This class has been further subdivi

This class has been further subdivided into hyperactive
Class I + (N100%) and hypoactive Class I−
(b100%) mutants. Class II mutants are able to
undergo only a single round of nucleotide addition,
demonstrating that these polymerases retain the
ability to bind and position an NTP over the active
site but have lost the ability to rapidly carry out
subsequent rounds of processive nucleotide incorporation.
Last, Class III mutants have lost the ability
to add even a single nucleotide, suggesting that
these mutations have significantly disrupted the
structure and function of the active site.
Ser288 mutations
We first examined the effects of an alanine
mutation at Ser288, a residue that adopts two
different conformations so that its side chain can
form hydrogen bonds with either the backbone
amide nitrogen of Asp177 (/up) or the side chain of
Asp238 (/down) (Fig. 3). The S288A mutation
retained the ability to incorporate multiple nucleotides
(Fig. 4B), but the 32P-UMP incorporation
activity was reduced 15-fold, indicating that the
hydrogen bonding to the ring finger and Asp238 is
important but not essential for proper polymerase
function. The crystal structure of the S288A loop
mutant is complicated by the covalent modification of
Cys290 with a dimethyl arsenic adduct, and the
remaining electron density of the loop is very weak,
precluding identification of a preferred loop conformation
and suggesting that it may be more flexible
than in the wild type and the other mutant polymerases
(Fig. 2F).
Gly289 mutations
Comparison of all the 3Dpol structures indicates
that both Ser288 and Gly289 adopt significantly
different backbone torsion angles in the separate
loop conformations. We hypothesized that the
ability of the loop to adopt both the in/down and
the out/down conformation was dependent upon the
flexibility of a glycine at residue 289. To further
examine this, we mutated Gly289 to alanine, a
residue that limits backbone flexibility while minimizing
the potential for adverse side-chain interactions.
The G289A mutation was also generated in
combination with the Class I + and I− mutants at
residue 290. In all cases, the G289A mutation
completely abolishes processive elongation activity
and not even the hyperactive isoleucine or valine
substitutions at residue 290 could compensate for
the effects of the alanine (Table 1). Interestingly, the
single nucleotide addition assay results indicate that
all G289A mutants can incorporate the first nucleotide,
albeit at reduced efficiency, but then fail to
efficiently carry out additional rounds of catalysis
(Fig. 4C). The structures show that the G289A
mutation locks the polymerase in the in/up conformation,
even when combined with mutations that by

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ชั้นนี้มีการเพิ่มเติมปฐมภูมิไปซุกซนผิดปกติคลาฉัน + (N100%) และ hypoactive คลา I−สายพันธุ์ (b100%) ชั้นที่สองสายพันธุ์จะรับเพียงรอบเดียวของนิวคลีโอไทด์นอกจากนี้เห็นที่ polymerases เหล่านี้เก็บไว้ความสามารถในการผูก และวางตัว NTP ใช้งานอยู่เว็บไซต์ แต่ได้สูญเสียความสามารถในการปฏิบัติอย่างรวดเร็วรอบต่อไปของนิวคลีโอไทด์ processive ประสานล่าสุด คลาส III สายพันธุ์ได้สูญเสียความสามารถในจะเพิ่มแม้คำเดียวนิวคลีโอไทด์ แนะนำที่กลายพันธุ์เหล่านี้ได้อย่างมีนัยสำคัญระหว่างสองวันโครงสร้างและหน้าที่ของไซต์ที่ใช้งานอยู่การกลายพันธุ์ Ser288เราตรวจสอบผลของอะลานีนเป็นครั้งแรกการกลายพันธุ์ใน Ser288 สารตกค้างที่ adopts สองconformations แตกต่างกันเพื่อให้โซ่ด้านความสามารถฟอร์มพันธบัตรไฮโดรเจนพร้อมแกนหลักไนโตรเจน amide ของ Asp177 (/ ค่า) หรือโซ่ข้างของAsp238 (/ เป็นที่ลง) (Fig. 3) การกลายพันธุ์ S288Aรักษาความสามารถในการรวมหลายนิวคลีโอไทด์(Fig. 4B), แต่ประสาน UMP 32Pกิจกรรมที่ลด 15-fold ระบุที่ไฮโดรเจนยึดนิ้วและ Asp238 เป็นสำคัญแต่ไม่จำเป็นสำหรับพอลิเมอเรสที่เหมาะสมฟังก์ชัน โครงสร้างผลึกของวง S288Amutant จะซับซ้อน โดยการปรับเปลี่ยน covalentCys290 มีสารหนูเป็น dimethyl adduct และเหลือ อิเล็กตรอนความหนาแน่นของลูปจะอ่อนแอมากรหัส precluding ของ conformation วนที่ต้องการและแนะนำว่า มันอาจจะมีความยืดหยุ่นกว่าชนิดป่าและ polymerases กลายพันธุ์อื่น(Fig. 2F)การกลายพันธุ์ Gly289แสดงการเปรียบเทียบโครงสร้าง 3Dpolที่ Ser288 และ Gly289 นำมาใช้อย่างมีนัยสำคัญมุมแรงบิดแกนหลักแตกต่างกันในการแยกวน conformations เราตั้งสมมติฐานว่าที่ความสามารถของลูปจะนำมาใช้ทั้งที่ใน/ลง และconformation ออกเคลื่อนขึ้นความยืดหยุ่นของ glycine ที่ตกค้าง 289 การเพิ่มเติมตรวจสอบนี้ เรากลาย Gly289 ไปอะลานีน การสารตกค้างที่จำกัดแกนหลักความยืดหยุ่นในขณะที่ลดศักยภาพในการโต้ลูกโซ่ด้านร้ายการกลายพันธุ์ G289A ยังสร้างในร่วมกับคลาฉัน + และสายพันธุ์ I− ที่สารตกค้าง 290 ในทุกกรณี การกลายพันธุ์ G289Aabolishes กิจกรรม processive elongation สมบูรณ์และไม่ซุกซนผิดปกติ isoleucine หรือวาลีนสามารถชดเชยแทนที่ตกค้าง 290ผลของอะลานีน (ตาราง 1) เป็นเรื่องน่าสนใจ การนิวคลีโอไทด์เดี่ยวนี้วิเคราะห์ผลลัพธ์บ่งชี้ว่าสายพันธุ์ G289A ทั้งหมดสามารถรวมตัวแรกนิวคลีโอไทด์แม้ว่าที่ลดประสิทธิภาพ แต่ไม่แล้วดำเนินการเร่งปฏิกิริยารอบเพิ่มเติมได้อย่างมีประสิทธิภาพ(Fig. 4C) โครงสร้างแสดงที่ G289Aการกลายพันธุ์ล็อคการพอลิเมอเรส conformation/ขึ้นเมื่อรวมกับการกลายพันธุ์โดยการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ชั้นนี้ได้รับการแบ่งออกเป็นสมาธิ
Class I + (N100%) และ hypoactive ชั้น I-
(B100%) การกลายพันธุ์ ชั้นที่สองสายพันธุ์ที่มีความสามารถที่จะ
ได้รับเพียงรอบเดียวนอกจากนี้เบื่อหน่าย,
แสดงให้เห็นว่า polymerases เหล่านี้ยังคงมี
ความสามารถในการผูกและตำแหน่ง NTP กว่าที่ใช้งาน
เว็บไซต์ แต่ได้สูญเสียความสามารถในการดำเนินการอย่างรวดเร็ว
รอบที่ตามมาของการรวมตัวกันเบื่อหน่าย processive.
ที่ผ่านมา Class III กลายพันธุ์ได้สูญเสียความสามารถในการ
ที่จะเพิ่มแม้เดี่ยวเบื่อหน่ายชี้ให้เห็นว่า
การกลายพันธุ์เหล่านี้ได้อย่างมีนัยสำคัญกระจัดกระจาย
โครงสร้างและการทำงานของเว็บไซต์ที่ใช้งานอยู่.
Ser288 กลายพันธุ์
ก่อนอื่นเราตรวจสอบผลกระทบของอะลานีน
การกลายพันธุ์ที่ Ser288 สารตกค้างที่ adopts สอง
ที่แตกต่างกัน conformations เพื่อให้ห่วงโซ่ด้านข้างสามารถ
สร้างพันธะไฮโดรเจนกับทั้งกระดูกสันหลัง
ไนโตรเจน amide ของ Asp177 (/ ขึ้น) หรือห่วงโซ่ด้านข้างของ
Asp238 (/ ลง) (รูปที่. 3) การกลายพันธุ์ S288A
สะสมความสามารถในการรวมหลายนิวคลีโอ
(รูป. 4B) แต่การรวม 32P-ขาน
กิจกรรมลดลง 15 เท่าแสดงให้เห็นว่า
พันธะไฮโดรเจนกับนิ้วนางและ Asp238 เป็น
สำคัญ แต่ไม่จำเป็นสำหรับโพลิเมอร์ที่เหมาะสม
ฟังก์ชั่น โครงสร้างผลึกของวง S288A
กลายพันธุ์มีความซับซ้อนโดยการปรับเปลี่ยนโควาเลนต์ของ
Cys290 กับดึงเข้าหาสารหนู dimethyl และ
ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนที่เหลือของวงจะอ่อนแอมาก
precluding บัตรประจำตัวของโครงสร้างห่วงที่ต้องการ
และบอกว่ามันอาจจะเป็นความยืดหยุ่นมากขึ้น
กว่า ในชนิดป่าและกลายพันธุ์อื่น ๆ polymerases
(รูป. 2F).
การกลายพันธุ์ Gly289
เปรียบเทียบทั้งหมดโครงสร้าง 3Dpol แสดงให้เห็น
ว่าทั้งสอง Ser288 และนำมาใช้อย่างมีนัยสำคัญ Gly289
กระดูกสันหลังที่แตกต่างกันในมุมบิดที่แยกต่างหาก
conformations ห่วง เราตั้งสมมติฐานว่า
ความสามารถของวงที่จะนำมาใช้ทั้งใน / ลงและ
ออก / ลงโครงสร้างก็ขึ้นอยู่กับ
ความยืดหยุ่นของไกลซีนที่ 289 ที่เหลือเพื่อเป็นการ
ตรวจสอบนี้เรากลายพันธุ์ Gly289 เพื่ออะลานีน,
สารตกค้างที่ จำกัด มีความยืดหยุ่นกระดูกสันหลัง ในขณะที่ลด
ศักยภาพในการปฏิสัมพันธ์ด้านห่วงโซ่ที่ไม่พึงประสงค์.
การกลายพันธุ์ G289A ยังถูกสร้างขึ้นใน
การรวมกันกับ Class I + และ I- กลายพันธุ์ที่
ตกค้าง 290 ในทุกกรณีการกลายพันธุ์ G289A
สมบูรณ์ยกเลิกกิจกรรมการยืดตัว processive
และไม่ได้ isoleucine สมาธิ หรือ valine
แทนที่ตกค้าง 290 สามารถชดเชย
ผลกระทบของอะลานีน (ตารางที่ 1) ที่น่าสนใจ
ผลการทดสอบนอกจากเบื่อหน่ายเดียวแสดงให้เห็นว่า
การกลายพันธุ์ G289A ทั้งหมดสามารถรวมเบื่อหน่ายแรก
ที่มีประสิทธิภาพแม้จะลดลง แต่ก็ไม่สามารถที่จะ
ดำเนินการได้อย่างมีประสิทธิภาพรอบที่เพิ่มขึ้นของการเร่งปฏิกิริยา
(รูป. 4C) แสดงให้เห็นว่าโครงสร้าง G289A
ล็อคการกลายพันธุ์โพลิเมอร์ในใน / ขึ้นโครงสร้าง,
แม้เมื่อรวมกับการกลายพันธุ์ที่ว่าด้วยการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

คลาสนี้ได้ถูกแบ่งย่อยต่อไปเป็นระดับไฮเปอร์
( 100% ) และ hypoactive ชั้น−
( พลังงาน ) มนุษย์กลายพันธุ์ คลาส 2 สายพันธุ์สามารถ
รับเพียงรอบเดียวของนิวคลีโอไทด์ซึ่ง , ซึ่งแสดงให้เห็นว่า polymerases เหล่านี้รักษา

ความสามารถในการผูกและตำแหน่งเป็น NTP ผ่านเว็บไซต์ปราดเปรียว
แต่ได้สูญเสียความสามารถในการอย่างรวดเร็วดำเนินการ
รอบถัดไปของการ processive นิวคลีโอไทด์ .
ล่าสุด คลาส 3 สายพันธุ์ได้สูญเสียความสามารถ
เพิ่มแม้ซิงเกิลนิวคลีโอไทด์บอกว่า
การกลายพันธุ์เหล่านี้ได้มีการหยุดชะงัก
โครงสร้างและการทำงานของเว็บไซต์ที่ใช้งาน ser288

เรื่องแรกที่เราได้ตรวจสอบผลของอะลานีน
การกลายพันธุ์ที่ ser288 สารตกค้างที่ adopts , 2
โครงสร้างที่แตกต่างกันเพื่อที่ของด้านโซ่สามารถ
พันธะไฮโดรเจนแบบให้กระดูกสันหลัง
ยามค่ำคืนของ asp177 ( / ) หรือด้านโซ่
asp238 ( ล่าง ) ( ภาพที่ 3 ) การ s288a การกลายพันธุ์
รักษาความสามารถในการรวมหลายคู่
( รูปที่ 4B ) แต่ 32p-ump ประสาน
กิจกรรมลดลง 15 เท่า แสดงว่า
พันธะไฮโดรเจนกับนิ้วนางและ asp238 คือ
ที่สำคัญ แต่ไม่ได้สำคัญสำหรับฟังก์ชันการ
เหมาะสม โครงสร้างผลึกของ s288a ห่วง
กลายพันธุ์มีความซับซ้อนโดยมณฑลอันฮุยของ
cys290 กับ Dimethyl สารหนูปุ่มตัวเลือกและ
เหลือความหนาแน่นของอิเล็กตรอนวงอ่อนแอมาก
เลรหัสของห่วงที่ต้องการโครงสร้าง
และบอกว่ามันอาจจะยืดหยุ่นมากขึ้น
กว่าในประเภทป่าและอื่น ๆที่กลายพันธุ์ polymerases
( รูปห้อง 2F )

gly289 การกลายพันธุ์ การเปรียบเทียบของโครงสร้างทั้งหมด 3dpol บ่งชี้
ทั้ง ser288 gly289 อย่างมีนัยสำคัญและอุปการะกระดูกสันหลังบิดมุม
แตกต่างกันในโครงสร้างวงแยกต่างหาก

เราตั้งสมมุติฐานว่า
ความสามารถของลูปเพื่อนำมาใช้ทั้งใน / ลงและออก / ลง

ก็ขึ้นอยู่กับโครงสร้างความยืดหยุ่นของไกลโคเจนที่ตกค้าง 289 . เพื่อเพิ่มเติม
ตรวจสอบนี้เรากลายพันธุ์ gly289 กับอะลานีน ,
กาก
ที่ จำกัด หลักความยืดหยุ่นในขณะที่ลดศักยภาพของโซ่ข้างทวน .
g289a การกลายพันธุ์ถูกสร้างขึ้นในการรวมกันกับชั้น

และ−กลายพันธุ์ที่ตกค้าง 290 ในทุกกรณี g289a การกลายพันธุ์

กิจกรรม processive การยกเลิกอย่างสมบูรณ์และแม้ไฮเปอร์ไอโซลิวซีน หรือเปลี่ยนที่วาลีน
กาก
290 สามารถชดเชยผลกระทบของอะลานีน ( ตารางที่ 1 ) ทั้งนี้ นอกจากวิธีเดียว

ลำดับเบสพบว่าสายพันธุ์ g289a ทั้งหมดสามารถรวมเบสก่อน
แม้ว่าที่ประสิทธิภาพลดลง แต่ล้มเหลวในการได้อย่างมีประสิทธิภาพดำเนินการเพิ่มรอบ

( รูปของปฏิกิริยา 4C )โครงสร้างที่แสดงให้เห็นว่า g289a
มิวล็อคใช้ใน / อัพข้อมูล
แม้เมื่อรวมกับการกลายพันธุ์ที่