Those PCR products yielding a singl

Those PCR products yielding a single, bright amplification band were prepared for cycle-sequencing by cleaning the PCR product using an ExoSAP-IT™ kit (USB Corporation). We used 7 ll of PCR product, 2 ll of ExoSAP solution (0.1 ll exonuclease at a stock con- centration of 1 U/ll and 1.9 ll of SAP buffer at a stock concentra- tion of 20 U/ll) and 1 ll of 10 SAP buffer. Cleanup reactions involved incubating this mixture at 37 C for 60 min followed by heating to 80 C for 15 min to denature the exonuclease and phos- phatase enzymes. Three to five microliters of the purified PCR product were then used as a template for cycle sequencing of the entire amplicon in overlapping heavy and light strand fragments of 700 base pairs using ABI BigDye™ 3.1 Terminator sequencing chemistry. Sequencing reactions were performed in a total volume of 10 ll containing 1 ll of Big Dye™, reaction mix, 1.5 ll of 5 Big- Dye™ reaction buffer, 3.3 pmol of a particular sequencing primer, 1–4 ll of ExoSAP-treated template (depending on the quality of the PCR product), and water up to a total volume of 10 ll. The cycle sequencing reaction consisted of 25 cycles of denaturing at 96 C for 10 s, primer annealing at 50 C for 5 s, and extension at 60 C for 4 min. Cycle-sequencing products were purified via ethanol precip- itation and re-suspended in 10 ll of Hi-Di formamide and then separated and visualized via capillary electrophoresis on an ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Raw sequencing traces were imported into Sequencher 3.1 (Gene Codes Corporation) and edited to trim low quality base calls from flanking regions. All sequences were visually checked for miscalls due to either bad base spacing or over-fluorescence of particular dye nucleotides and were then assembled into locus specific contigs using the soft- ware Sequencher 3.1 (Gene Codes Corporation). As a check against possible inadvertent inclusion of nuclear mitochondrial pseudo gene (or ‘‘numt’’) sequences instead of true mtDNA sequences in our dataset, we confirmed that our initial long-range amplifications yielded a single PCR band of expected size and that within each coding region, all sequences were free of frame shift errors and unexpected termination codons. We also confirmed that no sequences yielded unexpected phylogenetic placement in locusspecific or overall phylogenetic analyses.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ผลิตภัณฑ์ PCR ผลผลิตเดียว วง amplification สดใสเตรียมไว้สำหรับวงจรลำดับ โดยทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ PCR โดยใช้ชุดอุปกรณ์ ExoSAP IT ™ (USB Corporation) เราใช้ 7 จะผลิตภัณฑ์ PCR, 2 จะของ ExoSAP (0.1 จะ exonuclease เป็นหุ้นคอน centration ของ 1 U ll และ 1.9 ของ SAP จะมีบัฟเฟอร์ที่เป็นหุ้น concentra-สเตรชันของ U จะ 20) และ 1 จะบัฟเฟอร์ซับ 10 ล้างปฏิกิริยาเกี่ยวข้องกับ incubating ส่วนผสมนี้ที่ 37 C สำหรับ 60 นาทีตามความร้อนถึง 80 C สำหรับ 15 นาทีการ denature เอนไซม์ exonuclease และ phos phatase 3 microliters five ผลิตภัณฑ์ PCR purified แล้วใช้เป็นแม่แบบสำหรับวงจรลำดับของ amplicon ทั้งหมดในชิ้นส่วนสาระที่หนัก และเบาของคู่ฐาน 700 ที่ใช้เคมีลำดับ ABI BigDye ™ 3.1 เทอร์มิเนเตอร์ที่ทับซ้อน ลำดับปฏิกิริยาดำเนินในปริมาตรรวม 10 จะประกอบด้วย 1 จะย้อมใหญ่™ ปฏิกิริยาผสม 1.5 จะบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา™ใหญ่ย้อม 5, 1 – 4 จะรับ ExoSAP ต้นแบบ (ขึ้นอยู่กับคุณภาพของผลิตภัณฑ์ PCR), และน้ำได้ปริมาตรรวม 10, pmol 3.3 พื้นเฉพาะลำดับจะ ปฏิกิริยาลำดับวงจรประกอบด้วยวงจร 25 ของ denaturing ที่ 96 C 10 s การอบเหนียวที่ 50 C 5 s และส่วนขยายที่ 60 C นาที 4 วงจรลำดับผลิตภัณฑ์รองพื้น purified ผ่านเอทานอล precip itation และหยุดชั่วคราวอีกครั้งใน 10 จะของ Hi Di formamide แล้วแยก และ visualized ผ่านเส้นเลือดฝอย electrophoresis ในการลักชัวรี่ 3730 DNA วิเคราะห์ (Biosystems ใช้) ร่องรอยวัตถุดิบลำดับที่เข้า Sequencher 3.1 (ยีนรหัส บริษัท) และแก้ไขเกลาเรียกฐานคุณภาพต่ำจากภูมิภาค flanking ลำดับทั้งหมดถูกตรวจสอบสายสำหรับ miscalls เนื่องจากระยะห่างที่พื้นฐานไม่ดีหรือมากกว่า-fluorescence ของสีย้อมเฉพาะนิวคลีโอไทด์ และได้รวมตัวกันเป็นโลกัสโพล specific contigs ใช้ 3.1 Sequencher ของเครื่องอัดลม (ยีนรหัส บริษัท) แล้ว เป็นการตรวจสอบกับหลอก mitochondrial นิวเคลียร์ยีน (หรือ '' numt'') ลำดับแทนลำดับ mtDNA จริงในชุดข้อมูลของเรา ได้โดยรวมเรา confirmed ว่า amplifications พิสัยของเราเริ่มต้นหาวง PCR เดียวขนาดที่คาดไว้ และว่า ภายในแต่ละภูมิภาครหัส ลำดับทั้งหมดมีอิสระของเฟรมกะข้อผิดพลาดและ codons สิ้นไม่คาดคิด เรายัง confirmed ว่า ลำดับไม่หาตำแหน่ง phylogenetic ไม่คาดคิดใน locusspecific หรือวิเคราะห์ phylogenetic โดยรวม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บรรดาผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ยอมเดียว Fi Ampli สดใสวงไอออนบวกถูกเตรียมไว้สำหรับวงจรลำดับโดยการทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ PCR โดยใช้ ExoSAP ไอที™ชุด (USB คอร์ปอเรชั่น) เราใช้ 7 LL ของผลิตภัณฑ์ PCR 2 LL ของการแก้ปัญหา ExoSAP (0.1 LL เอกโซนิวคลีเอสที่ centration อย่างต่อหุ้น 1 U / LL LL และ 1.9 ของบัฟเฟอร์ SAP ในการสต็อกเข้มข้น 20 U / LL) และ 1 LL ของ 10 บัฟเฟอร์ SAP ปฏิกิริยาการล้างข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับการบ่มส่วนผสมนี้ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 60 นาทีตามด้วยความร้อนถึง 80 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีที่จะทำให้ผิดลักษณะเดิมเอกโซนิวคลีเอสและ phos- เอนไซม์ phatase สามถึง fi และ microliters ของใช้ไฟ Puri เอ็ดผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูกแล้วเป็นแม่แบบสำหรับการจัดลำดับวงจรของ amplicon ทั้งหมดในที่ทับซ้อนกันเศษหนักและสาระแสงของ 700 คู่โดยใช้ฐาน ABI BigDye ™ 3.1 Terminator เคมีลำดับ ปฏิกิริยาลำดับได้ดำเนินการในปริมาณรวมของ 10 LL มี 1 LL ของบิ๊กย้อม™ผสมปฏิกิริยา 1.5 LL 5 Big- บัฟเฟอร์ปฏิกิริยาย้อม™ 3.3 pmol ของไพรเมอร์ลำดับโดยเฉพาะอย่างยิ่ง 1-4 LL ของแม่ ExoSAP รับการรักษา (ขึ้นอยู่กับคุณภาพของผลิตภัณฑ์ PCR) และน้ำได้ถึงปริมาณรวมของ 10 LL ปฏิกิริยาลำดับวงจรประกอบด้วย 25 รอบของ denaturing ที่ 96 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วินาที, การหลอมไพรเมอร์ที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาที, และการขยายที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาที ผลิตภัณฑ์วงจรลำดับเป็นเอ็ด Fi Puri ผ่านเอทานอล precip- itation และอีกครั้งที่ลอยอยู่ใน 10 ของ LL Formamide Hi-Di แล้วแยกและมองเห็นผ่านทางอิเล็กเส้นเลือดฝอยบน ABI 3730 ดีเอ็นเอวิเคราะห์ (Applied Biosystems) ร่องรอยลำดับดิบถูกนำเข้ามาใน SEQUENCHER 3.1 (ยีนรหัสคอร์ปอเรชั่น) และแก้ไขเพื่อตัดสายฐานที่มีคุณภาพต่ำจากภูมิภาค Anking ชั้น ลำดับทั้งหมดถูกตรวจสอบสายตาสำหรับ miscalls เนื่องจากทั้งระยะห่างฐานที่ไม่ดีหรือ uorescence ชั้นเกินของนิวคลีโอสีย้อมโดยเฉพาะอย่างยิ่งและได้รับการประกอบแล้วเป็นสถานทีเฉพาะเจาะจง contigs คโดยใช้เครื่องนุ่ม SEQUENCHER 3.1 (ยีนรหัสคอร์ปอเรชั่น) ในขณะที่การตรวจสอบกับการรวมโดยไม่ได้ตั้งใจเป็นไปได้ของยีนหลอกยลนิวเคลียร์ (หรือ '' ​​numt '') ลำดับแทนลำดับ mtDNA จริงในชุดของเราเราแย้ง Fi rmed ว่าช่วงยาวของเราเริ่มต้นไพเพ Fi Ampli yielded วง PCR เดียวของขนาดที่คาดหวังและสิ่งที่อยู่ภายใน แต่ละภูมิภาคเข้ารหัสลำดับทุกคนปราศจากข้อผิดพลาดการเปลี่ยนแปลงกรอบและการเลิกจ้างที่ไม่คาดคิด codons นอกจากนี้เรายังแย้ง Fi rmed ลำดับที่ไม่ให้ผลการจัดวางสายวิวัฒนาการที่ไม่คาดคิดในค Fi locusspeci หรือการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการโดยรวม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โดยผลิตภัณฑ์เหล่านั้นยอมโสด สดใส ampli จึงเตรียมการลำดับการวงวัฏจักรของผลิตภัณฑ์ทำความสะอาดที่สามารถใช้เป็น exosap มัน™ Kit ( USB Corporation ) เราใช้ 7 จะผลิตภัณฑ์ PCR 2 จะ exosap โซลูชั่น ( 0.1 จะเอกโซนิวคลีเอสที่หุ้นคอน - centration 1 U / ll และ 1.9 จะเลือกบัฟเฟอร์ที่หุ้นครุ่นคิด - tion 20 U / ll ) และ 1 จะ 10 ยางกันชนปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับการทำความสะอาดไข่ผสมนี้ที่ 37 C นาน 60 นาที ตามด้วยความร้อน 80 องศาเซลเซียสนาน 15 นาที จะทำให้ผิดธรรมชาติที่เอกโซนิวคลีเอสและ phos - phatase เอนไซม์ ทั้งสามจึงได้ตัวเลขของปุริม PCR จึงผลิตแล้วใช้เป็นแม่แบบสำหรับวงจรการจัดลำดับของและทั้งหมดในที่ทับซ้อนกันหนักและเศษเส้นแสงของ 700 คู่เบสใช้อบิ bigdye ™ 31 terminator ขบวนการทางเคมี ลำดับปฏิกิริยาได้ในปริมาณรวม 10 จะประกอบด้วย 1 จะ™ย้อมใหญ่ผสมปฏิกิริยา 1.5 จะ 5 ใหญ่ - สี™ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ , 3.3 pmol ของรองพื้นลำดับเฉพาะ 1 – 4 จะ exosap ปฏิบัติแม่แบบ ( ขึ้นอยู่กับคุณภาพของผลิตภัณฑ์ PCR ) และน้ำขึ้น ปริมาณรวมของ 10 จะวงจรปฏิกิริยาลำดับจำนวน 25 รอบี่ 96 C 10 S , ไพรเมอร์อบอ่อนที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาที , และส่วนขยายที่ 60 C 4 นาที รอบการจัดลำดับผลิตภัณฑ์ปุริมผ่านเอทานอลจึง precip - บัตรเชิญนั่นและแขวนลอยใน 10 จะสวัสดี di Formamide แล้วแยกออกจากกันและมองเห็นผ่าน capillary electrophoresis ใน ABI 940 ดีเอ็นเอวิเคราะห์ ( Applied Biosystems )ร่องรอยของดิบที่นำเข้า sequencher 3.1 ( รหัสบริษัทยีน ) และแก้ไขการตัดแต่งฐานคุณภาพต่ำโทรจากfl anking ภูมิภาค ทุกสายตาตรวจสอบลำดับถูกเรียกชื่อผิดเนื่องจากทั้งฐานระยะไม่ดีหรือมากกว่า - fl uorescence เฉพาะเบสและย้อมแล้วตนจึงรวมตัวกันเป็น speci C สูงโดยใช้ sequencher เครื่องนุ่ม - 3.1 ( รหัส บริษัท ยีน )เท่าที่เช็คกับการตั้งใจที่เป็นไปได้ของไมโตคอนเดรียเทียมนิวเคลียร์ยีน ( หรือ ' 'numt ' ' ) ลำดับแทนจริงแสดงลำดับใน DataSet ของเรา เราจึง rmed con ที่เริ่มต้นจากระยะไกล ampli จึงทำให้วงดนตรี PCR เดียวคาดว่าขนาดและว่าในแต่ละรหัสภูมิภาค , ลำดับของกรอบเปลี่ยนข้อผิดพลาดและเป็นอิสระ ซิสการสิ้นสุดที่ไม่คาดคิดเรายังหลอกจึง rmed ไม่มีลำดับและการจัดวาง ซึ่งไม่คาดคิดใน locusspeci จึง C หรือโดยรวม ซึ่ง วิเคราะห์