QUANTITATIVE CONSIDERATIONS: OPSIN

QUANTITATIVE CONSIDERATIONS: OPSIN BIOPHYSICAL PROPERTIES

Many factors control the efficacy of microbial opsins expressed in heterologous systems, not the least of which are cell biological properties ranging from effective transcription, translation, and folding, to proper membrane trafficking and targeting. However, biophysical properties will in many cases be similarly important limiting factors. The most basic of these is the efficiency of light absorption, expressed by the extinction coefficient (εmax). For rhodopsins, εmax is typically between 50,000 and 70,000 M−1 cm−1, less than that of chlorophyll (100,000 M−1 cm−1) but more than that of most other biological chromophores such as flavins (12,000 M−1 cm−1). Another important parameter is quantum efficiency (Φ, the fraction of absorbed photons that are efficacious in driving the relevant conformational change), which varies between 0.3 and 0.7 depending on the opsin species.

Also worthy of detailed consideration is the turnover time of the photocycle, a critical figure of merit both for native function and for neuroscience applications. For the most active transporters (HR and BR), the photocycle turnover time is ∼10–20 msec. Turnover is slower for the blue PR (80–100 msec) (Wang et al. 2003), limiting the development of blue PRs for neuroscience applications. However, even these values come from measurements at zero membrane voltage; the turnover for the fast pumps at a more physiologically negative voltage slows dramatically from 10–20 msec to 100–400 msec (Geibel et al. 2001). Thus, the more negative membrane voltage becomes, the slower the photocycle becomes, and more light is needed to achieve a given increment of hyperpolarization. Interestingly, this also means that by hyperpolarizing the membrane, the pump slows down its own photocycle, an effect that will be enhanced by changes in the electrochemical gradient of the transported ion. In general, however, pump direction is not actually inverted by physiologically achievable membrane potentials or ion gradients. Although such an inversion has been reported for PR, the driving force against the normal pump direction arose from extreme negative voltage and a strong pH gradient; under these conditions, the pump can become leaky as protons are forced onto an internal acceptor (Lörinczi et al. 2009). Generally, pump inversion per se is not expected, especially in physiological settings.

For ChRs the kinetic issues are different. Ion transport (i.e., current) is coupled to occupancy of the conducting state. This, in turn, is determined by light intensity and wavelength, extinction coefficient, and quantum efficiency, as well as by a new factor, the lifetime of the resulting conducting state, dictated by the kinetics of the P520–P480 transition (Fig. 3C). For temporally precise depolarization with a single flash, wild-type ChR2 is adequate. In contrast, because of its extended conducting-state lifetime, the H134R mutation of ChR2 noted above delivers approximately twofold higher photocurrents, although temporal precision is somewhat reduced as a result of moderately slower deactivation (Nagel et al. 2005; Gradinaru et al. 2007; Lin et al. 2009). The SFO variants of ChR2, with the greatly slowed deactivation described above (e.g., C128X) (Berndt et al. 2009), achieve chronic depolarization with even brief light delivery. Moreover, in principle, these variants can achieve the same maximal current magnitudes as wild-type ChR but at much lower light levels (Schoenenberger et al. 2009). For a 10-msec lifetime open state (Ritter et al. 2008), ChR2 would have to be excited ∼100 times per second for a half-saturating stable current. Assuming an absorption cross-section of 2 × 10−20 m2, this would require 5 × 1021 photons/m2-sec (i.e., 5 × 1012 photon/mm-msec or 2 mW/mm2) chronically. However, as a result of the extended-lifetime conducting states, C128T needs 100 times less light and the C128S mutant more than 1000 times less chronic light delivery for the same activity (Berndt et al. 2009).

Accelerating steps in the photocycle can also present certain advantages. For high-frequency neuronal firing, both fast-on and fast-off kinetics are important, requiring fast formation and decay of the P520 photocycle intermediate. Only the ChETA mutations (e.g., ChR2-E123T or E123A) can provide this unique functionality at present. Total current per flash is slightly smaller than for wild-type ChR2 because of the shorter open time, but as long as good expression is achieved, this can be compensated for by slightly more intense or longer flashes (e.g., 2 msec instead of 1 msec) (Gunaydin et al. 2010). Inactivation must also be considered, which is fast but weak in ChR1 and slow but strong in ChR2. Inactivation is more pronounced at high voltage (i.e., weakly negative or positive) and approaches 70% of peak current at pH 7.5. If inactivation of the current becomes problematic, ChR-E123T (Gunaydin et al. 2010), the ChIEF variant (Lin et al. 2009), or ChR2-E90Q (Ritter et al. 2008) might be suitable.

In addition to conducting-state lifetime, the unitary conductance of a channelrhodopsin will also control efficacy, and estimates for this important value range from 30 fS to ∼1 pS for ChR2 (Feldbauer et al. 2009; Lin et al. 2009). In the living alga Chlamydomonas, half-maximal current is carried by 1×106 ions; if there were 10,000 ChRs per eyespot with quantum efficiency of 0.67 (as with BR), this would correspond to 100 ions per ChR (Harz et al. 1992) and a unitary conductance of 0.3 pS. More recent estimates of opsin number (∼100,000 per eyespot) (Sineshchekov et al. 2002; Berthold et al. 2008) put the ions per ChR at 10, and conductance therefore at 30 fS. Recently, this value has been supported by application of noise analysis to purified ChR2 (40 fS) (Feldbauer et al. 2009), although nonstationary fluctuation analysis had resulted in somewhat higher values (>100 fS) (Lin et al. 2009). Despite the uncertainties inherent in all of these methods, the resulting estimates are still reasonably close and together provide useful boundary conditions.

The size of the unitary conductance is also relevant to the prospect of achieving two-photon (2P)–mediated control. Conventional 2P methods pose challenges in this regard, as small excitation volumes with raster-scanning 2P laser systems will typically not recruit sufficient numbers of small-conductance, rapidly deactivating molecules to, for example, drive spiking. Two main approaches are being developed to address this issue, and 2P optogenetic control can now be achieved. First, control of light delivery can be adapted to individual imaged cells to provide spatiotemporally suitable illumination patterns that will recruit sufficient conductance within a single cell and within a temporal window set by current deactivation properties (Rickgauer and Tank 2009). Second, engineered opsins (e.g., SFOs and related mutants in which the deactivation kinetics are altered) can facilitate recruitment of threshold levels of conductance within a given temporal window. In this way, 2P-based recruitment of sparsely distributed cell populations within living tissue can become practical, pointing to the value of continuing to probe the structure–function relationships of the microbial opsins.

The action spectrum is also important, and developing absorbance at longer wavelengths than ChR2 (λmax = 470 nm) is particularly useful for depth penetration, safety, and combinatorial experiments. ChR1 is slightly red-shifted but does not express well and is pH-dependent. VChR1 (Zhang et al. 2008) absorbs at markedly red-shifted wavelengths (λmax = 540 nm), and spiking can be driven even at 589 nm in hippocampal neurons, but expression levels are significantly lower than that of ChR2 in most host cells. The slower decay of the open state (Zhang et al. 2008) partially compensates, but improvement of VChR1 expression will be very important, and a strongly expressing channelrhodopsin that absorbs beyond 550 nm will outperform and be preferable to ChR2 in the future. Indeed, as with VChR1, the channelrhodopsin variants have diverse useful properties but also corresponding limitations. For example, the SFO mutants have reduced dynamic range. Moreover, because of SFO hypersensitivity and the long lifetime of intermediates, in vitro experiments should be maintained at low light to avoid unwanted activation by ambient light. When imaging is required, illumination should be restricted to nonactivating wavelengths (>560 nm). Complete deactivation of the SFO prior to experiments with a long pulse of 590-nm light will ensure that any baseline activity is eliminated and will enable full activation of the SFO with 470-nm light at the desired time

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การพิจารณาเชิงปริมาณ: OPSIN BIOPHYSICAL คุณสมบัติหลายปัจจัยควบคุมประสิทธิภาพของ opsins จุลินทรีย์ที่แสดงในระบบ heterologous ไม่น้อยซึ่งมีคุณสมบัติทางชีวภาพเซลล์ตั้งแต่ transcription มีประสิทธิภาพ การแปล และการ พับ การเมมเบรนที่เหมาะสมในการค้า และการกำหนดเป้าหมาย อย่างไรก็ตาม biophysical คุณสมบัติในหลายกรณีจะรับปัจจัยจำกัดที่สำคัญ พื้นฐานที่สุดของเหล่านี้มีประสิทธิภาพการดูดซึมแสง แสดง โดยสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ (εmax) สำหรับ rhodopsins, εmax ได้ปกติระหว่าง 50000 และ 70000 M−1 cm−1 น้อยกว่าของคลอโรฟิลล์ (100000 M−1 cm−1) แต่มากกว่านั้นส่วนใหญ่อื่น ๆ chromophores ชีวภาพเช่น flavins (12000 M−1 cm−1) พารามิเตอร์ที่สำคัญอื่นประสิทธิภาพควอนตัม (Φ เศษ photons ดูดซึมที่บ็อชในการขับขี่ที่เกี่ยวข้องเปลี่ยนแปลง conformational), ซึ่งแตกต่างกันระหว่าง 0.3 และ 0.7 ตามพันธุ์ opsin ได้Also worthy of detailed consideration is the turnover time of the photocycle, a critical figure of merit both for native function and for neuroscience applications. For the most active transporters (HR and BR), the photocycle turnover time is ∼10–20 msec. Turnover is slower for the blue PR (80–100 msec) (Wang et al. 2003), limiting the development of blue PRs for neuroscience applications. However, even these values come from measurements at zero membrane voltage; the turnover for the fast pumps at a more physiologically negative voltage slows dramatically from 10–20 msec to 100–400 msec (Geibel et al. 2001). Thus, the more negative membrane voltage becomes, the slower the photocycle becomes, and more light is needed to achieve a given increment of hyperpolarization. Interestingly, this also means that by hyperpolarizing the membrane, the pump slows down its own photocycle, an effect that will be enhanced by changes in the electrochemical gradient of the transported ion. In general, however, pump direction is not actually inverted by physiologically achievable membrane potentials or ion gradients. Although such an inversion has been reported for PR, the driving force against the normal pump direction arose from extreme negative voltage and a strong pH gradient; under these conditions, the pump can become leaky as protons are forced onto an internal acceptor (Lörinczi et al. 2009). Generally, pump inversion per se is not expected, especially in physiological settings.For ChRs the kinetic issues are different. Ion transport (i.e., current) is coupled to occupancy of the conducting state. This, in turn, is determined by light intensity and wavelength, extinction coefficient, and quantum efficiency, as well as by a new factor, the lifetime of the resulting conducting state, dictated by the kinetics of the P520–P480 transition (Fig. 3C). For temporally precise depolarization with a single flash, wild-type ChR2 is adequate. In contrast, because of its extended conducting-state lifetime, the H134R mutation of ChR2 noted above delivers approximately twofold higher photocurrents, although temporal precision is somewhat reduced as a result of moderately slower deactivation (Nagel et al. 2005; Gradinaru et al. 2007; Lin et al. 2009). The SFO variants of ChR2, with the greatly slowed deactivation described above (e.g., C128X) (Berndt et al. 2009), achieve chronic depolarization with even brief light delivery. Moreover, in principle, these variants can achieve the same maximal current magnitudes as wild-type ChR but at much lower light levels (Schoenenberger et al. 2009). For a 10-msec lifetime open state (Ritter et al. 2008), ChR2 would have to be excited ∼100 times per second for a half-saturating stable current. Assuming an absorption cross-section of 2 × 10−20 m2, this would require 5 × 1021 photons/m2-sec (i.e., 5 × 1012 photon/mm-msec or 2 mW/mm2) chronically. However, as a result of the extended-lifetime conducting states, C128T needs 100 times less light and the C128S mutant more than 1000 times less chronic light delivery for the same activity (Berndt et al. 2009).Accelerating steps in the photocycle can also present certain advantages. For high-frequency neuronal firing, both fast-on and fast-off kinetics are important, requiring fast formation and decay of the P520 photocycle intermediate. Only the ChETA mutations (e.g., ChR2-E123T or E123A) can provide this unique functionality at present. Total current per flash is slightly smaller than for wild-type ChR2 because of the shorter open time, but as long as good expression is achieved, this can be compensated for by slightly more intense or longer flashes (e.g., 2 msec instead of 1 msec) (Gunaydin et al. 2010). Inactivation must also be considered, which is fast but weak in ChR1 and slow but strong in ChR2. Inactivation is more pronounced at high voltage (i.e., weakly negative or positive) and approaches 70% of peak current at pH 7.5. If inactivation of the current becomes problematic, ChR-E123T (Gunaydin et al. 2010), the ChIEF variant (Lin et al. 2009), or ChR2-E90Q (Ritter et al. 2008) might be suitable.In addition to conducting-state lifetime, the unitary conductance of a channelrhodopsin will also control efficacy, and estimates for this important value range from 30 fS to ∼1 pS for ChR2 (Feldbauer et al. 2009; Lin et al. 2009). In the living alga Chlamydomonas, half-maximal current is carried by 1×106 ions; if there were 10,000 ChRs per eyespot with quantum efficiency of 0.67 (as with BR), this would correspond to 100 ions per ChR (Harz et al. 1992) and a unitary conductance of 0.3 pS. More recent estimates of opsin number (∼100,000 per eyespot) (Sineshchekov et al. 2002; Berthold et al. 2008) put the ions per ChR at 10, and conductance therefore at 30 fS. Recently, this value has been supported by application of noise analysis to purified ChR2 (40 fS) (Feldbauer et al. 2009), although nonstationary fluctuation analysis had resulted in somewhat higher values (>100 fS) (Lin et al. 2009). Despite the uncertainties inherent in all of these methods, the resulting estimates are still reasonably close and together provide useful boundary conditions.
The size of the unitary conductance is also relevant to the prospect of achieving two-photon (2P)–mediated control. Conventional 2P methods pose challenges in this regard, as small excitation volumes with raster-scanning 2P laser systems will typically not recruit sufficient numbers of small-conductance, rapidly deactivating molecules to, for example, drive spiking. Two main approaches are being developed to address this issue, and 2P optogenetic control can now be achieved. First, control of light delivery can be adapted to individual imaged cells to provide spatiotemporally suitable illumination patterns that will recruit sufficient conductance within a single cell and within a temporal window set by current deactivation properties (Rickgauer and Tank 2009). Second, engineered opsins (e.g., SFOs and related mutants in which the deactivation kinetics are altered) can facilitate recruitment of threshold levels of conductance within a given temporal window. In this way, 2P-based recruitment of sparsely distributed cell populations within living tissue can become practical, pointing to the value of continuing to probe the structure–function relationships of the microbial opsins.

The action spectrum is also important, and developing absorbance at longer wavelengths than ChR2 (λmax = 470 nm) is particularly useful for depth penetration, safety, and combinatorial experiments. ChR1 is slightly red-shifted but does not express well and is pH-dependent. VChR1 (Zhang et al. 2008) absorbs at markedly red-shifted wavelengths (λmax = 540 nm), and spiking can be driven even at 589 nm in hippocampal neurons, but expression levels are significantly lower than that of ChR2 in most host cells. The slower decay of the open state (Zhang et al. 2008) partially compensates, but improvement of VChR1 expression will be very important, and a strongly expressing channelrhodopsin that absorbs beyond 550 nm will outperform and be preferable to ChR2 in the future. Indeed, as with VChR1, the channelrhodopsin variants have diverse useful properties but also corresponding limitations. For example, the SFO mutants have reduced dynamic range. Moreover, because of SFO hypersensitivity and the long lifetime of intermediates, in vitro experiments should be maintained at low light to avoid unwanted activation by ambient light. When imaging is required, illumination should be restricted to nonactivating wavelengths (>560 nm). Complete deactivation of the SFO prior to experiments with a long pulse of 590-nm light will ensure that any baseline activity is eliminated and will enable full activation of the SFO with 470-nm light at the desired time

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ต้องคำนึงถึงในเชิงปริมาณ: opsin ชีวฟิสิกส์คุณสมบัติหลายปัจจัยที่ควบคุมประสิทธิภาพของopsins จุลินทรีย์ที่แสดงออกในระบบ heterologous ไม่น้อยซึ่งเป็นเซลล์ชีวภาพตั้งแต่การถอดความที่มีประสิทธิภาพ, การแปลและการพับเพื่อการค้าเมมเบรนที่เหมาะสมและการกำหนดเป้าหมาย อย่างไรก็ตามคุณสมบัติชีวฟิสิกส์จะในหลายกรณีเป็นปัจจัย จำกัด ที่สำคัญในทำนองเดียวกัน พื้นฐานที่สุดของเหล่านี้เป็นประสิทธิภาพของการดูดกลืนแสงแสดงโดยค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ (εmax) สำหรับ rhodopsins, εmaxเป็นปกติระหว่าง 50,000 และ 70,000 M-1 ซม-1 น้อยกว่าที่ของคลอโรฟิล (100,000 M-1 ซม-1) แต่กว่าที่ของ chromophores ทางชีวภาพอื่น ๆ มากที่สุดเช่น flavins (12,000 M-1 ซม 1) อีกตัวแปรที่สำคัญคือประสิทธิภาพควอนตัม (Φ, ส่วนของการดูดซึมโฟตอนที่มีประสิทธิภาพในการผลักดันการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่เกี่ยวข้อง) ซึ่งแตกต่างกันระหว่าง 0.3 และ 0.7 ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์ opsin. นอกจากนี้ยังมีคุณค่าของการพิจารณารายละเอียดเป็นเวลาที่ผลประกอบการของ photocycle ที่ เป็นตัวเลขที่สำคัญของการทำบุญทั้งฟังก์ชั่นพื้นเมืองและสำหรับการใช้งานทางด้านประสาทวิทยา สำหรับการขนส่งใช้งานมากที่สุด (ฝ่ายทรัพยากรบุคคลและ BR) เวลาหมุนเวียน photocycle เป็น ~10-20 มิลลิวินาที ผลประกอบการจะช้าสำหรับพีอาร์สีฟ้า (80-100 มิลลิวินาที) (Wang et al. 2003) จำกัด การพัฒนาของ PRs สีฟ้าสำหรับการใช้งานประสาท อย่างไรก็ตามแม้ค่าเหล่านี้มาจากการวัดแรงดันไฟฟ้าที่ศูนย์เมมเบรน ผลประกอบการในปั๊มอย่างรวดเร็วที่แรงดันไฟฟ้าที่เป็นลบมากขึ้นทางสรีรวิทยาช้าอย่างมาก 10-20 มิลลิวินาทีเพื่อ 100-400 มิลลิวินาที (Geibel et al. 2001) ดังนั้นแรงดันเยื่อเชิงลบมากขึ้นจะกลายเป็นช้าลง photocycle จะกลายเป็นแสงและอื่น ๆ เป็นสิ่งจำเป็นเพื่อให้บรรลุการเพิ่มขึ้นที่กำหนดของ hyperpolarization ที่น่าสนใจนี้ก็หมายความว่าโดย hyperpolarizing เมมเบรน, ปั๊มช้าลง photocycle ของตัวเองผลที่จะเพิ่มขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงในการไล่ระดับสีไฟฟ้าของไอออนขนส่ง โดยทั่วไปแล้วอย่างไรก็ดีทิศทางปั๊มไม่ได้กลับจริงโดยศักยภาพเยื่อทำได้สรีรวิทยาหรือการไล่ระดับสีไอออน แม้ว่าเช่นผกผันได้รับการรายงานสำหรับประชาสัมพันธ์แรงผลักดันกับทิศทางปั๊มปกติเกิดขึ้นจากแรงดันไฟฟ้าในเชิงลบที่รุนแรงและการไล่ระดับความเป็นกรดด่างที่แข็งแกร่ง; ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้จะกลายเป็นเครื่องสูบน้ำที่รั่วเป็นโปรตอนถูกบังคับลงบนใบเสร็จภายใน (Lörinczi et al. 2009) โดยทั่วไปการผกผันปั๊มต่อไม่ได้คาดหวังโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการตั้งค่าทางสรีรวิทยา. สำหรับ CHRS ประเด็นที่เกี่ยวกับการเคลื่อนไหวที่แตกต่างกัน การขนส่งไอออน (เช่นปัจจุบัน) เป็นคู่ที่จะเข้าพักของรัฐดำเนินการ นี้ในที่สุดก็จะถูกกำหนดโดยความเข้มของแสงและความยาวคลื่นค่าสัมประสิทธิ์การสูญเสียและมีประสิทธิภาพควอนตัมเช่นเดียวกับปัจจัยใหม่อายุการใช้งานของรัฐดำเนินการที่เกิดขึ้นไปตามจลนศาสตร์ของการเปลี่ยนแปลง P520-P480 (รูป. 3C ) สำหรับการสลับขั้วแม่นยำชั่วคราวพร้อมแฟลชเดียวชนิดป่า ChR2 เพียงพอ ในทางตรงกันข้ามเพราะอายุการใช้งานการดำเนินการของรัฐที่ขยายของการกลายพันธุ์ H134R ของ ChR2 ระบุไว้ข้างต้นให้ photocurrents ประมาณสองเท่าที่สูงขึ้นแม้ว่าความแม่นยำชั่วคราวจะลดลงค่อนข้างเป็นผลมาจากการเสื่อมช้าลงในระดับปานกลาง (แจคกี้ et al, 2005;.. Gradinaru et al, 2007 ; หลิน et al, 2009). สายพันธุ์ของ SFO ChR2 กับการเสื่อมชะลอตัวลงอย่างมากกล่าวไว้ข้างต้น (เช่น C128X) (Berndt et al. 2009) ประสบความสำเร็จในการสลับขั้วเรื้อรังกับการส่งมอบสั้น ๆ แม้กระทั่งแสง นอกจากนี้ในหลักการตัวแปรเหล่านี้จะประสบความสำเร็จในปัจจุบันขนาดเดียวกันสูงสุดเป็น CHR ป่าชนิด แต่ในระดับที่ต่ำกว่ามากแสง (Schoenenberger et al. 2009) สำหรับอายุการใช้งาน 10 มิลลิวินาทีรัฐเปิด (ริท et al. 2008) ChR2 จะต้องรู้สึกตื่นเต้น ~100 ครั้งต่อวินาทีสำหรับครึ่ง saturating ปัจจุบันที่มีเสถียรภาพ สมมติว่าการดูดซึมข้ามส่วนของ 2 × 10-20 m2 ที่นี้จะต้อง 5 × 1021 โฟตอน / m2 วินาที (เช่น 5 × 1012 โฟตอน / มมมิลลิวินาทีหรือ 2 mW / mm2) เรื้อรัง แต่เป็นผลมาจากการขยายอายุการใช้งานการดำเนินการของรัฐที่ C128T ต้องการ 100 ครั้งแสงน้อยและ C128S กลายพันธุ์มากกว่า 1000 เวลาการจัดส่งแสงเรื้อรังน้อยกว่าสำหรับกิจกรรมเดียวกัน (Berndt et al. 2009). เร่งขั้นตอนในการ photocycle ยังสามารถ ประโยชน์บางอย่างในปัจจุบัน สำหรับความถี่สูงยิงเส้นประสาททั้งสองอย่างรวดเร็วและจลนศาสตร์อย่างรวดเร็วออกที่มีความสำคัญที่ต้องใช้การก่อตัวได้อย่างรวดเร็วและการเสื่อมสลายของ P520 photocycle กลาง เฉพาะการกลายพันธุ์ Cheta (เช่น ChR2-E123T หรือ E123A) สามารถให้การทำงานที่ไม่ซ้ำกันนี้ในปัจจุบัน ปัจจุบันรวมต่อแฟลชขนาดเล็กกว่าเล็กน้อยสำหรับ ChR2 ป่าชนิดเพราะเวลาเปิดสั้น แต่ตราบใดที่การแสดงออกที่ดีคือความสำเร็จนี้สามารถชดเชยด้วยการกะพริบเล็กน้อยที่รุนแรงหรือนานกว่านั้น (เช่น 2 มิลลิวินาทีแทน 1 มิลลิวินาที ) (Gunaydin et al. 2010) การใช้งานนอกจากนี้ยังต้องได้รับการพิจารณาซึ่งเป็นไปอย่างรวดเร็ว แต่อ่อนแอใน ChR1 และช้า แต่แข็งแรงใน ChR2 การใช้งานเป็นที่เด่นชัดมากขึ้นแรงดันสูง (เช่นอ่อนลบหรือบวก) และวิธีการ 70% สูงสุดในปัจจุบันที่ pH 7.5 หากใช้งานในปัจจุบันจะกลายเป็นปัญหา CHR-E123T (Gunaydin et al. 2010), ตัวแปรหัวหน้า (หลิน et al. 2009) หรือ ChR2-E90Q (ริท et al. 2008) อาจจะเหมาะสม. นอกจาก conducting- อายุการใช้งานของรัฐที่เป็นสื่อกระแสไฟฟ้ารวมของ channelrhodopsin ยังจะควบคุมประสิทธิภาพและประมาณการสำหรับช่วงนี้ค่าที่สำคัญตั้งแต่วันที่ 30 FS เพื่อ ~1 pS สำหรับ ChR2 (Feldbauer et al, 2009;. หลิน et al, 2009). ในสาหร่ายที่อาศัยอยู่ Chlamydomonas ที่ปัจจุบันครึ่งสูงสุดจะดำเนินการโดย 1 × 106 ไอออน; ถ้ามี 10,000 CHRS ต่อ eyespot มีประสิทธิภาพควอนตัม 0.67 (เช่นเดียวกับ BR) นี้จะสอดคล้องกับไอออน 100 ต่อ Chr (ฮาร์ซ et al. 1992) และสื่อกระแสไฟฟ้ารวม 0.3 pS ประมาณการล่าสุดของจำนวน opsin (~100,000 ต่อ eyespot) (Sineshchekov et al, 2002;.. Berthold et al, 2008) ใส่ไอออนต่อ Chr ที่ 10 และเป็นสื่อกระแสไฟฟ้าดังนั้นวันที่ 30 FS เมื่อเร็ว ๆ นี้ค่านี้ได้รับการสนับสนุนโดยการประยุกต์ใช้การวิเคราะห์เสียงที่จะบริสุทธิ์ ChR2 (40 FS) (Feldbauer et al. 2009) แม้ว่าการวิเคราะห์ความผันผวนไม่คงที่มีผลในค่าค่อนข้างสูง (> 100 FS) (หลิน et al. 2009) แม้จะมีความไม่แน่นอนที่มีอยู่ในทุกวิธีการเหล่านี้ส่งผลให้ประมาณการยังคงมีเหตุผลร่วมกันอย่างใกล้ชิดและให้เงื่อนไขขอบเขตที่มีประโยชน์. ขนาดของสื่อกระแสไฟฟ้ารวมกันนอกจากนี้ยังมีความเกี่ยวข้องกับความคาดหวังของการบรรลุสองโฟตอน (2P) -mediated ควบคุม ธรรมดา 2P วิธีการก่อให้เกิดความท้าทายในเรื่องนี้เป็นไดรฟ์ขนาดเล็กที่มีการกระตุ้นแรสเตอร์สแกน 2P ระบบเลเซอร์จะมักจะไม่รับสมัครจำนวนที่เพียงพอของสื่อกระแสไฟฟ้าขนาดเล็กอย่างรวดเร็วปิดโมเลกุลเช่นไดรฟ์ spiking สองวิธีหลักที่มีการพัฒนาเพื่อแก้ไขปัญหานี้และ 2P ควบคุม optogenetic ตอนนี้สามารถทำได้ ครั้งแรกของการจัดส่งการควบคุมแสงที่สามารถปรับให้เซลล์ถ่ายภาพของแต่ละบุคคลที่จะให้รูปแบบการส่องสว่างที่เหมาะสม spatiotemporally ที่จะรับสมัครเป็นสื่อกระแสไฟฟ้าเพียงพอภายในเซลล์เดียวและภายในหน้าต่างชั่วคราวที่กำหนดโดยคุณสมบัติเสื่อมปัจจุบัน (Rickgauer และถัง 2009) ประการที่สองการออกแบบ opsins (เช่น SFOS กลายพันธุ์และการที่เกี่ยวข้องในการที่จลนศาสตร์เสื่อมที่มีการเปลี่ยนแปลง) สามารถอำนวยความสะดวกการรับสมัครระดับเกณฑ์ของสื่อกระแสไฟฟ้าภายในหน้าต่างชั่วคราวที่กำหนด ด้วยวิธีนี้การรับสมัคร 2P-based ของการกระจายเบาบางประชากรเซลล์ภายในเนื้อเยื่อที่อยู่อาศัยจะกลายเป็นจริงชี้ไปที่ค่าของอย่างต่อเนื่องเพื่อตรวจสอบความสัมพันธ์ของโครงสร้างและหน้าที่ของจุลินทรีย์ opsins ได้. สเปกตรัมการกระทำเป็นสิ่งที่สำคัญและการดูดกลืนแสงการพัฒนาที่อีกต่อไป ความยาวคลื่นกว่า ChR2 (λmax = 470 นาโนเมตร) เป็นประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการเจาะลึกความปลอดภัยและการทดลอง combinatorial ChR1 เล็กน้อยสีแดงขยับตัว แต่ไม่ได้แสดงความดีและขึ้นอยู่กับค่า pH VChR1 (Zhang et al. 2008) ดูดซับในช่วงความยาวคลื่นที่โดดเด่นสีแดงขยับ (λmax = 540 นาโนเมตร) และ spiking สามารถขับเคลื่อนแม้ที่ 589 นาโนเมตรในเซลล์ hippocampal แต่ระดับการแสดงออกอย่างมีนัยสำคัญต่ำกว่าของ ChR2 ในส่วนเซลล์โฮสต์ สลายตัวช้าลงของรัฐเปิด (Zhang et al. 2008) บางส่วนชดเชย แต่การปรับปรุงในการแสดงออก VChR1 จะมีความสำคัญมากและขอแสดงความ channelrhodopsin ที่ดูดซับเกิน 550 นาโนเมตรจะมีประสิทธิภาพสูงกว่าและเป็นที่นิยมในการ ChR2 ในอนาคต อันที่จริงเช่นเดียวกับ VChR1, สายพันธุ์ channelrhodopsin มีคุณสมบัติที่มีประโยชน์ที่หลากหลาย แต่ยังมีข้อ จำกัด ที่สอดคล้องกัน ยกตัวอย่างเช่นการกลายพันธุ์ SFO มีการลดช่วงแบบไดนามิก นอกจากนี้เนื่องจากการแพ้ SFO และอายุการใช้งานที่ยาวนานของตัวกลางในหลอดทดลองควรจะเก็บรักษาไว้ที่ที่มีแสงน้อยเพื่อหลีกเลี่ยงการเปิดใช้งานที่ไม่พึงประสงค์โดยแสงโดยรอบ เมื่อถ่ายภาพจะต้องส่องสว่างควรจะ จำกัด ให้ความยาวคลื่น nonactivating (> 560 นาโนเมตร) เสื่อมสมบูรณ์ของ SFO ก่อนที่จะมีการทดลองกับชีพจรยาวของแสงที่ 590 นาโนเมตรจะให้แน่ใจว่ากิจกรรมพื้นฐานใด ๆ จะถูกกำจัดออกและจะช่วยให้การเปิดใช้งานเต็มรูปแบบของ SFO ด้วยแสง 470 นาโนเมตรในเวลาที่ต้องการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การพิจารณาเชิงปริมาณ : พซิน

หลายปัจจัยชีวกายภาพคุณสมบัติการควบคุมประสิทธิภาพของจุลินทรีย์ือ พซินแสดงออกในระบบด้วยตัวเอง ไม่ น้อย ซึ่งเป็น เซลล์ คุณสมบัติทางชีวภาพตั้งแต่ขั้นตอนการแปลที่มีประสิทธิภาพและพับเพื่อการค้าเมมเบรนที่เหมาะสมและเป้าหมาย อย่างไรก็ตามคุณสมบัติทางชีวฟิสิกส์จะในหลายกรณีจะเหมือนกับที่สำคัญปัจจัยที่จำกัด . พื้นฐานที่สุดของเหล่านี้คือ ประสิทธิภาพในการดูดซึมแสงแสดงโดยค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ ( εแม็กซ์ ) สำหรับ rhodopsins ε , แม็กซ์ปกติระหว่าง 50 , 000 และ 70 , 000 m − 1 cm − 1 , น้อยกว่าของคลอโรฟิลล์ ( 100000 m − 1 cm − 1 ) แต่มากขึ้นกว่าที่ของอื่น ๆส่วนใหญ่ ชีวภาพ การมีบุตรยาก เช่น flavins ( 12000 m − 1 cm − 1 ) อื่นที่สำคัญเป็นค่าประสิทธิภาพควอนตัม ( Φ สัดส่วนของการดูดซึมโฟตอนที่มีประสิทธิภาพในการขับเคลื่อนการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่เกี่ยวข้อง ) ซึ่งแตกต่างกันระหว่าง 0.6 และ 0.7 ขึ้นอยู่กับพซินชนิด

ยังคุ้มค่าของการพิจารณารายละเอียด คือ การหมุนเวียนของ photocycle เวลา ,