enzyme at 20 to 25 h, both on glucose- and lactose-containing media. In the case of enzyme production by the organism in glucose-containing media, the amount of enzyme was low but significant. These results suggest that the organism is capable of pro- ducing low, constitutive amounts of activity in the presence of glucose. No activity was detected in extracellular culture supematants. When grown on 2% (w/v) glucose, the organisms pro- duced a maximum concentration of 8.5 g l- 1 ethanol (Fig- ure 2), which represented 83% of the maximum theoretical yield. When the organism was grown on media containing 2% (w/v) lactose, the maximum amount of ethanol pro- duced was found to be 4 g l-l, which represented 39% of the maximum theoretical yield. In view of the latter finding we decided to isolate and further characterize the P-galac- tosidase activity produced by the organism during growth on lactose-containing media.
Figure 1 Production of p-galactosidase activity during growth of Kluyveromyces marxianus IMB3 on glucose (0) and lactose (0) containing media. Samples were harvested at the indicated times and cells were homogenized as described in METHODS. Activity is expressed in units per milligram protein.
Enzyme Microb. Technol., 1995, vol. 17, August 697
Papers
7.5
5
2.5
0
TERll’ (“C)
Figure 2 Ethanol production during growth of Kluyveromyces marxianos IMB3 on lactose (0) and glucose (Cl) containing me-
Figure 3 The effect of temperature on cell-associated l3-galac-
dia
tosidase activity produced during growth of Kluyveromyces marxianus IMB3 on lactose-containing media
Partial characterization of f3-galactosidase produced by K. marxianus during growth on lactose-containing media
Discussion
Cells were harvested and the P-galactosidase was isolated as described in METHODS. Partial characterization consisted of examining the temperature and pH optimum of the ac- tivity together with its thermal stability at a variety of tem- peratures. This activity was characterized with respect to its K,,, using both lactose and o-nitrophenyl-P-D-galactoside as substrates. The activity was found to have a relatively broad temperature optimum between 40 and 50°C with activity decreasing relatively rapidly at temperatures above this (Figure 3).
Although, as previously shown,’ the thermotolerant yeast K. marxianus IMB3 is capable of ethanol production on lactose-containing media at 45”C, the level of ethanol pro-
We found that whereas the activity was stable for at least 7 h at 3O”C, it had half-lives of 15 and 5 min at 45 and 5O”C, respectively. The activity was shown to have a relatively sharp pH profile that peaked at pH 7.5. The activity was also shown to exhibit conventional Michaelis-Menton ki- netics, and was found to have K,,, of 5 and 40 mM using o-nitrophenyl-P-D-galactoside and lactose as substrates, re- spectively.
Analysis of cell extracts using nondenaturing PAGGE and zymogram staining for f3-galactosidase activity
Crude cell extracts were applied to polyacrylamide gradient gels as described in METHODS. Following electrophoretic resolution, the gels were stained by incubation with 1 mu methylumbelliferyl-P-D-galactoside in the presence and ab- sence of 2% (w/v) lactose. The result obtained is shown in Figure 4; two clearly discemable bands were detected. In addition, a distinct inhibition occurred in the signal obtained in the presence of lactose (Figure 4, lane 2), thereby sug- gesting a similarly active site for both substrates.
Figure 4 Electrophoretic analysis of crude, cell-associated p-galactosidase produced during growth of Kluyveromyces marxianus IMB3 on lactose-containing media. Aliquots of sam- ple containing 50 pg of protein were applied to each lane of the polyacrylamide gradient gels (see METHODS); following electro- phoresis, the gels were immersed in 1 t?IM methylumbelliferyl- P-o-galactoside in the absence (lane 1) and presence (lane 2) of 2% (w/v) lactose. Active bands were visualized using a UV transilluminator
696 Enzyme Microb. Technol., 1995, vol. 17, August
duced is relatively low. It has also been shown that the thermotolerant organism produced a cell-associated B-ga- lactosidase activity.’ These results suggested that the limi- tation in ethanol production resulted from inaccessibility of substrate to enzyme, either as a function of lactose entry into the cell or as a result of thermal inactivation of P-ga- lactosidase released from cells during growth at 45°C. The results shown here with the thermotolerant stra

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แนะนำ
เวลา แล็กโทสในเวย์ได้ถูกรู้จักว่าเป็นพื้นผิวเหมาะสำหรับการผลิตเชื้อเพลิงและดื่มเอทานอลผ่านการหมัก ' แปลงที่มีประสิทธิภาพและออกแบบกระบวนการได้ถูกผู้ที่ขัดขวาง โดยข้อเท็จจริงว่า concentra-สเตรชันของแล็กโทสในเวย์ค่อนข้างต่ำ และ yeasts fermenting ค่อนข้างน้อยความสามารถในการย่อยแลคโตสใช้ประโยชน์ เพิ่มทางเลือกทั่วไปโดยใช้สายพันธุ์ดั้งเดิมของ Saccharomyces cerevisiae ร่วมกับ exogenously
ขอให้ดร. McHale เทคโนโลยีชีวภาพ โรงเรียนของใช้ชีวภาพ และ กลุ่มสารเคมี วิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยรี่อัลสเตอร์ โคล raine, BT52 ISA บริษัท ไอร์แลนด์เหนือได้รับ 29 1994 กรกฎาคม พิมพ์ที่อยู่ ปรับปรุง 8 1994 พฤศจิกายน 18 พฤศจิกายน 1994 ยอมรับ
เอนไซม์รวมสายพันธุ์ของ Kluyveromyces ถึงแม้ว่าเหล่านี้จะไม่สามารถทำงานที่อุณหภูมิ > 37 " c มันได้ถูกแนะนำว่า จะต้องใช้เวย์มุ่งเพื่อเอาชนะปัญหาที่เกี่ยวข้องกับคอน centrations ต่ำของ lactose2 อย่างไรก็ตาม นี้ทำให้ปัญหาเป็น sociated กับแล็กโทสของสายพันธุ์ก่อนหน้านี้ใช้ของ Kluyveromyces marxianus.3 ดังนั้น มีความต้องการติดขัดสำหรับยีสต์สามารถทำงานได้ที่อุณหภูมิสูง จากเอทานอลอย่างต่อเนื่องฟื้นจากการหมักแหนมเวย์ที่อุณหภูมิ quirement ใหม่สำหรับความเข้มข้นของเวย์เตรียมจะเป็น negated ชุดของสายพันธุ์ thermotolerant ของคุณ marxianus ได้แยก 4 และหนึ่งในบรรดาสายพันธุ์ IMB3 มีรายงานว่า สามารถผลิตเอทานอลที่ 45° C ในระหว่างการเจริญเติบโตในกลูโคส cellobiose ซูโครส 5, 6 และแล็กโทส - ประกอบด้วยสื่อ ' เกี่ยวกับการเจริญเติบโตบนแล็กโทส -
เอนไซม์และจุลินทรีย์เทคโนโลยี 17:69&699, 1995 0 1995 โดย Elsevier วิทยาศาสตร์ Inc. 655 ถนนของอเมริกา New York, NY 10010
0141-0229/95/$10.00 SSDI 0141-0229 (94) 00115-8
P-Galactosidase กิจกรรมผลิต: 0 เบรดี้ et al.
เจถูกโอนย้ายไป transilluminator UV สำหรับแสดงภาพประกอบเพลงและการถ่ายภาพ
ประกอบด้วยสื่อ สิ่งมีชีวิตที่ผลิตควน tities สำคัญของเอทานอล แม้ว่าแปลงได้ค่อนข้างริม-ited แม้ว่าสิ่งมีชีวิตที่ถูกแสดงเพื่อสร้างการเชื่อมโยงเซลล์ P-galactosidase กิจกรรม (EC 3.2.1.23) ' มันถูกแสดงในระหว่างการศึกษาว่า ผลแห้งเสริมกลางกับเอนไซม์ที่ได้มาจากคุณ marxianus IMB3 homogenized เป็นกลุ่มเซลล์ในการผลิตเอทานอลที่เพิ่มขึ้นจากการย่อยแลคโตส และข้อจำกัดในการผลิตเอทานอลในสื่อ unsupplemented ได้ postulated เป็นผล inac-tivation ของเอนไซม์ exogenously เพิ่มที่ 45 องศาเซลเซียส ในการศึกษานี้เราอธิบายแยกของ ac-tivity P-galactosidase จากคุณ marxianus IMB3 ปลูกในแล็กโทส - ประกอบด้วยสื่อที่ 45 " C และรายงานเกี่ยวกับ charac-terization บางส่วนของกิจกรรมนั้น
วิธีการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์และวัสดุ
marxianus Kluyveromyces IMB3 มีอยู่ในข้าวมอลต์สกัด agar ที่ 45 องศาเซลเซียส สิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกในวัฒนธรรมน้ำท่วมน้ำปั่นที่ประกอบด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อยีสต์เป็นอธิบาย previ-0us1y, ~ ยกเว้นว่าซูโครสถูกแทนที่ ด้วยแล็กโทส [2% (w/v)] น้ำถูก incubated ในเชคเกอร์การโคจรที่ 45 องศาเซลเซียส
สกัด P-galactosidase
เซลล์เก็บเกี่ยว โดย centrifugation ที่ 36 h และล้างใน 0.1 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 เซลล์ถูก homogenized เป็นกลุ่มใน 01 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 ใช้ homoge-nizer เป็น Braun พร้อมลูกปัดแก้วตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ' Homoge-nates ได้ขึ้ โดย centrifugation ที่ 10000 g 30 นาที และเข้มข้น โดยเส้นทางผ่านเมมเบรน ultrafiltra-สเตรชันตัดยอด KDa 100000 การดึงข้อมูลถูกเก็บไว้ที่ - 20 องศาเซลเซียส ทดสอบ
@Galactosidase
กิจกรรมที่ถูกกำหนด โดยวิเคราะห์ที่ 30° C ใช้พื้นผิว o-ni-trophenyl-P-D-galactoside 50 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 เอนไซม์จะแสดงเป็น kmoles เป็น nitrophenol pro-duced ต่อนาทีละ milliliter ของตัวอย่าง กำหนดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้ method.8 อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ใช้ tose ลัคเป็นพื้นผิว ปฏิกิริยาประกอบด้วยสมาธิที่เกี่ยวข้องของพื้นผิวในหมู่ 50 โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 Assays ดำเนินที่ 3O "C หลังจากที่ความเข้มข้นของกลูโคสที่ผลิตได้กำหนดใช้ชุด oxidase peroxidase กลูโคสผลิต โดย Boehringer มันน์ไฮม์ GmbH (เยอรมนี) ac-cordance คำแนะนำของผู้ผลิต
Electrophoresis ไล่ระดับสีเจ nondenaturing pofyacrylamide
Polyacrylamide electrophoresis เจลไล่ระดับสี (PAGGE) ถูกต่อ - รูปแบบอธิบายเป็นหลัก previously.9 Electrophoresis ทำออกใช้เจ 4-15% 200 V min IO ต่อแอพลิเคชันของตัวอย่าง ในเวลาต่อมา ใช้เงื่อนไขถูกเปลี่ยน 150 V และ electrophoresis ได้รับอนุญาตให้ต่อ 1.5 h.
กระบวนการย้อมสี zymogram P-Galactosidase
เจจะมีสีอยู่ในพื้นผิวโซลูชัน (หมู่ที่ 5 จาก-ylumbelliferyl-P-D-galactoside ใน 50 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0) และ incubated สำหรับ 2-5 h ที่อุณหภูมิห้อง
ความมุ่งมั่นของเอทานอล
ตัวอย่างเก็บเกี่ยวผลผลิตจากการหมักแหนมได้วิเคราะห์เนื้อหาเอทานอลโดยใช้ chromatograph ก๊าซ (GLC 8410 เพอร์เอลเมอ) เป็น previously.6 อธิบาย
ผลิตผลของ P-galactosidase ในระหว่างการเจริญเติบโตของคุณ marxianus IMB3 กลูโคสและแล็กโทสประกอบด้วยสื่อ
สิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกในสื่อประกอบด้วย 2% (w/v) แล็กโทสและกลูโคส และตัวอย่างที่เก็บเกี่ยวในช่วงเวลาต่าง ๆ ที่วิเคราะห์สำหรับ P-galactosidase กิจกรรมเชื่อมโยงเซลล์ ผลลัพธ์จะแสดงในรูปที่ 1 สิ่งมีชีวิตที่ถูกแสดงในการผลิตเอนไซม์ที่ 20 ถึง 25 h สูงสุดยอดทั้งในสื่อที่ประกอบด้วยกลูโคส และแล็กโทส ในกรณีของการผลิตเอนไซม์จากสิ่งมีชีวิตในน้ำตาลกลูโคสประกอบด้วยสื่อ จำนวนเอนไซม์ต่ำ แต่ที่สำคัญ ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำว่า สิ่งมีชีวิตที่มีความสามารถในโป ducing ต่ำ ขึ้นยอดของกิจกรรมในต่อหน้าของกลูโคส กิจกรรมไม่พบในวัฒนธรรม extracellular supematants เมื่อปลูกในกลูโคส 2% (w/v) ที่สิ่งมีชีวิตโป-duced ความเข้มข้นสูงสุดของ 8.5 g l 1 เอทานอล (ฟิก-ure 2), ซึ่งแสดงถึง 83% ของค่าสูงสุดที่ทฤษฎีผลผลิต เมื่อสิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกในสื่อประกอบด้วยแล็กโทส 2% (w/v) ยอดสูงสุดของเอทานอลโปร-duced พบเป็น 4 g l-l ซึ่งแสดงถึง 39% ของผลผลิตทางทฤษฎีสูงสุด มุมมองการค้นหาหลัง เราตัดสินใจที่จะแยก และเพิ่มเติม ลักษณะกิจกรรม P-galac-tosidase ที่ผลิตในระหว่างการเจริญเติบโตบนประกอบด้วยแล็กโทส โดยสิ่งมีชีวิตที่สื่อ
รูป 1 การผลิตของ p-galactosidase กิจกรรมในระหว่างการเจริญเติบโตของ Kluyveromyces marxianus IMB3 (0) กลูโคสและแล็กโทส (0) ประกอบด้วยสื่อ ตัวอย่างถูกเก็บเกี่ยวในการระบุเวลา และเซลล์ถูก homogenized เป็นกลุ่มตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ กิจกรรมจะแสดงในหน่วยต่อโปรตีน milligram
เอนไซม์ Microb Technol., 1995 ปี 17, 697 สิงหาคม
กระดาษ
7.5
5
2.5
0
TERll' ("C)
ผลิตเอทานอล 2 รูปในระหว่างการเจริญเติบโตของ Kluyveromyces marxianos IMB3 (0) แล็กโทสและกลูโคส (Cl) ประกอบด้วยฉัน-
รูปที่ 3 ผลของอุณหภูมิในการเชื่อมโยงเซลล์ l3-galac -
dia
tosidase กิจกรรมผลิตในระหว่างการเจริญเติบโตของสื่อ Kluyveromyces marxianus IMB3 บนประกอบด้วยแล็กโทส
คุณสมบัติบางส่วนของ f3-galactosidase ผลิต โดย marxianus คุณในระหว่างการเจริญเติบโตบนประกอบด้วยแล็กโทสสื่อ
สนทนา
เซลล์ถูกเก็บเกี่ยว และ P-galactosidase ได้แยกตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ จำแนกบางส่วนประกอบด้วยตรวจสอบอุณหภูมิและค่า pH เหมาะสมของ ac-tivity กับเสถียรภาพของความร้อนที่หลากหลาย peratures ยการ กิจกรรมนี้ถูกลักษณะกับ K ของ ใช้แล็กโทสและ o-nitrophenyl-P-D-galactoside เป็นพื้นผิว กิจกรรมที่พบจะมีอุณหภูมิค่อนข้างกว้างเหมาะสมระหว่าง 40 และ 50 ° C กับกิจกรรมลดค่อนข้างรวดเร็วที่อุณหภูมิสูงกว่านี้ (รูปที่ 3)
แม้ว่า แสดงว่าก่อนหน้านี้ ยีสต์ thermotolerant marxianus คุณ IMB3 มีความสามารถในการผลิตเอทานอลในการย่อยแลคโตสที่ประกอบด้วยสื่อที่ 45 " C ระดับของเอทานอลโปร
เราพบว่าในขณะที่กิจกรรมที่มีเสถียรภาพสำหรับน้อย 7 h ที่ 3O "C มันมีครึ่งชีวิต 15 และ 5 นาทีที่ 45 และ 5O" C ตามลำดับ กิจกรรมที่แสดงให้มีค่า pH ค่อนข้างคมที่ peaked ที่ pH 7.5 กิจกรรมที่แสดงยังแสดงมองตองขั้นธรรมดากี่-netics และพบมี K 5 และ 40 มม.ใช้ o-nitrophenyl-P-D-galactoside และแล็กโทสเป็นพื้นผิว re-spectively
วิเคราะห์เซลล์สารสกัดจาก nondenaturing PAGGE และ zymogram ย้อมสีสำหรับกิจกรรม f3-galactosidase
สารสกัดจากเซลล์ดิบใช้การ polyacrylamide gels ไล่ระดับตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ ความละเอียดต่อไปนี้ด้วย เจมีสี โดยบ่มกับ 1 หมู่ methylumbelliferyl-P-D-galactoside ในสถานะและ ab-sence ของแล็กโทส 2% (w/v) ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูปที่ 4 ตรวจพบสองชัดเจน discemable วง นอกจากนี้ ยับยั้งแตกต่างเกิดขึ้นในสัญญาณได้รับในต่อหน้าของแล็กโทส (รูปที่ 4, 2 เลน), จึง sug gesting ไซต์ใช้งานคล้ายกันสำหรับทั้งพื้นผิว
คิดวิเคราะห์ด้วย 4 ของน้ำมัน เชื่อม โยงเซลล์ p-galactosidase ผลิตในระหว่างการเจริญเติบโตของสื่อ Kluyveromyces marxianus IMB3 บนประกอบด้วยแล็กโทส Aliquots ของแซมเปิ้ลประกอบด้วย pg 50 โปรตีนถูกกับแต่ละเลนการ polyacrylamide ไล่ระดับเจ (ดูวิธี); ต่อ electro-phoresis เจถูกแช่อยู่ใน 1 tIM methylumbelliferyl-P-o-galactoside ขาด (1 เลน) และสถานะ (2 เลน) ของแล็กโทส 2% (w/v) แถบงานถูก visualized ใช้ UV transilluminator
Microb เอนไซม์ 696 Technol., 1995 ปี 17 สิงหาคม
duced จะค่อนข้างต่ำ มันได้ถูกแสดงว่า สิ่งมีชีวิต thermotolerant ผลิต B ga lactosidase กิจกรรมเชื่อมโยงเซลล์' ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำว่า ชานลิมิ-tation ในเอทานอลผลิตเป็นผลมาจาก inaccessibility ของพื้นผิวการเอนไซม์ เป็นฟังก์ชันของแล็กโทสรายการลง ในเซลล์ หรือ จากการยกเลิกการเรียกความร้อนของ P-ga-lactosidase ออกจากเซลล์ในการเจริญเติบโตที่ 45 องศาเซลเซียส ผลลัพธ์ที่แสดงที่นี่ ด้วย thermotolerant stra

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แนะนำสำหรับบางเวลา แลคโตส ในเวย์ ได้รับการยอมรับว่าเป็นอุดมคติวัสดุการผลิต ทั้งเชื้อเพลิงและเครื่องดื่มเอทานอลผ่านการหมัก ' ที่มีประสิทธิภาพการแปลงและกระบวนการออกแบบได้ถูกขัดขวางโดยข้อเท็จจริงที่ครุ่นคิด - tion ของแลคโตสในเวย์ค่อนข้างต่ำและค่อนข้างน้อยหมักยีสต์ มีความสามารถในการใช้ทางเลือกที่พบมากที่สุดที่จะใช้สายพันธุ์ดั้งเดิมของ Saccharomyces cerevisiae ร่วมกับ exogenously เพิ่ม
ที่อยู่พิมพ์ขอให้กลุ่มชีวภาพ ดร. แมเฮล , โรงเรียนวิชาชีววิทยาและเคมีคลุม , มหาวิทยาลัย , โคล - เรนท์ ทำซ่า บริษัท เดอ ไอร์แลนด์เหนือ ได้รับ 29 กรกฎาคม 1994 ; แก้ไข 8 พฤศจิกายน 2537 ; ยอมรับ 18 พฤศจิกายน 1994
เอนไซม์รวมสายพันธุ์ของ kluyveromyces ถึงแม้ว่าเหล่านี้มีความสามารถในการทํางานที่อุณหภูมิ > 37 " C . มันได้รับการแนะนำว่าใช้หางนมเข้มข้นจะได้รับการคาดหวังที่จะเอาชนะปัญหาที่เกี่ยวข้องกับต่ำคอน - centrations ของ lactose2 ; แต่นี้เป็นปัญหาที่ sociated กับแล็กโตส intolerance ของก่อนหน้านี้ใช้สายพันธุ์ของ kluyveromyces marxianus 3 ดังนั้น ,มีต้อง ment สำหรับสายพันธุ์ยีสต์ที่มีความสามารถในการทำงานที่อุณหภูมิสูง เป็นผลจากการฟื้นตัวจากเวย์ fermentations เอทานอลอย่างต่อเนื่องที่อุณหภูมิสูง , Re - quirement สำหรับความเข้มข้นของการเตรียมเวย์จะถูกยกเลิก ชุดของสายพันธุ์ทนของ K . marxianus ถูกโดดเดี่ยว และหนึ่งในนั้น imb3 สายพันธุ์ ,มีรายงานว่า จะสามารถผลิตเอทานอลที่ 45 ° C ในช่วงการเจริญเติบโตในกลูโคส ซูโครสที่ 5 , 6 และ แลคโตส - ที่มีสื่อ ' ด้วยความเคารพของแลคโตส -
เอนไซม์และจุลินทรีย์ เทคโนโลยี 17:69 & 699 , 0 2538 2538 โดย Elsevier Science Inc 655 ถนนของอเมริกา , นิวยอร์ก , นิวยอร์ก .
0141-0229 / 95 / $ 10.00 บริการ 0141-0229 ( 94 ) 00115-8
กิจกรรม p-galactosidase การผลิต : 0เบรดี้ et al .
เจลถูกโอนไปยัง UV transilluminator สำหรับภาพและการถ่ายภาพ
ที่มีสื่อ , สิ่งมีชีวิตที่ผลิตได้มาเฉวียน - Tities เอทานอลแม้ว่าการแปลงเป็นค่อนข้างลิม - ited แม้ว่าสิ่งมีชีวิตแสดงการผลิตเซลล์ที่เกี่ยวข้องกิจกรรม p-galactosidase ( EC 3.2.1.23 )' พบระหว่างการศึกษาว่า การเสริมอาหารที่มีเอนไซม์ที่ได้จากเซลล์ของ K . marxianus โฮโม imb3 ทำให้เพิ่มการผลิตเอทานอลจากแลคโตส และข้อจำกัดในการผลิตเอทานอลในสื่อซึ่งได้รับผลมาจาก inac - tivation ของเพิ่ม exogenously เอนไซม์ที่ 45 องศาในการศึกษานี้เราอธิบายการแยกของ tivity p-galactosidase AC - จาก K . marxianus imb3 เติบโต แลคโตส - ที่มีสื่อที่ 45 " C , และรายงานเกี่ยวกับ charac - terization บางส่วนของกิจกรรมที่
วัสดุและวิธีการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์
kluyveromyces marxianus imb3 malt extract agar คือ รักษาที่อุณหภูมิ 45 องศาอินทรีย์ที่ปลูกในเหลวในขวดเขย่าที่มีขนาดกลางการเจริญเติบโตของยีสต์ตามที่อธิบายไว้ previ - 0us1y ~ ยกเว้นซูโครสถูกแทนที่โดยแล็กโตส [ 2 % ( w / v ) ] ถูกบ่มในขวดเขย่า วงโคจรที่ 45 องศา p-galactosidase

การสกัดเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 36 ชั่วโมงและล้างใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 . เซลล์มีการบดใน 01 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 ใช้บร homoge - nizer ด้วยกันกับลูกปัดแก้วตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ . ' homoge - บั้นท้ายได้ชี้แจงโดยการเหวี่ยงแยกที่ 10 , 000 G สำหรับ 30 นาที และเข้มข้น โดยผ่านการเป็น 100000 ) ultrafiltra , เมมเบรน สารสกัดที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ - 20 องศา C .
@
galactosidase การทดสอบกิจกรรมที่กำหนดโดยวิธีที่ 30 องศา C โดยใช้พื้นผิว o-ni - trophenyl-p-d-galactoside 50 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 . กิจกรรมของเอนไซม์จะแสดงเป็น kmoles a-nitrophenol Pro - duced ต่อนาทีต่อมิลลิลิตรของตัวอย่าง ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยใช้วิธีการที่อธิบายก่อนหน้านี้ 8 ใช้ครั่ง - tose เป็นตั้งต้นปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องคือ ความเข้มข้นของสารอาหารใน 50 หมู่ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 . จำนวนที่พบ 30 " C , หลังจากที่ความเข้มข้นของกลูโคสที่ผลิตได้ถูกกำหนดโดยใช้เอนไซม์ กลูโคสชุดผลิตโดย Boehringer Mannheim , GmbH ( เยอรมัน ) ใน AC - คอร์แดนซ์กับคำแนะนำของผู้ผลิต
เมื่อ pofyacrylamide ลาดเจล
polyacrylamide gel electrophoresis ( pagge ) คือ การต่อขึ้นเป็นหลักตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ คือ 9 electrophoresis โดยใช้ 4-19 % เจลที่ 200 V สำหรับ IO มินตามการตัวอย่าง ต่อมาใช้เงื่อนไขเปลี่ยนไป 150 V และ electrophoresis ได้รับอนุญาตต่อ 1.5
hทดลองย้อมสี p-galactosidase ขั้นตอน
เจลจะติดอยู่ในหลากหลายโซลูชั่น ( 5 หมู่เมท - ylumbelliferyl-p-d-galactoside 50 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ) และบ่มเป็นเวลา 2 ถึง 3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง

หาตัวอย่างเอทานอลจากการเก็บเกี่ยว fermentations วิเคราะห์ปริมาณเอทานอลโดยใช้แก๊สโครมาโตกราฟ ( glc 8410 ;เพอร์กินเอลเมอร์ ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 6
ผลการผลิต p-galactosidase ในระหว่างการเจริญเติบโตของ K . imb3 marxianus ในกลูโคสและแล็กโตสที่มีสื่อ
สิ่งมีชีวิตโตในสื่อที่มี 2 % ( w / v ) แลคโตส และกลูโคส และตัวอย่างที่เก็บเกี่ยวในช่วงเวลาต่าง ๆ วิเคราะห์เซลล์ที่เกี่ยวข้อง p-galactosidase กิจกรรม ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูปที่ 1สิ่งมีชีวิตที่ถูกแสดงเพื่อผลิตปริมาณของเอนไซม์สูงสุดที่ 20 ถึง 25 ชั่วโมง ทั้งใน และ แลคโตส ที่มีสื่อ ในกรณีของการผลิตเอนไซม์โดยสิ่งมีชีวิตในกลูโคสที่มีสื่อ , ปริมาณของเอนไซม์ต่ำ แต่ที่สำคัญ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าสิ่งมีชีวิตสามารถ Pro ducing ต่ำ , และปริมาณของกิจกรรมในการแสดงตนของกลูโคสไม่มีกิจกรรมที่ตรวจพบในวัฒนธรรมและ supematants . เมื่อปลูกใน 2 % ( w / v ) กลูโคส สิ่งมีชีวิต Pro - duced สูงสุด 8.5 กรัมต่อลิตรความเข้มข้นของเอทานอล ( มะเดื่อ - ที่มี - 1 2 ) ซึ่งแสดง 83 % ของทฤษฎีสูงสุด ผลผลิต เมื่อสิ่งมีชีวิตถูกปลูกในสื่อที่มี 2 % ( w / v ) แลคโตส ยอดสูงสุดของเอทานอล Pro - duced ถูกพบว่าเป็นฉัน - 4 กรัมซึ่งแสดงถึง 39% ของทฤษฎีสูงสุด ผลผลิต ในมุมมองของหลังหาเราตัดสินใจที่จะแยกและเพิ่มเติมลักษณะ p-galac - กิจกรรม tosidase ที่ผลิตโดยสิ่งมีชีวิตในระหว่างการเจริญเติบโตในภาวะที่มีสื่อ
รูปที่ 1 การผลิตกิจกรรม p-galactosidase ในระหว่างการเจริญเติบโตของ kluyveromyces marxianus imb3 กลูโคส ( 0 ) และแลคโตส ( 0 ) ที่มี สื่อจำนวนที่พบเวลาเก็บเกี่ยวและเซลล์เป็นโฮโมตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ กิจกรรมจะแสดงในหน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีน .
เอนไซม์ microb . Technol . , 1995 , 17 ฉบับ สิงหาคมแล้ว



2.5 5 7.5 เอกสาร
0
terll ' ( " C )
รูปที่ 2 การผลิตเอทานอลในช่วงการเจริญเติบโตของ kluyveromyces marxianos imb3 ในแลคโตส ( 0 ) และกลูโคส ( CL ) ที่มี ฉัน -
รูปที่ 3 ผลของอุณหภูมิต่อเซลล์ที่เกี่ยวข้อง galac - L3

tosidase Dia กิจกรรมผลิตในระหว่างการเจริญเติบโตของ kluyveromyces marxianus imb3 ในแลคโตสที่มีสื่อ
บางส่วนลักษณะของ F3 galactosidase ผลิตโดย K . marxianus ในระหว่างการเจริญเติบโตในภาวะที่มีการสื่อ

เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและ p-galactosidase ได้อธิบายไว้ในวิธีการการตรวจสอบบางส่วน ได้แก่ อุณหภูมิ และ pH ที่เหมาะสมของ AC - tivity ร่วมกับเสถียรภาพทางความร้อนที่หลากหลายแบบ - peratures . กิจกรรมนี้มีลักษณะส่วนของ K , , , ใช้ทั้ง แลคโตส กับ o-nitrophenyl-p-d-galactoside เป็นทกิจกรรมพบว่ามีค่อนข้างกว้าง อุณหภูมิที่เหมาะสมอยู่ระหว่าง 40 และ 50 องศา C กับกิจกรรมลดลงค่อนข้างอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิข้างบนนี้ ( รูปที่ 3 )
ถึงแม้ว่าก่อนหน้านี้แสดง ' สารยีสต์ K . marxianus imb3 คือความสามารถในการผลิตเอทานอลในภาวะที่มีสื่อที่ 45 " C , ระดับของเอทานอล Pro -
เราพบว่าในขณะที่มีกิจกรรมอย่างน้อย 7 H ที่ 30 " C มันมีครึ่งชีวิตของ 15 และ 5 นาทีที่ 45 และ 5o " C ตามลำดับ กิจกรรมแสดงได้ค่อนข้างคม Ph โปรไฟล์ที่แหลมที่ pH 7.5 . กิจกรรมยังแสดงเพื่อแสดงปกติมาก Menton กิ - netics และพบว่ามี K , , ,5 และ 40 มิลลิเมตร และใช้ o-nitrophenyl-p-d-galactoside แลคโตสเป็นพื้นผิว Re - spectively .
วิเคราะห์เซลล์และสารสกัดที่ใช้ทดลอง เมื่อ pagge staining สำหรับ F3 galactosidase กิจกรรม
ดิบเซลล์สารสกัดเพื่อใช้ในการไล่ระดับอะคริลาไมด์เจลตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ ตามรูปแบบความละเอียด ,เจลใช้ย้อมโดยการบ่มด้วย 1 หมู่ methylumbelliferyl-p-d-galactoside ในการแสดงและ AB - ความรู้สึกของ 2 % ( w / v ) แลกโตส ผลที่ได้แสดงไว้ในรูปที่ 4 ; สองอย่างชัดเจน discemable วงถูกตรวจพบ นอกจากนี้ การยับยั้งที่แตกต่างกันที่เกิดขึ้นในสัญญาณที่ได้รับในการแสดงตนของแลคโตส ( รูปที่ 4 ซอย 2 ) จึงซุก - gesting ไซต์งานเดียวกันทั้งท
รูปที่ 4 การวิเคราะห์รูปแบบของน้ำมันดิบ เซลล์ที่เกี่ยวข้อง p-galactosidase ผลิตในระหว่างการเจริญเติบโตของ kluyveromyces marxianus imb3 แล็กโตสที่มีต่อสื่อ เฉยๆของแซมเปิ้ลที่มี 50 - PG ของโปรตีนที่ใช้ในแต่ละช่องทางของอะคริลาไมด์เจลสี ( ดูวิธีการ ) ; ตาม Electro - กุ้งเจลถูกแช่ใน 1 t ?ผม 45 กิโลดาลตัน p-o-galactoside ในการขาดงาน ( ช่องที่ 1 ) และสถานะ ( ซอย 2 ) 2 % ( w / v ) แลกโตส วงดนตรีที่ใช้งานได้มองเห็นการใช้ UV transilluminator
696 เอนไซม์ microb . Technol . , 1995 , 17 ฉบับ สิงหาคม
duced ค่อนข้างน้อย มันยังแสดงให้เห็นว่าสารอินทรีย์ผลิตเซลล์ที่เกี่ยวข้อง b-ga - กิจกรรม lactosidase .ผลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า สำนักงานใหญ่ - tation ในการผลิตเอทานอลที่เป็นผลมาจากความฉลาดของวัสดุ เอนไซม์ เป็นฟังก์ชันของการเข้าไปในเซลล์ หรือผลของการยับยั้งความร้อนของ p-ga - lactosidase ออกจากเซลล์ในช่วงการเจริญเติบโตที่ 45 องศา ผลลัพธ์ที่แสดงที่นี่ด้วยเ ทน