embryo production Oocyte-cumulus co

embryo production Oocyte-cumulus complexes were isolated by total slicing of the ovarian cortex. Only good quality oocytes with homogenous dark cytoplasm and at least two layers of cumulus cells were considered usable. Embryos were prepared according to a standard protocol described previously (Machatkova et al., 2004). Oocytes were matured in TCM-199 medium (Earle’s salt), supplemented with antibiotics, 0.20mM sodium pyruvate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), gonadotropins (P.G. 600, 15 IU/ml, Intervet, Boxmeer, The Netherlands) and 5% oestrus cow serum (ECS) for 24 hours. Motile spermatozoa were isolated by the swim-up method from frozen-thawed sperm using modified Tyrode’s medium (SP-TALP). They were coincubated with the oocytes at a concentration of 1 × 106 spermatozoa per ml in modified Tyrode’s medium (IVF-TALP) supplemented with 10 μg/ml heparin for 20 hours. Presumptive zygotes were removed from cumulus cells, transferred onto a BRL cell line monolayer (Buffalo rat liver cells, ATCC, Rockville, MD, USA) and cultivated in Menezo B2 medium with 10% ECS. All procedures were carried out at 39°C with atmospheric conditions of 5% CO2. Embryos, at earliest at an early blastocyst stage on Day 7, or advanced blastocyst stage on Day 8 were regarded as transferable.
embryo cryopreservation Only excellent blastocysts of good quality were selected for cryopreservation from transferable embryos. They were placed in freezing medium, consisting of 10% glycerol (v/v) in TCM-199 medium with 10% ECS and equilibrated for 5 min at room temperature. Subsequently, each embryo was loaded into 0.25 ml straw in a column of freezing medium and allowed to stand for another 10–15 min at room temperature. Straws were placed in the programmable freezer at –7°C and, after 10 min, were seeded. After another 10 min the embryos were cooled to –35°C at a rate of 0.3°C/min; they were then plunged into liquid nitrogen.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

คอมเพล็กซ์การผลิตตัวอ่อนไข่-Cumulus ถูกแยกโดยหั่นรวมของเยื่อหุ้มสมองรังไข่ เพียง แต่การพัฒนาของไข่ที่มีคุณภาพที่ดีกับพลาสซึมมืดเป็นเนื้อเดียวกันและอย่างน้อยสองชั้นของเซลล์คิวมูลัสได้รับการพิจารณาใช้งาน ตัวอ่อนที่ถูกจัดทำขึ้นตามโปรโตคอลมาตรฐานอธิบายไว้ก่อนหน้า (Machatkova et al., 2004) เซลล์ไข่ถูกครบกำหนดใน (เกลือของเอิร์ล) TCM-199 ขนาดกลางเสริมด้วยยาปฏิชีวนะ 0.20mm โซเดียมไพรู (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gonadotropins (PG 600, 15 IU / ml Intervet, Boxmeer ที่ เนเธอร์แลนด์) และ 5% ในซีรั่มสัดวัว (ECS) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตัวอสุจิเคลื่อนที่ถูกแยกโดยวิธีการว่ายน้ำขึ้นมาจากสเปิร์มแช่แข็งละลายโดยใช้การปรับเปลี่ยนขนาดกลาง Tyrode ของ (SP-TALP) พวกเขาถูก coincubated กับเซลล์ไข่ที่ความเข้มข้น 1 × 106 มล. ต่อสเปิร์มในการแก้ไข Tyrode ของกลาง (IVF-TALP) เสริมด้วย 10 ไมโครกรัม / เฮมล. เป็นเวลา 20 ชั่วโมง zygotes สันนิษฐานถูกถอดออกจากเซลล์ Cumulus โอนไปยัง monolayer สายพันธุ์ของเซลล์ BRL (เซลล์ตับหนูบัฟฟาโล, ATCC, Rockville, MD, USA) และได้รับการปลูกฝังใน B2 กลาง Menezo 10% ECS ขั้นตอนทั้งหมดได้ดำเนินการที่ 39 ° C ที่มีสภาพบรรยากาศของ 5% CO2 ตัวอ่อนที่เก่าแก่ที่สุดในระยะตัวอ่อนในช่วงต้นของวันที่ 7 หรือเวทีอ่อนสูงในวันที่ 8 ถูกมองว่าเป็นเปลี่ยนมือได้.
ตัวอ่อนแช่แข็งเพียงตัวอ่อนที่ดีของคุณภาพดีถูกเลือกสำหรับการเก็บรักษาตัวอ่อนจากการโอนเปลี่ยนมือได้ พวกเขาถูกวางไว้ในการแช่แข็งขนาดกลางประกอบด้วยกลีเซอรีน 10% (v / v) ในระดับปานกลาง TCM-199 กับ 10% ของ ECS และ equilibrated เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ต่อจากนั้นแต่ละตัวอ่อนถูกโหลดลง 0.25 มล. ฟางในคอลัมน์ของการแช่แข็งขนาดกลางและได้รับอนุญาตให้ยืนอีก 10-15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลอดถูกวางไว้ในช่องแช่แข็งตั้งโปรแกรมที่ -7 องศาเซลเซียสและหลังจาก 10 นาที, เมล็ด หลังจากนั้นอีก 10 นาทีตัวอ่อนที่ถูกระบายความร้อนให้ -35 ° C ในอัตรา 0.3 ° C / นาที; พวกเขาจะถูกลดลงแล้วลงในไนโตรเจนเหลว

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การผลิตไข่ตัวอ่อนสมบูรณ์โดยรวมของสารประกอบที่แยกได้่นอกรังไข่ แต่คุณภาพไข่ ( homogenous มืดไซโตพลาสซึมและอย่างน้อยสองชั้น นอกจากนี้เซลล์ก็ถือว่าใช้ได้ ตัวอ่อนที่ถูกเตรียมไว้ตามโปรโตคอลมาตรฐานที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( machatkova et al . , 2004 ) ไข่เป็นผู้ใหญ่ใน tcm-199 ขนาดกลาง ( เอิร์ลเกลือ ) เสริมด้วยยาปฏิชีวนะ 0.20mm โซเดียมไพรูเวท ( ซิกม่า Aldrich St . Louis , MO , USA ) ใจร้าย ( PG 600 , 15 IU / ml intervet boxmeer , , เนเธอร์แลนด์ ) 5 % ติด ซีรั่มวัว ( ECS ) ตลอด 24 ชั่วโมง เคลื่อนที่อสุจิที่แยกโดยวิธีแช่แข็งสเปิร์มว่ายน้ำขึ้นจากที่ละลายแล้วใช้ดัดแปลง tyrode ปานกลาง ( sp-talp ) พวกเขา coincubated กับเซลล์ที่ระดับความเข้มข้น 1 × 106 ท่อต่อมิลลิลิตร ในการแก้ไข tyrode ปานกลาง ( ivf-talp ) เสริมด้วยμ heparin 10 g / ml เป็นเวลา 20 ชั่วโมง ให้ผล zygotes ถูกเอาออกจากเซลล์คิวมูลัส , โอนไปยังบรรทัด ( BRL เซลล์ตับหนู อย่างควาย เซลล์ และ ร็อควิลล์ , MD , USA ) และปลูกใน B2 menezo ปานกลาง 10% อีซี . ขั้นตอนทั้งหมดได้ดำเนินการใน 39 ° C กับสภาพบรรยากาศของ CO2 5% ตัวอ่อนที่เร็วในช่วงต้นระยะตัวอ่อนระยะบลาสโตซิส ในวันที่ 7 หรือ 8 ถือว่าสูงในวันโอนตัวอ่อนก่อนโตคุณภาพดีเลิศเท่านั้น โดยเลือกใช้เชื้อจากอ่อนโอน พวกเขาอยู่ในการแช่แข็งปานกลาง ประกอบด้วย 10 % กลีเซอรอล ( v / v ) ใน tcm-199 กลางกับ ECS 10% และ equilibrated สำหรับ 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ต่อมา แต่ละตัวอ่อนถูกโหลดลง 0.25 ml ฟางในคอลัมน์ของการแช่แข็งปานกลาง และอนุญาตให้ยืนสำหรับอีก 10 – 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลอดถูกวางไว้ในช่องแช่แข็งและโปรแกรมที่ 7 องศา C และหลังจาก 10 นาทีถูก seeded . หลังจากนั้น อีก 10 นาทีตัวอ่อนอยู่เย็น– 35 ° C ที่อัตรา 0.3 องศาองศาเซลเซียส / นาที ; จากนั้น plunged ลงในไนโตรเจนเหลว