electrophoresis and PCR amplicons p

electrophoresis and PCR amplicons purified with the QIAquick PCR
purification kit (Qiagen, 28106, Crawley, West Sussex, UK) according
to manufacturer’s instructions. Sequencing was carried out
using an internal primer pD (50-GTA-TTA-CCG-CGG-CTG-CTG-30;
3.2 pmol ml1) under the following program: 95 C for 2 min, followed
by 35 cycles of 96 C 15 s, 40 C 1 s, 60 C 4 min. Initially, all
isolates were identified by 16S rRNA gene sequencing, but in certain
instances where this was unable to discriminate between species,
amplification and sequencing of pheS and rpoA genes for LAB and
the rpoB gene for aerobic bacteriawas carried out. For amplification
of the pheS and rpoA genes, the reaction mixture was formulated in
the present study using primers described by Naser et al. (2005).
Each pheS amplification reaction was composed of 36.8 ml sterile
high purity water, 5 ml of PCR buffer (with MgCl2) (10; Applied
Biosystems), 5 ml of dNTP (1.25 mmol l1; Promega), 0.5 ml
(21 mmol l1) each of both forward primer; pheS-21-F (50-CAY-CCNGCH-
CGY-GAY-ATG-C-30) and reverse primer; pheS-23-R (50-GGRTGR-
ACC-ATV-CCN-GCH-CC-30), 0.2 ml AmpliTaq DNA polymerase
(5U; Applied Biosystems) and 2 ml template DNA. The thermal
programme consisted of (i) 5 min at 95 C, (ii) 3 cycles of 1 min at
95 C þ 2 min 15 s at 46 C þ 1 min 15 s at 72 C, (iii) 30 cycles of
35 s at 95 C þ 1 min 15 s at 46 C þ 1 min 15 s at 72 C and (iv) a
final 7 min at 72 C. To amplify the rpoA gene, PCR was carried out
using the same reaction mixture and conditions as for the pheS
gene using 0.5 ml (21 mmol l1) each of both forward primer rpoA-
21-F (50-ATG-ATY-GAR-TTT-GAA-AAA-CC-30) and reverse primer
(21 mmol l1) rpoA-23-R (50-ACH-GTR-TTR-ATD-CCD-GCR-CG-30).
Amplification of the rpoB gene was carried out with a mixture
formulated in this study using primers described by De Clerck and
De Vos (2004). The rpoB gene was amplified in a final 50 ml reaction
volume containing 2 ml of chromosomal DNA, 5 ml of PCR buffer
(with MgCl2) (10; Applied Biosystems), 0.5 ml of dNTP
(1.25 mmol l1; Promega), 0.5 ml (21 ml) of forward primer rpoB-f
(50-AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC-30) and 0.5 ml of reverse
primer (21 mmol l1) rpoB-r (50-AAGAACCGTAACCGGCAACTT-30),
0.2 ml Taq DNA Polymerase (5 U; Applied Biosystems), 41.3 ml sterile
high purity water (Sigma). The PCR was achieved under the
following conditions, first denaturation at 94 C for 2 min, followed
by 40 cycles of 94 C for 30 s, 51 C for 45 s, 68 C for 50 s and a final
extension of 68 C for 90 s. All PCR products were checked by
electrophoresis and products of positive reactions purified as
described previously. The forward and/or reverse primers
(3.2 mmol l1) were used for sequencing. Identification of isolates at
genus and species level was carried out by performing a search in
GenBank/EMBL/DDBJ Sequence database using the Basic Local
Alignment Tool (BLAST) programme (National Center for Biotechnology,
MD, USA). All experiments were repeated at least two
times

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

electrophoresis และ PCR amplicons บริสุทธิ์กับ QIAquick PCRชุดฟอก (Qiagen, 28106 วิคครอวเลย์ เวสต์ซัสเซ็กซ์ UK) ตามการแนะนำของผู้ผลิต ลำดับถูกดำเนินการใช้เป็นรองพื้นภายใน pD (50-GTA-TTA-CCG-CGG-CTG-CTG-303.2 pmol ml 1) ภายใต้โปรแกรมต่อไปนี้: C 95 ใน 2 นาที ตามโดยรอบ 35 96 C 15 s, s 40 C 1, 60 นาที C 4 เริ่มแรก ทั้งหมดแยกระบุลำดับ 16S rRNA ยีน แต่ ในบางอินสแตนซ์ที่นี้ไม่สามารถเหยียดระหว่างพันธุ์ขยายและจัดลำดับของยีน pheS และ rpoA สำหรับห้องปฏิบัติการ และยีน rpoB สำหรับ bacteriawas แอโรบิกที่ดำเนินการ สำหรับขยายของยีน pheS และ rpoA ผสมปฏิกิริยาถูกสูตรในการศึกษาปัจจุบันที่ใช้ไพรเมอร์ที่อธิบายโดยศิร et al. (2005)แต่ละปฏิกิริยาขยาย pheS ประกอบด้วยมลกอซ 36.8น้ำบริสุทธิ์สูง 5 ml ของบัฟเฟอร์ PCR (มี MgCl2) (10 นำไปใช้Biosystems), 5 ml ของ dNTP (1.25 mmol l 1 Promega), 0.5 ml(21 mmol l 1) รองพื้นทั้งสองไปข้างหน้า แต่ละ pheS-21-F (50-เคย์ - CCNGCH -CGY-GAY-ATG-C-30) และกลับพื้น pheS-23-R (50 - GGRTGR-ACC-ATV-CCN-GCH-CC-30), 0.2 ml AmpliTaq ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส(5U ใช้ Biosystems) และ 2 ml แบบดีเอ็นเอ ความร้อนโครงการประกอบด้วย (i) 5 นาทีที่ 95 C, (ii) 3 รอบ 1 นาทีที่S 2 นาที 15 þ 95 C ที่ 46 C s 1 นาที 15 þที่ 72 C, (iii) 30 รอบของ35 s ที่ s 1 นาที 15 þ 95 C ที่ 46 C s 1 นาที 15 þที่ 72 C และ (iv) การนาทีสุดท้าย 7 ที่ค. 72 ขยายยีน rpoA, PCR ถูกดำเนินการใช้ส่วนผสมเดียวกันปฏิกิริยาและเงื่อนไขสำหรับการ pheSยีนใช้ 0.5 ml (21 mmol l 1) แต่ละ rpoA รองพื้นไปข้างหน้าทั้งสอง-21-F (50-ATG-ATY-GAR-TTT-GAA-AAA-CC-30) และกลับพื้น(21 mmol l 1) rpoA-23-R (50-ACH-GTR-TTR-ATD-CCD-GCR-CG-30)ขยายของยีน rpoB ที่ดำเนินการด้วยสูตรในการศึกษานี้ใช้ไพรเมอร์โดยเด Clerck และDe Vos (2004) ยีน rpoB ถูกขยายในปฏิกิริยาสุดท้าย 50 mlปริมาตร 2 ml ของ DNA ของโครโมโซม 5 ml ของ PCR บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย(มี MgCl2) (10 ใช้ Biosystems), 0.5 ml ของ dNTP(1.25 mmol l 1 RpoB-f Promega), 0.5 ml (21 มล) พื้นไปข้างหน้า(50-AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC-30) และ 0.5 ml ของกลับสีรองพื้น (21 mmol l 1) rpoB-r (50-AAGAACCGTAACCGGCAACTT-30),0.2 ml Taq DNA พอลิเมอเรส (5 U ใช้ Biosystems), 41.3 มล.ผ่านการฆ่าเชื้อน้ำบริสุทธิ์สูง (ซิกมา) PCR ที่สำเร็จภายใต้การตามเงื่อนไขต่อไปนี้ denaturation แรกที่ 94 C ในนาทีที่ 2โดยรอบ 40 ของ 94 C สำหรับ 30 s, C 51 สำหรับ 45 s, C 68 สำหรับ 50 s และตัวสุดท้ายขยาย C 68 ใน 90 s ผลิตภัณฑ์ PCR ทั้งหมดถูกตรวจสอบโดยelectrophoresis และผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาบวกบริสุทธิ์เป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ไพรเมอร์ไปข้างหน้า หรือย้อนกลับ(3.2 mmol l 1) ใช้สำหรับการจัดลำดับ รหัสของแยกที่ระดับสกุลและชนิดที่ดำเนินการ โดยทำการค้นหาฐานข้อมูลลำดับ GenBank/EMBL/DDBJ โดยใช้พื้นฐานเครื่องโปรแกรมเครื่องมือ (ระเบิด) ตำแหน่ง (ศูนย์แห่งชาติด้านเทคโนโลยีชีวภาพMD สหรัฐอเมริกา) ทดลองทั้งหมดถูกซ้ำสองน้อยครั้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

electrophoresis และ amplicons PCR บริสุทธิ์ด้วยวิธี PCR QIAquick
ชุดฟอก (Qiagen, 28106, Crawley, West Sussex สหราชอาณาจักร) ตาม
คำแนะนำของผู้ผลิต ลำดับได้ดำเนินการ
โดยใช้ไพรเมอร์ภายใน PD (50 GTA-TTA-CCG-CGG-CTG-CTG-30;
3.2 pmol มล 1?) ภายใต้โครงการดังต่อไปนี้: 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตาม?
35 รอบจาก 96 ? C 15 วินาที, 40? C 1 วินาที, 60? C 4 นาที ตอนแรกทุก
สายพันธุ์ที่ถูกระบุโดย 16S rRNA ลำดับยีน แต่ในบาง
กรณีที่นี้คือไม่สามารถที่จะแยกแยะระหว่างสายพันธุ์
ขยายและการหาลำดับเบสของยีนและ pheS RPOA สำหรับ LAB และ
ยีน rpoB สำหรับ bacteriawas แอโรบิกดำเนินการ สำหรับการขยาย
ของ pheS และยีน RPOA, ผสมปฏิกิริยาเป็นสูตรใน
การศึกษาครั้งนี้โดยใช้ไพรเมอร์อธิบายโดย Naser และคณะ (2005).
แต่ละปฏิกิริยาขยาย pheS ประกอบด้วย 36.8 มลผ่านการฆ่าเชื้อ
น้ำที่มีความบริสุทธิ์สูงขนาด 5 ml ของบัฟเฟอร์ PCR (มี MgCl2) (10 ?; Applied
Biosystems) 5 มิลลิลิตร dNTP (1.25 มิลลิโมลต่อลิตร 1;? Promega) 0.5 มล
แต่ละไพรเมอร์ทั้งสองไปข้างหน้า (21 มิลลิโมลต่อลิตร 1?); pheS-21-F (50 CAY-CCNGCH-
CGY- สนามเกย์ ATG-C-30) และไพรเมอร์กลับ; pheS-23-R (50 GGRTGR-
ACC-รถ ATV-CCN-GCH-CC-30), 0.2 มล AmpliTaq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์
(5U; แอพพลายด์) และ 2 มิลลิลิตรแม่แบบดีเอ็นเอ ความร้อน
โปรแกรมประกอบด้วย (i) 5 นาทีที่ 95 องศาเซลเซียส (ii) 3 รอบ 1 นาทีที่
95 องศาเซลเซียสþ 2 นาที 15 วินาทีที่ 46 องศาเซลเซียสþ 1 นาที 15 วินาทีที่ 72? C (iii) 30 รอบ
35 s ที่ 95 องศาเซลเซียสþ 1 นาที 15 วินาทีที่ 46 องศาเซลเซียสþ 1 นาที 15 วินาทีที่ 72 องศาเซลเซียสและ (iv)
สุดท้าย 7 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส เพื่อขยายยีน RPOA, PCR ได้ดำเนินการ
โดยใช้ผสมปฏิกิริยาและเงื่อนไขเช่นเดียวสำหรับ pheS
ยีนโดยใช้ 0.5 มล. (21 มิลลิโมลต่อลิตร? 1) แต่ละไพรเมอร์ทั้งสองไปข้างหน้า rpoA-
21-F (50 ATG-ATY-GAR -TTT-GAA-AAA-CC-30) และไพรย้อนกลับ
(21 มิลลิโมลต่อลิตร? 1) RPOA-23-R (50 ACH-GTR-TTR-ATD-CCD-GCR-CG-30).
ขยายของ rpoB ยีนที่ถูกดำเนินการด้วยส่วนผสม
สูตรในการศึกษาโดยใช้ไพรเมอร์นี้อธิบายโดย De Clerck และ
De Vos (2004) ยีน rpoB ถูกขยายในขั้นสุดท้าย 50 มลปฏิกิริยา
ที่มีปริมาณ 2 มิลลิลิตรของดีเอ็นเอโครโมโซมขนาด 5 ml ของบัฟเฟอร์ PCR
(มี MgCl2) (10 ?; Applied Biosystems) 0.5 มิลลิลิตร dNTP
(1.25 มิลลิโมลต่อลิตร 1;? Promega) 0.5 มล. (21 มล.) ของไพรไปข้างหน้า rpoB-F
(50 AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC-30) และ 0.5 มิลลิลิตรกลับ
ไพรเมอร์ (21 มิลลิโมลต่อลิตร? 1) rpoB-R (50 AAGAACCGTAACCGGCAACTT-30)
0.2 มล Taq DNA Polymerase (5 U; Applied Biosystems) 41.3 มลผ่านการฆ่าเชื้อ
น้ำที่มีความบริสุทธิ์สูง (Sigma) PCR ก็ประสบความสำเร็จภายใต้
เงื่อนไขดังต่อไป, สูญเสียสภาพธรรมชาติเป็นครั้งแรกที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามมา
ได้ถึง 40 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 51 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาที, 68? C เป็นเวลา 50 และสุดท้าย
ขยายจาก 68 ? C เป็นเวลา 90 วินาที ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดของพีซีอาร์ถูกตรวจสอบโดย
electrophoresis และผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาเชิงบวกบริสุทธิ์เป็น
อธิบายไว้ก่อนหน้า ไปข้างหน้าและ / หรือไพรย้อนกลับ
(3.2 mmol L? 1) ถูกนำมาใช้สำหรับการเรียงลำดับ บัตรประจำตัวของเชื้อที่
ประเภทและระดับสายพันธุ์ที่ได้รับการดำเนินการโดยการค้นหาใน
GenBank / EMBL / DDBJ ฐานข้อมูลลำดับโดยใช้ท้องถิ่นพื้นฐาน
เครื่องมือการจัด (ระเบิด) โปรแกรม (แห่งชาติศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพ,
MD, USA) ทุกการทดลองซ้ำแล้วซ้ำอีกอย่างน้อยสอง
ครั้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธี PCR amplicons ให้บริสุทธิ์ด้วย qiaquick PCR
ฟอก Kit ( เพิ่ม 28106 , Crawley , West Sussex , สหราชอาณาจักร ) ตาม
คําแนะนําของผู้ผลิต ลำดับการใช้ไพรเมอร์ออก
PD ภายใน ( 50-gta-tta-ccg-cgg-ctg-ctg-30 ;
3 pmol ml  1 ) ภายใต้โปรแกรมต่อไปนี้ : 95  C เป็นเวลา 2 นาที ตาม
35 รอบ 96  C 15 , 40  C 1 , C 4 นาที 60  ทั้งหมด
ตอนแรก