T-RFLP analysis. The eubacterial pr

T-RFLP analysis. The eubacterial primers 8f (59), labeled at the 59 end with 6-carboxyfluorescein (6-Fam; MWG), and 518r (38) were used to amplify approximately 530 bp of the 16S rRNA gene. The reactions were carried out with a PTC-100 thermocycler (MJ Research, Inc.), applying an initial denaturation step of 5 min at 95°C followed by 35 cycles of 30 s at 95°C, 1 min of annealing at 54°C, and 2 min of extension at 72°C. The PCR mixtures (50 ml) contained 13 reaction buffer (Gibco, BRL); 200 mM (each) dATP, dCTP, dGTP, and dTTP;0.15 mM (each) primer; 3 mM MgCl2; 2.5 U of Taq DNA polymerase (Gibco,BRL); and 20 ng of template DNA. PCR products (10 ml [approximately 250 ng of DNA]) were digested for 2 h in 20 ml with 10 U of a combination of the restriction enzymes HhaI and HaeIII (Gibco, BRL). Preliminary experiments with several restriction enzymes with 4-bp recognition sites (AluI, MspI, RsaI,HhaI, and HaeIII; Gibco, BRL) demonstrated that a combination of HaeIII and HhaI yielded a higher number of terminal restriction fragments (T-RFs) than other enzymes. Aliquots (1 ml) were mixed with 0.16 ml of deionized formamide,0.83 ml of loading buffer (Perkin-Elmer), and 0.3 ml of DNA fragment length standard (Genescan 500 Rox; Perkin-Elmer). The reaction mixtures were denatured at 92°C for 2 min and chilled on ice prior to electrophoresis. Samples (1.5 ml) were run on 5% denaturing polyacrylamide gels, and the fluorescently labeled terminal restriction sizes were analyzed with an ABI 373A automated
DNA sequencer (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif.). The lengths of the labeled fragments were determined by comparison with the internal standard

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การวิเคราะห์ T RFLP 8f ไพรเมอร์ eubacterial (59), ป้ายท้าย 59 กับ 6-carboxyfluorescein (6-Fam MWG), และ 518r (38) ใช้ขยายประมาณ 530 bp 16S rRNA ยีน ปฏิกิริยาที่ถูกดำเนินการ ด้วย thermocycler PTC-100 (MJ วิจัย Inc.), ใช้ขั้นตอน denaturation เริ่มต้นเป็น 5 นาทีที่ 95° C ตามรอบ 35 30 s ที่ 95° C, 1 นาทีของการอบเหนียว ที่ 54° C และ นาทีที่ 2 ของส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียส น้ำยาผสม PCR (50 มล) ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 13 (Gibco, BRL); มม. 200 (แต่ละ) dATP, dCTP, dGTP และ dTTP พื้น 0.15 มม. (แต่ละ) 3 มม. MgCl2 2.5 U ของ Taq DNA พอลิเมอเรส (Gibco, BRL); และ 20 ng ของแม่แบบดีเอ็นเอ ผลิตภัณฑ์ PCR (10 ml [ประมาณ 250 ng เอ็น]) ถูกต้องสำหรับ h 2 ใน 20 ml กับ 10 ยูรวมกันของเอนไซม์จำกัด HhaI และ HaeIII (Gibco, BRL) การทดลองเบื้องต้นกับเอนไซม์จำกัดหลายไซต์รู้ 4-bp (AluI, MspI, RsaI, HhaI และ HaeIII Gibco, BRL) แสดงว่า HaeIII และ HhaI ให้ผลสูงกว่าจำนวนชิ้นส่วนของเทอร์มินัลจำกัด (T-RFs) กว่าเอนไซม์อื่น ๆ Aliquots (1 ml) รวมกับมล 0.16 ของ deionized formamide, ml 0.83 ของโหลดบัฟเฟอร์ (เพอร์เอลเมอ), และ 0.3 ml ของดีเอ็นเอส่วนความยาวมาตรฐาน (Genescan 500 Rox Perkin-Elmer) น้ำยาผสมปฏิกิริยาถูก denatured ที่ 92° C สำหรับ 2 นาที และแช่ในน้ำแข็งก่อน electrophoresis ตัวอย่าง (1.5 ml) ถูกเรียกใช้บน denaturing polyacrylamide gels 5% และขนาดป้าย fluorescently เทอร์มินัลจำกัดได้วิเคราะห์ ด้วย ABI 373A อัตโนมัติDNA sequencer (Biosystems ใช้ใน PE, Inc. ฟอสเตอร์ซิตี้ รัฐแคลิฟอร์เนีย) มีกำหนดความยาวของชิ้นส่วนป้าย by comparison with มาตรฐานภายใน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์ T-RFLP ไพรเมอร์ที่ 8 eubacterial (59) ป้ายที่ปลาย 59 กับ 6 carboxyfluorescein (6-Fam; MWG) และ 518r (38) ถูกนำมาใช้เพื่อขยายประมาณ 530 bp ของยีน 16S rRNA ปฏิกิริยาได้ดำเนินการกับ PTC-100 thermocycler (MJ วิจัย, Inc) ใช้เป็นขั้นตอนแรกของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ 5 นาทีที่ 95 ° C ตามด้วย 35 รอบของ 30 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียส 1 นาทีของการอบที่ 54 ° C และ 2 นาทีของการขยายที่ 72 ° C ผสม PCR (50 มล.) ที่มี 13 บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา (Gibco, BRL); 200 มิลลิ (แต่ละคน) dATP, dCTP, dGTP และ dTTP; 0.15 มิลลิ (แต่ละคน) ไพรเมอร์; 3 มิลลิ MgCl2; 2.5 U ของดีเอ็นเอโพลิเมอร์ Taq (Gibco, BRL); และ 20 นาโนกรัมดีเอ็นเอแม่แบบ ผลิตภัณฑ์ PCR (10 มล. [ประมาณ 250 นาโนกรัมดีเอ็นเอ]) ถูกย่อยเป็นเวลา 2 ชั่วโมง 20 มล. 10 U ของการรวมกันของเอนไซม์ข้อ จำกัด HhaI และ HaeIII (Gibco, BRL) การทดลองเบื้องต้นกับเอนไซม์ข้อ จำกัด หลายกับเว็บไซต์ที่ได้รับการยอมรับ 4 bp (AluI, MspI, RsaI, HhaI และ HaeIII; Gibco, BRL) แสดงให้เห็นว่าการรวมกันของ HaeIII และ HhaI ผลจำนวนที่สูงขึ้นของชิ้นส่วนข้อ จำกัด ขั้ว (T-RFs) มากกว่า เอนไซม์อื่น ๆ aliquots (1 มล.) ได้รับการผสมกับ 0.16 มิลลิลิตร formamide ปราศจากไอออน, 0.83 มล. ของบัฟเฟอร์โหลด (เพอร์กินเอลเมอ) และ 0.3 มล. ความยาวของชิ้นดีเอ็นเอมาตรฐาน (Genescan 500 Rox; เพอร์กินเอลเมอ) ผสมปฏิกิริยาถูกเอทิลแอลกอฮอล์ที่ 92 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีและแช่เย็นบนน้ำแข็งก่อนที่จะ electrophoresis ตัวอย่าง (1.5 มล.) ได้รับการทำงานใน 5% denaturing เจลอะคริเลตและสถานีที่มีข้อความ fluorescently ขนาดข้อ จำกัด ที่ได้มาวิเคราะห์ด้วย ABI 373A
อัตโนมัติซีเควนดีเอ็นเอ(PE Applied Biosystems, Inc, ฟอสเตอร์ซิตี้รัฐแคลิฟอร์เนีย.) ความยาวของชิ้นส่วนที่มีข้อความที่ถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบกับมาตรฐานภายใน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์ t-rflp . การ eubacterial 8f PCR ( 59 ) , ข้อความที่ 59 ลงท้ายด้วย 6-carboxyfluorescein ( 6-fam ; mwg ) และ 518r ( 38 ) ถูกใช้เพื่อขยายประมาณ 530 BP ของ 16S rRNA ยีน ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นด้วย ptc-100 เทอร์มอไซเคล ์ ( การวิจัย MJ อิงค์ ) เป็นขั้นตอนแรกของการใช้ ( 5 นาทีที่ 95 องศา C ตามด้วย 35 รอบ 30 s ที่ 95 องศา C , 1 นาทีของการอบอ่อนที่ 54 ° Cและ 2 นาทีที่ 72 ° C ต่อเชื้อผสม ( 50 มล. ) มีปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ ( gibco 13 , 200 มิลลิเมตร ( BRL ) ; datp dctp dgtp แต่ละ ) , , , และ dttp ; 0.15 มม. ( แต่ละ ) ไพรเมอร์ 3 มม. ชุด ; 2.5 U ของดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( gibco BRL , ) ; และ 20 นาโนดีเอ็นเอแม่แบบผลิตภัณฑ์ PCR ( 10 ml [ ประมาณ 250 นาโนดีเอ็นเอ ] ) ถูกย่อยได้ 2 ชั่วโมง 20 ml กับ 10 U ของการรวมกันของเอนไซม์และ hhai haeiii ( gibco BRL , ) การทดลองเบื้องต้นกับเอนไซม์จำกัดหลายเว็บไซต์จะยอมรับ 4-bp ( โดยใช้ rsai hhai , , , , และ gibco haeiii ; ,BRL ) พบว่า การรวมกันของ haeiii hhai และพบว่าปริมาณเศษเทอร์มินัลจำกัด ( t-rfs ) กว่าเอนไซม์อื่น ๆ เฉยๆ ( 1 มิลลิลิตรผสมกับ 0.16 มล. คล้ายเนื้อเยื่อประสาน Formamide , 0.83 กรัมโหลดบัฟเฟอร์ ( เพอร์กินเอลเมอร์ ) และ 0.3 มล. ของดีเอ็นเอความยาวมาตรฐาน ( genescan 500 Rox ; เพอร์กินเอลเมอร์ )ปฏิกิริยาผสมอยู่ที่ 92 องศา C ใช้สำหรับ 2 นาทีและเย็นบนน้ำแข็งก่อนโตรโฟรีซีส ตัวอย่าง ( 1.5 มิลลิลิตร วิ่งบน 5 % โพลีอะคริลาไมด์เจลี่ และ fluorescently ป้ายเทอร์มินัลจำกัดขนาดวิเคราะห์กับอบิ 373a จัดลำดับดีเอ็นเออัตโนมัติ
( PE APPLIED BIOSYSTEMS ( Foster City ( )ความยาวของป้ายชิ้นส่วนถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบกับมาตรฐานภายใน