2. Materials and methods2.1. Animal

2. Materials and methods
2.1. Animals
Porcine ovaries were obtained from mature sows at
Nanjing Tianhuan Company (local slaughter house). Before
slaughter, pigs were first rendered unconscious using the
following means: stunning using electric current applied
with electrodes, and then hoisted on a rail, after which they
are exsanguinated via the carotid artery (Wei et al., 2013).
After slaughter, the ovaries were collected and transferred
to the laboratory as soon as possible in physiological saline
(37 ◦C) containing 100 IU/l penicillin and 50 mg/l streptomycin.
2.2. Follicle classification and granulosa cell collection
The freshly collected porcine ovaries were washed three
times with sterile physiological saline (37 ◦C),then brought
into sterile laboratory. Individual follicles were separated
under a surgical dissecting microscope (SZ40; Olympus,
Tokyo, Japan) with small scissors and forceps. Preovulatory
antral follicles (3–5 mm in diameter) were chosen and
divided into three groups: healthy follicle (HF), early atretic
(EA), or progressively atretic (PA) according to follicle classification
criteria. 10 follicles were included in each group.
Classification criteria of follicles are as follows:
(1) Healthy follicles were round with a pink and wellvascularized
follicular wall and clear follicular fluid.
(2) Early atretic follicles were traversed by a few or no
blood vessels and turbid follicular fluid.
(3) Progressively atretic follicles were with almost no
blood vessels and the color ofthe follicular wall became
gray and white.
Granulosa cells from individual follicle of different
atresia status were isolated by puncturing follicles with5 ml syringe and gently expelling the cells into a culture
dish containing DMEM-Ham’s F-12 medium. The
cumulus–oocyte complex and ovarian tissue were discarded
under a stereo microscope. Granulosa cells were
then harvested by centrifuging the media (5000 rpm for
10 min). Pooled cells were washed twice times in PBS for
Western blot and quantitative real-time PCR assay.
2.3. Immunohistochemistry
To examine the location of SIRT1 in porcine ovaries,
immunohistochemical staining was performed with the
SABC method using monoclonal antibodies of SIRT1
(Abcam, Cambridge, MA). The freshly collected porcine
ovaries were fixed in 4% paraformaldehyde at room
temperature for 36 h and then kept in 70% alcohol. Manipulation
was performed followed the protocol as previously
described (Wei et al., 2013). A few sections were picked
randomly from the serial sections, and mounted on slides
coated with APES (3-aminopropyl-triethoxysilane) and
dried for 24 h at 37 ◦C. The antibodies were diluted 1:150
in PBS containing 1% (w/v) bovine serum albumin (BSA),
and incubated overnight at 4 ◦C with the sections. The specific
protein immunoreactivity was visualized with 0.05%
DAB in 10 mM PBS containing 0.01% (v/v) H2O2 for 2 min,
and counterstained with hematoxylin. The negative control
was normal rabbit serum (NRS) instead of primary
antibody, and relative levels of immunostaining were evaluated
and repeated at least four times (Ding et al., 2010;
Zhang et al., 2011). The images were captured under the
microscope.
2.4. Granulosa cell culture and treatment
For experiments investigating resveratrol-mediated
effects, primary cultures of granulosa cells from healthy
follicles (3–5 mm in diameter) were selected. The isolated
granulosa cells were counted by cell counting board
and cultured in 6-well plates (1 × 106/well) with 2 ml of
DMEM–Ham’s F-12 containing 10% BSA, 0.01% pyruvic acid,
0.22% bicarbonate at 37 ◦C in atmosphere of 95% O2:5%
CO2. When the cell destiny of each well reached 75–85%
confluence, the medium was replaced by resveratrol concentrations
at 0 (control), 10, 25, 50, 75, 100 M M/L
medium, and then cultured for 24 h. Granulosa cells from
each treatment were collected from the wells and snap
frozen for subsequent analysis by quantitative real-time
PCR and Western blot.
2.5. RNA isolation and quantitative real-time PCR
Total RNA was extracted from granulosa cells of preovulatory
follicles and from granulosa cells treated with
different concentrations of resveratrol by using RNeasy
Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany), quantified by measuring
absorbance at 260 nm and stored at −80 ◦C until
assay. cDNA were synthesized from 2 g of total RNA using
Revert AidTM First Strand cDNA synthesis kit (Fermentas,
St. Leon Rot, Germany) according to the manufacturer’s
protocol. Expression levels of SIRT1 mRNA were measured
by quantitative real-time PCR using One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) in the
Light Cycler (RocheApplied Science, Mannheim, Germany).
Accumulated levels of fluorescence were analyzed by the
second-derivative method after the melting-curve analysis,
and expression levels of SIRT1 mRNA were normalized
to expression level of GAPDH in each sample. Primer
sequence and product size were as follows:

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 การสัตว์รังไข่ช่วงได้รับจาก sows ผู้ใหญ่ที่บริษัท Tianhuan จิง (ฆ่าภายในบ้าน) ก่อนที่จะฆ่า สุกรถูกแรกแสดงโดยใช้สติวิธีการดังต่อไปนี้: ใช้กระแสไฟฟ้าที่ใช้ที่สวยงามมีหุงต และ hoisted บนทางรถไฟ หลังจากที่พวกเขามี exsanguinated ผ่านหลอดเลือดแดง carotid (Wei et al., 2013)หลังจากฆ่า รังไข่ถูกรวบรวม และโอนย้ายการปฏิบัติการโดยเร็วที่สุดในน้ำเกลือ physiological(37 ◦C) ประกอบด้วย streptomycin ยาเพนนิซิลลินและ 50 mg/l 100 IU/l2.2. ประเภท follicle และ granulosa เซลล์คอลเลกชันรังไข่ช่วงสดรวบรวมถูกล้างสามครั้งกับน้ำเกลือ physiological กอซ (37 ◦C), จากนั้น นำในห้องปฏิบัติการฆ่าเชื้อ มีแบ่งแต่ละรูขุมขนภายใต้กล้องจุลทรรศน์ dissecting ผ่าตัด (SZ40 โอลิมปัสโตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) ด้วยคีมและกรรไกรขนาดเล็ก Preovulatoryรูขุมขน antral (3-5 มม.เส้นผ่านศูนย์กลาง) ที่ถูกเลือก และแบ่งออกเป็นสามกลุ่ม: สุขภาพ follicle (HF), ต้น atretic(EA), หรือความก้าวหน้า atretic (PA) ตามการจัดประเภท follicleเกณฑ์การ รูขุมขน 10 รวมอยู่ในแต่ละกลุ่มเงื่อนไขการจัดประเภทของรูขุมขนมีดังนี้:(1) รูขุมขนสุขภาพดีถูกกับสีชมพูและ wellvascularizedผนัง follicular และ follicular ล้างน้ำมัน(2) ต้น atretic รูขุมขนได้ไม่เหมือนกันบางหรือไม่เลือดและของเหลว follicular turbid(3) รูขุมขนความก้าวหน้า atretic ได้ที่เกือบไม่มีกลายเป็นเลือดและสีของผนัง follicularสีเทาและสีขาวGranulosa เซลล์จากแต่ละ follicle ของแตกต่างกันatresia สถานะถูกแบ่งแยก puncturing เข็มมล with5 รูขุมขนและค่อย ๆ เพิ่มเซลล์ลงในวัฒนธรรมจานที่มี DMEM-แฮมของ F-12 ปานกลาง ที่เนื้อเยื่อรังไข่ และซับซ้อนลัส – oocyte ถูกละทิ้งภายใต้กล้องจุลทรรศน์สเตอริโอ Granulosa เซลล์ได้จากนั้น เก็บเกี่ยว โดย centrifuging สื่อ (5000 rpm สำหรับ10 นาที) รวมเซลล์ถูกล้างสองครั้งใน PBS สำหรับคืนในตาตะวันตกและเชิงปริมาณแบบ real-time PCR assay2.3. Immunohistochemistryตรวจสอบตำแหน่งของ SIRT1 ในรังไข่ช่วงimmunohistochemical ย้อมสีทำด้วยการSABC วิธีใช้แอนตี้ monoclonal ของ SIRT1(Abcam เคมบริดจ์ MA) รวบรวมสดช่วงรังไข่ก็คงใน paraformaldehyde 4% ห้องอุณหภูมิสำหรับ 36 h และเก็บไว้ในแอลกอฮอล์ 70% แล้ว จัดการทำตามโพรโทคอลเป็นก่อนหน้านี้อธิบาย (Wei et al., 2013) ส่วนน้อยที่รับแบบสุ่มจากส่วนอนุกรม และติดอยู่บนภาพนิ่งเคลือบ ด้วยลิง (3 aminopropyl triethoxysilane) และแห้งใน 24 ชมที่ 37 ◦C แอนตี้ที่ถูก 1:150 แตกออกใน PBS ประกอบด้วย 1% (w/v) วัว serum albumin (บีเอสเอ),และ incubated ที่ ◦C 4 ส่วนค้างคืน เฉพาะโปรตีน immunoreactivity มี visualized 0.05%บคอใน PBS ประกอบด้วย 0.01% (v/v) H2O2 ในนาทีที่ 2, 10 มม.และ counterstained กับ hematoxylin ควบคุมค่าลบมีกระต่ายปกติซีรั่ม (NRS) แทนหลักประเมินแอนติบอดี และระดับสัมพัทธ์ของ immunostainingและทำซ้ำอย่างน้อย 4 ครั้ง (ดิง et al., 2010Zhang et al., 2011) ภาพรวมภายใต้การกล้องจุลทรรศน์2.4. Granulosa เพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษาสำหรับการทดลองตรวจสอบจำนวนมาก resveratrol mediatedลักษณะ วัฒนธรรมหลักของเซลล์ granulosa จากสุขภาพรูขุมขน (3-5 มม.เส้นผ่านศูนย์กลาง) ถูกเลือก การแยกเซลล์ granulosa นับได้ โดยคณะกรรมการตรวจนับเซลล์และในแผ่น 6-ดี (1 × 106/ดี) กับ 2 ml ของอ่างF DMEM-แฮม-12 ประกอบด้วย 10% บีเอสเอ กรดไพรูวิก 0.01%ไบคาร์บอเนต$ 0.22% ที่ ◦C 37 ในบรรยากาศของ 95% O2:5%CO2 เมื่อชะตากรรมของแต่ละเซลล์ที่ดีถึง 75-85%บรรจบ สื่อถูกแทนที่ ด้วยความเข้มข้นของยาธรรมชาติเครื่องสำอางที่ 0 (ควบคุม), 10, 25, 50, 75, 100 M M/Lกลาง และอ่างแล้วสำหรับ 24 h. Granulosa เซลล์จากทรีตเมนท์ที่ถูกเก็บรวบรวมจากบ่อและสแนปอินแช่แข็งสำหรับการวิเคราะห์ต่อไป โดยเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์PCR และตะวันตกทำลาย2.5 แยกอาร์เอ็นเอและ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกจากเซลล์ granulosa ของ preovulatoryรูขุมขน และเซลล์ granulosa รับความเข้มข้นแตกต่างกันจำนวนมาก resveratrol โดย RNeasyมินิชุด (Qiagen, Hilden เยอรมนี), quantified โดยวัดabsorbance ที่ 260 nm และเก็บไว้ที่ −80 ◦C จนวิเคราะห์ มีสังเคราะห์ cDNA จาก 2 g ใช้อาร์เอ็นเอทั้งหมดแปลงชุดสังเคราะห์ cDNA สแตรนด์แรก AidTM (Fermentasเซนต์ลีออน Rot เยอรมนี) ตามของผู้ผลิตโพรโทคอลการ มีประเมินนิพจน์ระดับของ SIRT1 mRNAโดย PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์โดยใช้หนึ่งขั้นตอน SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara ชีวภาพ Inc. ชิงะ ญี่ปุ่น) ในการCycler แสง (RocheApplied วิทยาศาสตร์ มา เยอรมนี)ระดับการสะสมของ fluorescence ถูกวิเคราะห์โดยการอนุพันธ์อันดับสองวิธีหลังจากวิเคราะห์โค้งละลายและระดับ SIRT1 mRNA นิพจน์ได้ตามปกตินิพจน์การระดับของ GAPDH ในตัวอย่างแต่ละ สีรองพื้นลำดับและขนาดของผลิตภัณฑ์มีดังนี้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สัตว์
รังไข่สุกรที่ได้รับจากแม่สุกรผู้ใหญ่ที่
หนานจิง Tianhuan บริษัท (โรงฆ่าสัตว์ท้องถิ่น) ก่อนที่จะ
ฆ่าหมูถูกแสดงผลครั้งแรกที่หมดสติโดยใช้
วิธีการต่อไปนี้: ที่สวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าที่ใช้
กับขั้วไฟฟ้าและยกแล้วบนรถไฟหลังจากที่พวกเขา
(. Wei et al, 2013). จะ exsanguinated ผ่านทางหลอดเลือดแดง
หลังจากที่ฆ่า รังไข่ถูกเก็บรวบรวมและโอน
ไปยังห้องปฏิบัติการโดยเร็วที่สุดเท่าที่เป็นไปได้ในน้ำเกลือทางสรีรวิทยา
(37 ◦C) ที่มี 100 IU / ยาปฏิชีวนะลิตรและ 50 มิลลิกรัม / ลิตร streptomycin.
2.2 การจัดหมวดหมู่และรูขุมขนคอลเลกชัน granulosa เซลล์
ที่เก็บรวบรวมสุกรสดรังไข่ถูกล้างสาม
ครั้งด้วยน้ำเกลือทางสรีรวิทยาหมัน (37 ◦C) แล้วนำ
เข้าไปในห้องปฏิบัติการผ่านการฆ่าเชื้อ รูขุมส่วนบุคคลที่ถูกแยกออก
ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ผ่าตัด (SZ40; Olympus,
กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) ด้วยกรรไกรขนาดเล็กและคีม Preovulatory
รูขุม antral (3-5 มม) ได้รับการแต่งตั้งและ
แบ่งออกเป็นสามกลุ่มคือรูขุมขนที่มีสุขภาพดี (HF) atretic ต้น
(EA) หรือมีความก้าวหน้า atretic (PA) ตามประเภทรูขุมขน
ตามเกณฑ์ 10 รูขุมถูกรวมอยู่ในแต่ละกลุ่ม.
เกณฑ์การจำแนกประเภทของรูขุมขนมีดังนี้
(1) รูขุมสุขภาพอยู่รอบด้วยสีชมพูและ wellvascularized
. ผนัง follicular และชัดเจนของเหลว follicular
(2) รูขุมต้น atretic ถูกสำรวจโดยน้อยหรือไม่มี
หลอดเลือด และของเหลวขุ่น follicular.
(3) ก้าวหน้ารูขุม atretic อยู่กับเกือบจะไม่มี
หลอดเลือดและสี ofthe ผนัง follicular กลายเป็น
สีเทาและสีขาว.
granulosa เซลล์จากรูขุมขนที่แตกต่างกันของแต่ละ
สถานะ atresia ถูกแยกโดยเจาะรูขุม with5 เข็มมล. และค่อยๆไล่เซลล์ เป็นวัฒนธรรม
ที่มีจาน DMEM-แฮมกลาง F-12
เนื้อเยื่อที่ซับซ้อนและรังไข่คิวมูลัส-ไข่ถูกโยนทิ้ง
ภายใต้กล้องจุลทรรศน์สเตอริโอ granulosa เซลล์ที่ถูก
เก็บเกี่ยวแล้วโดยเหวี่ยงสื่อ (5000 รอบต่อนาทีสำหรับ
10 นาที) เซลล์ Pooled ถูกล้างครั้งสองครั้งในพีบีเอสสำหรับ
ดวงตะวันและเชิงปริมาณแบบ real-time PCR ทดสอบ.
2.3 immunohistochemistry
เพื่อตรวจสอบสถานที่ตั้งของ SIRT1 ในรังไข่สุกร,
เทคนิค immunohistochemistry ได้ดำเนินการกับ
วิธีการใช้ SABC โคลนอลแอนติบอดีของ SIRT1
(Abcam เคมบริดจ์, แมสซาชูเซต) เก็บรวบรวมสดสุกร
รังไข่ได้รับการแก้ไขใน 4% paraformaldehyde ณ ห้อง
อุณหภูมิ 36 ชั่วโมงแล้วเก็บไว้ในเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ 70% การจัดการ
ที่ได้ดำเนินการตามโครงการไว้ก่อนหน้านี้
ที่อธิบาย (Wei et al., 2013) ส่วนบางคนเลือก
สุ่มจากส่วนอนุกรมและติดตั้งอยู่บนสไลด์
ที่เคลือบด้วยลิง (3 aminopropyl-triethoxysilane) และ
แห้งเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ◦C แอนติบอดีถูกเจือจาง 1: 150
ในพีบีเอสที่มี 1% (w / v) ซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA)
และบ่มค้างคืนที่ 4 ◦Cที่มีส่วน เฉพาะ
โปรตีนภูมิคุ้มกันจะถูกมองเห็นด้วย 0.05%
ป้ายใน 10 มิลลิพีบีเอสที่มี 0.01% (v / v) H2O2 2 นาที
และ counterstained กับ hematoxylin การควบคุมเชิงลบ
เป็นซีรั่มกระต่ายปกติ (NRS) แทนหลัก
แอนติบอดีและระดับความสัมพันธ์ของ immunostaining ได้รับการประเมิน
และทำซ้ำอย่างน้อยสี่ครั้ง (Ding et al, 2010;.
. Zhang et al, 2011) ภาพที่ถูกจับภายใต้
กล้องจุลทรรศน์.
2.4 การเพาะเลี้ยงเซลล์ granulosa และการรักษา
สำหรับการทดสอบการตรวจสอบ resveratrol พึ่ง
ผลกระทบวัฒนธรรมหลักของเซลล์ที่มีสุขภาพดี granulosa จาก
รูขุมขน (3-5 มม) ได้รับการคัดเลือก แยก
เซลล์ granulosa นับเซลล์คณะกรรมการการนับ
และเพาะเลี้ยงในแผ่น 6 ดี (1 × 106 / ดี) มี 2 มิลลิลิตร
DMEM-แฮม F-12 ที่มีบีเอสเอ 10% กรด pyruvic 0.01%
ไบคาร์บอเนต 0.22% ที่ 37 ◦ C ในบรรยากาศของ 95% O2: 5%
CO2 เมื่อโชคชะตาของแต่ละเซลล์ดีถึง 75-85%
บรรจบกันกลางก็ถูกแทนที่ด้วยความเข้มข้น resveratrol
ที่ 0 (ควบคุม), 10, 25, 50, 75, 100 MM / L
ขนาดกลางและจากนั้นเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 24 ชั่วโมง granulosa เซลล์จาก
การรักษาแต่ละถูกเก็บรวบรวมจากหลุมและสแน็ป
แช่แข็งสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยที่ตามมาแบบ real-time
PCR และดวงตะวัน.
2.5 แยกอาร์เอ็นเอและเชิงปริมาณแบบ real-time PCR
รวม RNA ถูกสกัดจากเซลล์ granulosa preovulatory ของ
รูขุมขนและจากเซลล์ granulosa รับการรักษาด้วย
ความเข้มข้นแตกต่างกันของ resveratrol โดยใช้ RNeasy
Mini Kit (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี) วัดโดยการวัด
การดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตรและเก็บไว้ ที่ -80 ◦Cจนกว่า
การทดสอบ ยีนสังเคราะห์จาก 2 กรัมของอาร์เอ็นเอทั้งหมดโดยใช้
ชุดแปลงกลับ AidTM สังเคราะห์ cDNA Strand แรก (Fermentas,
เซนต์ Leon Rot, เยอรมนี) ตามที่ผู้ผลิตของ
โปรโตคอล ระดับการแสดงออกของยีน SIRT1 ถูกวัด
โดยวิธี PCR เชิงปริมาณเรียลไทม์โดยใช้ขั้นตอนที่หนึ่ง SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio อิงค์ชิ, ญี่ปุ่น) ใน
แสง Cycler (RocheApplied วิทยาศาสตร์ไฮม์, เยอรมนี).
สะสมระดับของการเรืองแสงได้ วิเคราะห์โดย
วิธีที่สองตราสารอนุพันธ์หลังจากการวิเคราะห์การละลายโค้ง,
และระดับการแสดงออกของยีน SIRT1 ถูกปกติ
ในระดับการแสดงออกของ GAPDH ในแต่ละตัวอย่าง ไพรเมอร์
ลำดับและขนาดสินค้ามีดังนี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สัตว์
จากรังไข่ที่ได้จากผู้ใหญ่ด้วย
tianhuan บริษัทหนานจิง ( โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น ) ก่อน
การฆ่าฟัน สุกร ก่อนให้สติใช้
ต่อไปนี้หมายถึงสวยงามโดยใช้กระแสไฟฟ้าใช้
กับขั้วไฟฟ้า แล้วขึ้นบนรถไฟ หลังจากนั้นพวกเขาจะถูกดูดเลือด
ทางเส้นเลือด ( Wei et al . , 2013 ) .
หลังจากฆ่า