3.2.1. Ion Exchange ChromatographyI

3.2.1. Ion Exchange Chromatography

Ion exchange chromatography separates proteins based on their surface ionic charge using resin that are modified with either positively-charged or negatively-charged chemical groups [4, 7]. Most proteins have an overall negative or positive charge depending on their isoelectric point (pI) at a given pH, which makes them possible to interact with an opposite charged chromatographic matrix [7]. If the net charge of the protein is positive at a pH below pI value, the protein will bind to a cation exchanger; at a pH above the pI value the net charge of the protein is negative and the protein will bind to an anion exchanger [38].

Proteins that interact weakly with the resins, for example a weak positively charged protein passed over resin modified with a negatively charged group, are eluted out in a low-salt buffer. On the other hand, proteins that interact strongly required more salt to be eluted. Proteins with very similar charge characteristics can be separated into different fractions as they are eluted from the column by increasing the concentration of salt in elution buffer [7].

Ion exchange column is one of the technologies that utilized the principle of ion exchange chromatography [33]. It uses membrane-absorbent technology as a chromatographic matrix to separate proteins. The membrane absorbents in columns are stabilized cellulose-based with highly porous structure that provides proteins access to the charged surface easily. Interactions among molecules and active sites on the membrane happened in convective through-pores. Therefore, the adsorptive membranes have the potential to maintain high efficiencies when purifying large biomolecules with low diffusion [33].

3.2.2. Gel Filtration Chromatography

Gel filtration chromatography, also called size-exclusion or gel-permeation chromatography, separates proteins according to molecular sizes and shape and the molecules do not bind to the chromatography medium [39]. It is a process in which large molecules passes through the column faster than small molecules. Small molecules can enter all of the tiny holes of the matrix and access more of the column. Small-sized proteins will pass through those holes and take more time to run out of the column compared with large-sized proteins that cannot get into those holes but run out directly of the column through void space in the column [4, 7].

Gel filtration chromatography kit applies the principle of gel filtration chromatography [40]. The target sample is applied on top of the column which contained porous beads, an example of matrix in the column. The molecules get separated when the molecules pass through the column of porous beads. The separation of molecules can be divided into three main types: total exclusion, selective permeation, and total permeation limit. Total exclusion is the part that large molecules cannot enter the pores and elute fast. For selective permeation region, intermediate molecules may enter the pores and may have an average residence time in the particles depending on their size and shape. As for total permeation limit, small molecules have the longest residence time once they enter the pores on the column [40]. An advantage of gel filtration-based chromatography is that it is suited for biomolecules that may be sensitive to pH changes, concentration of metal ions, and harsh environmental conditions [39].

3.2.3. Affinity Chromatography

Affinity chromatography depends on a specific interaction between the protein and the solid phase to affect separation from contaminants. It consists of the same steps as ion exchange chromatography [38]. It enables the purification of a protein on the basis of its biological function or individual chemical structure [41]. Proteins that have a high affinity towards the specific chemical groups such as ligands will covalently attach and bind to the column matrix while other proteins pass through the column [38]. Electrostatic or hydrophobic interactions, van der Waals’ forces and hydrogen bonding are the biological interactions between ligands and the target proteins [41]. The bound proteins will be eluted out from the column by a solution containing high concentration of soluble form of the ligand [36].

A biospecific ligand that can attach to a chromatography matrix covalently is one of the requirements for successful affinity purification. The binding between the ligand and target protein molecules must be reversible to allow the proteins to be removed in an active form [41]. After washing away the contaminants, the coupled ligand must retain its specific binding affinity for the target proteins. Some examples of biological interactions that are usually used in affinity chromatography are listed in Table 1 (see [41]).

tab1
Table 1: Typical biological interactions used in affinity chromatography [42].
Chromatographic separation by differential affinity to ligands immobilized on a beaded porous resin is fundamental to protein research [42]. A complete kit that contains pack beaded affinity resin columns based on principle of affinity chromatography has been introduced to the market [42]. An affinity resin can be used in batch or microcentrifuge spin column format depending on the scale and type of experiment to be carried out. Furthermore, it can be packed into some sort of larger gravity-flow column as well [42].

3.2.4. Gel Electrophoresis

Gel electrophoresis is a method to separate protein according to their size and charge properties. The partially purified protein from the chromatography separations can be further purified with nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), or native gel electrophoresis [4]. In PAGE, the proteins are driven by an applied current through a gelated matrix [43]. The movement of protein through this gel depends on the charge density (charge per unit of mass) of the molecules. The molecules with high density charge migrate rapidly. The size and shape of protein are another two important factors that influence PAGE fractionation [43]. The acrylamide pore size plays a role as a molecular sieve to separate different sizes of proteins [4]. The larger the protein, the slower it migrates as it becomes more entangled in the gel [43]. Shape is also one of the factors because compact globular proteins move faster than elongated fibrous proteins of comparable molecular mass [43].

PAGE is usually carried out in the presence of the sodium dodecyl sulfate (SDS) [44]. A protein treated with SDS will usually eliminate the secondary, tertiary and quarternary structure of protein [4, 7]. Proteins unfold into a similar rod-like shape because of the electrostatic repulsion between the bound SDS molecules. The number of SDS molecules which bind to a protein is approximately proportional to the protein’s molecular mass (about 1.4 g SDS/g protein) [43]. Each protein species has an equivalent charge density and is driven through the gel with the same force [43]. In addition, PAGE can minimize the denaturation of proteins. Many proteins still retain their biological activities after running PAGE [7]. However, larger proteins are held up to a greater degree than smaller proteins because the polyacrylamide is highly cross-linked [43]. Consequently, proteins become separated by SDS-PAGE on the basis of their molecular mass. SDS-PAGE can be used to determine the molecular mass of the mixture of proteins by comparing the positions of the bands to those produced by proteins of known size [43]. SDS used in electrophoresis resolve mixture of proteins according to the length of individual polypeptide chains [7].

A technique called two-dimensional gel electrophoresis was developed by Patrick O’Farrell in 1975. It is used to fractionate complex mixtures of proteins by using two different techniques—isoelectric focusing and SDS-PAGE [43]. First, proteins are separated according to their isoelectric point in a tubular gel. After this separation, the gel is removed and placed on top of a slab of SDS-saturated polyacrylamide. The proteins move into the slab gel and separated according to their molecular mass [43]. Two-dimensional gel electrophoresis is suitable to detect changes in proteins present in a cell under different conditions, at different stages in development or the cell cycle, or in different organisms [43].

3.2.5. Southwestern Blotting (Immunoblotting)

Southwestern blotting is a method that is used to isolate, identify, and characterize DNA-binding proteins by their ability in binding to specific oligonucleotide probes [44, 45]. Many of the DNA-binding proteins in the cell need to be isolated individually and characterized to define the gene function [44]. Three steps are involved in this method. First, nuclear protein extracts are separated by SDS-PAGE electrophoresis. Next, separated proteins are transferred to a nitrocellulose filter, polyvinylidene difluoride (PVDF) or cationic nylon membrane [12]. The filter will then be incubated with oligonucleotide probes to analyze the adsorbed proteins [44, 45]. However, this technique is beset with problems such as large amounts of nuclear proteins are required (typically 50–100 mg), protein degradation during isolation, facing difficulties in achieving efficient electrophoretic separation and transfer of a wide molecular size range of proteins [45].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.2.1 การแลกเปลี่ยนไอออน Chromatographyแลกเปลี่ยนไอออน chromatography แยกโปรตีนตามค่า ionic ของพื้นผิวโดยใช้ยางที่มีการปรับเปลี่ยน ด้วย คิดบวก หรือ คิดลบเคมีกลุ่ม [4, 7] โปรตีนส่วนใหญ่มีค่าธรรมเนียมรวมค่าลบ หรือค่าบวกขึ้นอยู่กับจุดของ isoelectric (pI) ในการกำหนดค่า pH ซึ่งทำให้พวกเขาสามารถโต้ตอบกับตรงกันข้ามการคิด chromatographic เมตริกซ์ [7] ถ้าประจุสุทธิของโปรตีนเป็นจำนวนเต็มบวกที่มี pH ต่ำกว่าค่า pI โปรตีนจะผูกกับเครื่องแลกเปลี่ยน cation เป็นลบที่ pH สูงกว่าค่า pI ประจุสุทธิของโปรตีน และโปรตีนจะผูกกับแลกเปลี่ยน anion [38]โปรตีนที่โต้ตอบกับเรซิ่น อ่อนแอเช่นโปรตีนคิดค่าธรรมเนียมบวกส่งผ่านยางปรับเปลี่ยนกลุ่มการคิดค่าธรรมเนียมส่ง weakly จะ eluted ออกในบัฟเฟอร์เกลือต่ำ บนมืออื่น ๆ โปรตีนที่โต้ตอบขอต้องการเกลือเพิ่มเติมเพื่อจะ eluted โปรตีน มีค่าคล้ายลักษณะสามารถแบ่งออกเป็นส่วนต่าง ๆ ตามที่พวกเขาจะ eluted จากคอลัมน์ โดยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือในบัฟเฟอร์ elution [7]คอลัมน์การแลกเปลี่ยนไอออนเป็นหนึ่งในเทคโนโลยีที่ใช้หลักการแลกเปลี่ยนไอออน chromatography [33] ใช้เทคโนโลยีเมมเบรนดูดซับเป็นเมทริกซ์ chromatographic เพื่อแยกโปรตีน Absorbents เมมเบรนในคอลัมน์จะเสถียรใช้เซลลูโลส มีโครงสร้างสูง porous ที่ให้โปรตีนถึงผิวคิดค่าธรรมเนียมได้ ระหว่างโมเลกุลและไซต์ที่ใช้งานอยู่บนเมมเบรนเกิดขึ้นในด้วยการพาผ่านรูขุมขน ดังนั้น สาร adsorptive มีศักยภาพในการรักษาประสิทธิภาพสูงเมื่อบริสุทธิ์ชื่อโมเลกุลชีวภาพขนาดใหญ่กับแพร่ต่ำ [33]3.2.2. เจลอาบน้ำ Chromatographyเจลอาบน้ำกรอง chromatography เรียกว่าแยกขนาดหรือเจลซึม chromatography แยกโปรตีน ตามขนาดของโมเลกุล และรูปร่างโมเลกุลไม่ผูกปานกลาง chromatography [39] มันคือกระบวนการที่ผ่านโมเลกุลใหญ่ผ่านคอลัมน์ได้เร็วกว่าโมเลกุลขนาดเล็ก โมเลกุลขนาดเล็กสามารถใส่หลุมเล็ก ๆ ของเมทริกซ์ทั้งหมด และเข้าถึงคอลัมน์เพิ่มเติม โปรตีนขนาดเล็กจะผ่านหลุมเหล่านั้น และใช้เวลามากกว่าเวลาคอลัมน์เปรียบเทียบกับโปรตีนขนาดใหญ่ที่ไม่ได้ลงในหลุมเหล่านั้น แต่ทำงานออกโดยตรงของคอลัมน์ผ่านพื้นที่โมฆะในคอลัมน์ [4, 7]ชุดเจลอาบน้ำ chromatography ใช้หลักการของเจกรอง chromatography [40] ตัวอย่างเป้าหมายจะใช้บนคอลัมน์ที่ประกอบด้วยลูกปัด porous ตัวอย่างของเมทริกซ์ในคอลัมน์ รับการแยกโมเลกุลเมื่อโมเลกุลผ่านคอลัมน์ของประคำ porous แยกโมเลกุลสามารถแบ่งออกเป็น 3 ประเภทหลัก: รวมแยก การซึมผ่านที่เลือก และวงเงินรวมซึมได้ รวมแยกเป็นส่วนที่โมเลกุลขนาดใหญ่ไม่สามารถใส่รูขุมขน และ elute อย่างรวดเร็ว การซึมผ่านใช้ภูมิภาค โมเลกุลปานกลางอาจใส่รูขุมขน และอาจมีเวลาพำนักเฉลี่ยในอนุภาคขึ้นอยู่กับขนาดและรูปร่างของพวกเขา สำหรับวงเงินรวมซึม โมเลกุลขนาดเล็กมีเวลาพำนักยาวเมื่อเข้ารูขุมขนบนคอลัมน์ [40] ข้อดีของเจ chromatography ที่ใช้กรองคือ ว่า มันเหมาะสำหรับชื่อโมเลกุลชีวภาพที่อาจมีความไวต่อค่า pH เปลี่ยน ความเข้มข้นของประจุโลหะ และสภาพแวดล้อมรุนแรง [39]3.2.3 การเชื่อมโยงกับ ChromatographyAffinity chromatography depends on a specific interaction between the protein and the solid phase to affect separation from contaminants. It consists of the same steps as ion exchange chromatography [38]. It enables the purification of a protein on the basis of its biological function or individual chemical structure [41]. Proteins that have a high affinity towards the specific chemical groups such as ligands will covalently attach and bind to the column matrix while other proteins pass through the column [38]. Electrostatic or hydrophobic interactions, van der Waals’ forces and hydrogen bonding are the biological interactions between ligands and the target proteins [41]. The bound proteins will be eluted out from the column by a solution containing high concentration of soluble form of the ligand [36].A biospecific ligand that can attach to a chromatography matrix covalently is one of the requirements for successful affinity purification. The binding between the ligand and target protein molecules must be reversible to allow the proteins to be removed in an active form [41]. After washing away the contaminants, the coupled ligand must retain its specific binding affinity for the target proteins. Some examples of biological interactions that are usually used in affinity chromatography are listed in Table 1 (see [41]).tab1Table 1: Typical biological interactions used in affinity chromatography [42].Chromatographic separation by differential affinity to ligands immobilized on a beaded porous resin is fundamental to protein research [42]. A complete kit that contains pack beaded affinity resin columns based on principle of affinity chromatography has been introduced to the market [42]. An affinity resin can be used in batch or microcentrifuge spin column format depending on the scale and type of experiment to be carried out. Furthermore, it can be packed into some sort of larger gravity-flow column as well [42].3.2.4. Gel ElectrophoresisGel electrophoresis is a method to separate protein according to their size and charge properties. The partially purified protein from the chromatography separations can be further purified with nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), or native gel electrophoresis [4]. In PAGE, the proteins are driven by an applied current through a gelated matrix [43]. The movement of protein through this gel depends on the charge density (charge per unit of mass) of the molecules. The molecules with high density charge migrate rapidly. The size and shape of protein are another two important factors that influence PAGE fractionation [43]. The acrylamide pore size plays a role as a molecular sieve to separate different sizes of proteins [4]. The larger the protein, the slower it migrates as it becomes more entangled in the gel [43]. Shape is also one of the factors because compact globular proteins move faster than elongated fibrous proteins of comparable molecular mass [43].PAGE is usually carried out in the presence of the sodium dodecyl sulfate (SDS) [44]. A protein treated with SDS will usually eliminate the secondary, tertiary and quarternary structure of protein [4, 7]. Proteins unfold into a similar rod-like shape because of the electrostatic repulsion between the bound SDS molecules. The number of SDS molecules which bind to a protein is approximately proportional to the protein’s molecular mass (about 1.4 g SDS/g protein) [43]. Each protein species has an equivalent charge density and is driven through the gel with the same force [43]. In addition, PAGE can minimize the denaturation of proteins. Many proteins still retain their biological activities after running PAGE [7]. However, larger proteins are held up to a greater degree than smaller proteins because the polyacrylamide is highly cross-linked [43]. Consequently, proteins become separated by SDS-PAGE on the basis of their molecular mass. SDS-PAGE can be used to determine the molecular mass of the mixture of proteins by comparing the positions of the bands to those produced by proteins of known size [43]. SDS used in electrophoresis resolve mixture of proteins according to the length of individual polypeptide chains [7].A technique called two-dimensional gel electrophoresis was developed by Patrick O’Farrell in 1975. It is used to fractionate complex mixtures of proteins by using two different techniques—isoelectric focusing and SDS-PAGE [43]. First, proteins are separated according to their isoelectric point in a tubular gel. After this separation, the gel is removed and placed on top of a slab of SDS-saturated polyacrylamide. The proteins move into the slab gel and separated according to their molecular mass [43]. Two-dimensional gel electrophoresis is suitable to detect changes in proteins present in a cell under different conditions, at different stages in development or the cell cycle, or in different organisms [43].3.2.5. Southwestern Blotting (Immunoblotting)Southwestern blotting is a method that is used to isolate, identify, and characterize DNA-binding proteins by their ability in binding to specific oligonucleotide probes [44, 45]. Many of the DNA-binding proteins in the cell need to be isolated individually and characterized to define the gene function [44]. Three steps are involved in this method. First, nuclear protein extracts are separated by SDS-PAGE electrophoresis. Next, separated proteins are transferred to a nitrocellulose filter, polyvinylidene difluoride (PVDF) or cationic nylon membrane [12]. The filter will then be incubated with oligonucleotide probes to analyze the adsorbed proteins [44, 45]. However, this technique is beset with problems such as large amounts of nuclear proteins are required (typically 50–100 mg), protein degradation during isolation, facing difficulties in achieving efficient electrophoretic separation and transfer of a wide molecular size range of proteins [45].

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดำเนินงาน . การแลกเปลี่ยนไอออนโครมาโตกราฟีแลกเปลี่ยนไอออน chromatography

แยกโปรตีนตามพื้นผิวของไอออนประจุโดยใช้เรซินที่มีการปรับเปลี่ยนด้วยเช่นกัน มีประจุบวกหรือลบค่าสารเคมีกลุ่ม [ 4 , 5 ] โปรตีนส่วนใหญ่มีประจุลบ หรือ บวก โดยรวมขึ้นอยู่กับจุดไอโซอิเล็กทริก ( PI ) ที่ให้ด่างซึ่งทำให้พวกเขาสามารถโต้ตอบกับการเรียกเก็บเงิน และตรงข้ามกับเมทริกซ์ [ 7 ] ถ้าประจุสุทธิของโปรตีนเป็นบวกที่ pH ด้านล่างค่า พาย โปรตีนจะทำให้การแลกเปลี่ยนไอออนบวก ; ที่ pH สูงกว่ามูลค่าสุทธิและค่าใช้จ่ายของโปรตีนที่เป็นลบและโปรตีนจะทำให้การแลกเปลี่ยนไอออน [ 38 ] .

โปรตีนที่โต้ตอบอย่างอ่อนกับเรซิ่น ,ตัวอย่างเช่นอ่อนแอโปรตีนผ่านดัดแปลงด้วยเรซินประจุบวกกับประจุลบ กลุ่ม มีตัวอย่างในบัฟเฟอร์เกลือต่ำ บนมืออื่น ๆ , โปรตีนที่โต้ตอบขอต้องการเกลือมากกว่าที่จะตัวอย่าง .โปรตีนที่มีลักษณะค่าใช้จ่ายที่คล้ายกันมากสามารถแบ่งออกเป็นเศษส่วนที่แตกต่างกันเช่นที่พวกเขามีตัวอย่างจากคอลัมน์โดยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือในสารประกอบบัฟเฟอร์ [ 7 ] .

คอลัมน์ไอออนแลกเปลี่ยนเป็นหนึ่งในเทคโนโลยีที่ใช้หลักการของการแลกเปลี่ยนไอออน chromatography [ 33 ] ใช้ดูดซับเทคโนโลยีเมมเบรนเป็นเมทริกซ์ และการแยกโปรตีนเยื่อแผ่นเซลลูโลสจากวัสดุดูดซับในคอลัมน์ที่มีเสถียรภาพสูงด้วยโครงสร้างรูพรุนที่ให้โปรตีนเข้าประจุพื้นผิวได้อย่างง่ายดาย ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลและใช้งานเว็บไซต์ในเมมเบรนเกิดขึ้นโดยผ่านรู ดังนั้นนำมาหุ้มมีศักยภาพในการรักษาประสิทธิภาพสูงเมื่อบริสุทธิ์สารชีวโมเลกุลขนาดใหญ่ที่มีการแพร่กระจายต่ำ [ 33 ] .

3.2.2 . gel filtration chromatography

gel filtration chromatography , ยังเรียกว่าขนาดการยกเว้นหรือโครมาโทกราฟีใช้เจล แยกตามขนาดและรูปร่างของโมเลกุลโปรตีนและโมเลกุลไม่ผูกกับสื่อ chromatography [ 39 ]มันคือกระบวนการที่โมเลกุลขนาดใหญ่ผ่านคอลัมน์เร็วกว่าโมเลกุลขนาดเล็ก โมเลกุลขนาดเล็กที่สามารถเข้าสู่ทั้งหมดของหลุมเล็ก ๆของเมทริกซ์และการเข้าถึงเพิ่มเติมของคอลัมน์