3.1. Analysis of extracted DNAThe q

3.1. Analysis of extracted DNA
The quality of DNA extracts was examined by agarose gel electrophoresis to check for DNA integrity (data not shown). As expected, variations of DNA fragment length were observed depending on the material under examination: raw meat samples showed, in general, intense smears of short and long DNA fragments, ranging from 2000 to 10,000 bp, while DNA from Alheira samples and some tested food ingredients (such as bread and some spices) was visibly more degraded, showing sheared DNA fragments of shorter length.

The purity of the DNA extracts was generally high, ranging from 1.6 to 1.8 for most reference binary meat mixtures. A higher variability of this ratio was observed for the Alheira samples (1.5–2.2) and for most the ingredients used in its productions such as bread, garlic, and spices (1.4–2.0). The DNA yields ranged from 81 to 484 ng μL− 1 for samples, from 62 to 954 ng μL− 1 for food ingredients and from 179 to 981 ng μL− 1 for the different meat species.

The high purity and yield of DNA extracts obtained from the different sources of animal and plant foods indicate the appropriateness of the chosen Wizard method, as previously demonstrated (Mafra, Silva, Moreira, Ferreira da Silva and Oliveira, 2008, Santos et al., 2012 and Soares et al., 2010).

3.2. Specificity and sensitivity of the species-specific PCR assays
In this work, the specific identification of cow was based on the design of new primers (Bos-F/Bos-R) to amplify small DNA sequences of cytb gene (99 bp) as an adequate approach to test processed foods. Since Alheira sausages are fermented and smoked meat products, where DNA can be degraded, it is particularly advised to detect short sequences to enable amplification of fragmented DNA. The in silico analysis confirmed the specificity of the designed primers for the selected B. taurus sequence with 100% identity.

To further assess specificity of the designed primers for B. taurus, as well as the other tested species, each set of primers was assayed by PCR amplification against other animal species commonly used as food, including game and domestic animal meats (DNA extracts from wild boar, duck, partridge, quail, pheasant, chicken, turkey, ostrich, goat and sheep meats) and ingredients generally used in the manufacture of Alheira (DNA extracted from wheat bread, rye bread, garlic, parsley, paprika, onions, white pepper, laurel, chilli, corn and soybean). The results clearly indicated that the primers were only able to produce the expected fragments when the corresponding DNA for which they were designed was present, demonstrating their specificity (data not shown). To confirm that all extracts contained amplifiable DNA, they were submitted to PCR amplification using the universal primers (18SEU-F/18SEU-R) to target the nuclear 18S rRNA gene for eukaryotic DNA, which produced positive amplifications with all extracts (data not shown).

For each species under evaluation, binary model mixtures were prepared containing known amounts of rabbit, red deer or cow meat in pork meat. In the case of pork species, the mixtures were formerly prepared by adding known amounts of pork meat to poultry meat (Soares et al., 2010). Binary mixtures containing hare meat in pork meat were also previously prepared by Santos et al. (2012). The DNA extracts obtained from reference binary mixtures were used to optimise the amplification conditions of each species-specific PCR assay. The optimised PCR conditions allowed achieving a sensitivity of 0.01% for rabbit, cow (Fig. 1A and C) and hare (Santos et al., 2012), and of 0.1% for red deer (Fig. 1B) and pork (Soares et al., 2010).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.1 การวิเคราะห์ดีเอ็นเอแยกคุณภาพของสารสกัดดีเอ็นเอถูกตรวจสอบ โดย agarose เจ electrophoresis เพื่อตรวจสอบความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ (ข้อมูลไม่แสดง) ตามที่คาดไว้ ความแตกต่างของความยาวส่วนของดีเอ็นเอได้สังเกตตามวัสดุภายใต้การตรวจสอบ: ตัวอย่างเนื้อดิบพบ ทั่วไป ชิ้นส่วน smears รุนแรงของดีเอ็นเอในระยะสั้น และยาว ตั้งแต่ 2000 ถึง 10000 bp ขณะดีเอ็นเอจากตัวอย่าง Alheira และส่วนผสมอาหารที่ผ่านการทดสอบบางอย่าง (เช่นขนมปังและเครื่องเทศบาง) ระยะยิ่งเสื่อมโทรม แสดงตัดชิ้นส่วนดีเอ็นเอของความสั้นยาวความบริสุทธิ์ของสารสกัดดีเอ็นเอได้สูงทั่วไป ตั้งแต่ 1.6 ถึง 1.8 สำหรับน้ำยาผสมเนื้อฐานอ้างอิงมากที่สุด สำหรับความผันผวนที่สูงของอัตราส่วนนี้ถูกตรวจสอบ สำหรับตัวอย่าง Alheira (1.5-2.2) และ ในที่สุดวัตถุดิบที่ใช้ในการผลิตขนมปัง กระเทียม และเครื่องเทศ (1.4-2.0) ผลผลิตดีเอ็นเอที่อยู่ในช่วงจาก 81 ไป 484 ng μL− 1 ตัวอย่าง จาก 62 การ 954 ng μL− 1 ส่วนผสมอาหาร และ จาก 179 กับ 981 ng μL− 1 สำหรับพันธุ์เนื้อแตกต่างกันบ่งชี้ความวิธีช่วยท่าน เป็นก่อนหน้านี้ แสดงให้เห็นว่าความบริสุทธิ์สูงและผลผลิตของสารสกัดดีเอ็นเอที่ได้จากแหล่งที่มาของอาหารสัตว์และพืชต่าง ๆ (Mafra, Silva, Moreira, Ferreira da Silva และ Oliveira, 2008, al. และซานโตส 2012 และ Soares et al., 2010)3.2. specificity และความไวของ species-specific PCR assaysในงานนี้ รหัสเฉพาะของวัวเป็นไปตามการออกแบบไพรเมอร์ใหม่ (บอส-F/บอส-R) ขยายขนาดเล็กลำดับดีเอ็นเอของยีน cytb (99 bp) เป็นวิธีการเพียงพอในการทดสอบอาหารแปรรูป เนื่องจาก Alheira ไส้กรอกหมัก และรมควันผลิตภัณฑ์เนื้อสัตว์ ที่ดีเอ็นเอสามารถจะเสื่อมโทรม โดยเฉพาะอย่างยิ่งฑูตอสืบลำดับย่อให้ขยายดีเอ็นเอที่มีการกระจายตัว ที่ใน silico วิเคราะห์ยืนยัน specificity ของการออกแบบไพรเมอร์สำหรับราศีพฤษภเกิดเลือกลำดับมี 100%การประเมิน specificity ของไพรเมอร์ที่ออกแบบมาสำหรับราศีพฤษภเกิด เป็นสายพันธุ์ที่ผ่านการทดสอบอื่น ๆ ต่อไป แต่ละชุดของไพรเมอร์ถูก assayed โดย PCR ขยายพันธุ์สัตว์ที่ใช้เป็นอาหาร รวมเกมและอาหารสัตว์ภายในประเทศ (ดีเอ็นเอแยกจากหมูป่า เป็ด partridge กระทา ไก่ฟ้าสี ไก่ ไก่งวง นกกระจอกเทศ เนื้อแพะและแกะสัตว์) และวัตถุดิบที่ใช้ในการผลิตของ Alheira (DNA สกัดจากข้าวสาลีขนมปังโดยทั่วไปอื่น ๆขนมปังข้าวไรย์ กระเทียม ผักชีฝรั่ง พริกขี้หนู หอม พริกไทยขาว ลอเรล พริก ข้าวโพด และถั่วเหลือง) ผลลัพธ์ชัดเจนระบุว่า ไพรเมอร์ที่ได้ในการผลิตชิ้นส่วนที่คาดไว้เมื่อดีเอ็นเอสอดคล้องกันที่ถูกออกแบบเป็นปัจจุบัน เห็นของ specificity (ข้อมูลไม่แสดง) ยืนยันว่า สารสกัดทั้งหมดประกอบด้วยดีเอ็นเอ amplifiable พวกเขาถูกส่งไปขยาย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์สากล (18SEU-F/18SEU-R) เป้าหมายยีน rRNA 18S นิวเคลียร์สำหรับ DNA eukaryotic ซึ่งผลิต amplifications บวกกับสารสกัดจากทั้งหมด (ข้อมูลไม่แสดง)สำหรับแต่ละชนิดภายใต้การประเมิน น้ำยาผสมรูปแบบไบนารีเตรียมไว้ที่มีชื่อเสียงจำนวนกระต่าย กวางแดง หรือเนื้อวัวเนื้อหมูใน ในกรณีของหมูพันธุ์ น้ำยาผสมถูกเตรียมไว้ โดยการเพิ่มจำนวนรู้จักหมูเนื้อเนื้อสัตว์ปีก (Soares et al., 2010) ชื่อเดิม น้ำยาผสมไบนารีที่ประกอบด้วยกระต่ายเนื้อในเนื้อหมูก่อนหน้านี้ยังได้เตรียมพร้อมโดย Santos et al. (2012) สารสกัดจาก DNA ที่ได้จากน้ำยาผสมไบนารีใช้เงื่อนไขขยายการวิเคราะห์แต่ละ PCR species-specific อินพุทอ้างอิง เงื่อนไข PCR บวมได้บรรลุความไวของ 0.01% สำหรับกระต่าย วัว (Fig. 1A และ C) และกระต่าย (ซานโตส et al., 2012), และ 0.1% กวางแดง (Fig. 1B) และหมู (Soares et al., 2010)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.1 การวิเคราะห์ดีเอ็นเอสกัด
ที่มีคุณภาพของสารสกัดดีเอ็นเอที่ได้รับการตรวจสอบโดย electrophoresis เจล agarose เพื่อตรวจสอบความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) คาดว่าจะเป็นรูปแบบของความยาวชิ้นดีเอ็นเอที่ถูกตั้งข้อสังเกตขึ้นอยู่กับวัสดุที่อยู่ภายใต้การตรวจสอบ: ตัวอย่างเนื้อดิบแสดงให้เห็นโดยทั่วไปรอยเปื้อนที่รุนแรงของสั้นและระยะยาวดีเอ็นเอตั้งแต่ 2,000 ถึง 10,000 bp ในขณะที่ดีเอ็นเอจากตัวอย่าง Alheira และบางส่วนอาหารที่ผ่านการทดสอบ ส่วนผสม (เช่นขนมปังและเครื่องเทศบางคน) เห็นได้ชัดเสื่อมโทรมมากขึ้นแสดงให้เห็นดีเอ็นเอ Sheared ความสั้นยาวที่มีความบริสุทธิ์ของสารสกัดดีเอ็นเออยู่ในระดับสูงโดยทั่วไปตั้งแต่ 1.6-1.8 ส่วนใหญ่อ้างอิงผสมเนื้อไบนารี ความแปรปรวนสูงขึ้นของอัตราส่วนนี้เป็นข้อสังเกตสำหรับตัวอย่าง Alheira (1.5-2.2) และส่วนใหญ่วัตถุดิบที่ใช้ในการผลิตเช่นขนมปังกระเทียมและเครื่องเทศ (1.4-2.0) ผลผลิตดีเอ็นเออยู่ในช่วง 81-484 ศึกษาμL- 1 สำหรับตัวอย่าง 62-954 ศึกษาμL- 1 สำหรับส่วนผสมอาหารและ 179-981 ศึกษาμL- 1 สำหรับสายพันธุ์เนื้อแตกต่างกันมีความบริสุทธิ์สูงและผลผลิตของสารสกัดจาก DNA ที่ได้ จากแหล่งที่มาที่แตกต่างกันของอาหารสัตว์และพืชบ่งบอกถึงความเหมาะสมของวิธีการช่วยสร้างการเลือกที่แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ (Mafra, ซิลวา Moreira, เฟร์ดาซิลวาและ Oliveira, 2008 Santos et al., 2012 และ Soares et al., 2010) . 3.2 ความจำเพาะและความไวของสปีชีส์เฉพาะการตรวจ PCR ในงานนี้เฉพาะเจาะจงวัวก็ขึ้นอยู่กับการออกแบบของไพรเมอร์ใหม่ (บอส-F / บอส-R) จะขยายลำดับดีเอ็นเอเล็ก ๆ ของยีน cytb (99 bp) ในฐานะที่เป็น วิธีการที่เหมาะสมในการทดสอบอาหารแปรรูป ตั้งแต่ไส้กรอก Alheira หมักและผลิตภัณฑ์จากเนื้อสัตว์รมควันที่ดีเอ็นเอสามารถสลายตัวก็ควรโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการตรวจสอบลำดับสั้นเพื่อให้การขยายของดีเอ็นเอแยกส่วน ในการวิเคราะห์ silico ยืนยันความจำเพาะของไพรเมอร์ที่ออกแบบมาเพื่อเลือกลำดับ taurus บีที่มีตัวตน 100% เพื่อเป็นการประเมินความจำเพาะของไพรเมอร์ที่ออกแบบมาสำหรับบีราศีพฤษภเช่นเดียวกับสายพันธุ์ที่ผ่านการทดสอบอื่น ๆ ชุดของไพรเมอร์แต่ละคนได้รับการวิเคราะห์ โดยการขยาย PCR กับสัตว์ชนิดอื่น ๆ ที่ใช้กันทั่วไปว่าเป็นอาหารรวมทั้งเกมและเนื้อสัตว์สัตว์เลี้ยง (DNA สารสกัดจากหมูป่า, เป็ด, นกกระทา, นกกระทา, ไก่ฟ้า, ไก่งวง, นกกระจอกเทศ, แพะและแกะเนื้อ) และส่วนผสมที่ใช้โดยทั่วไปใน การผลิตของ Alheira (DNA ที่สกัดจากข้าวสาลีขนมปัง, ขนมปังข้าวไรย์, กระเทียม, ผักชีฝรั่ง, พริกหยวก, หัวหอม, พริกไทยขาว, ลอเรล, พริก, ข้าวโพดและถั่วเหลือง) ผลอย่างชัดเจนแสดงให้เห็นว่าไพรเมอร์เท่านั้นที่จะสามารถในการผลิตชิ้นส่วนที่คาดว่าเมื่อดีเอ็นเอที่สอดคล้องกันสำหรับการที่พวกเขาได้รับการออกแบบในปัจจุบันแสดงให้เห็นถึงความจำเพาะของพวกเขา (ไม่ได้แสดงข้อมูล) เพื่อยืนยันว่าสารสกัดจากทั้งหมดที่มีดีเอ็นเอ amplifiable พวกเขาถูกส่งไปยังเครื่องขยายเสียง PCR โดยใช้ไพรเมอร์สากล (18SEU-F / 18SEU-R) ในการกำหนดเป้าหมายนิวเคลียร์ 18S rRNA ยีนดีเอ็นเอยูคาริโอซึ่งผลิตเครื่องขยายเสียงบวกด้วยสารสกัดจากทั้งหมด (ไม่ได้แสดงข้อมูล ) สำหรับแต่ละสายพันธุ์ภายใต้การประเมินผลการผสมรูปแบบไบนารีได้จัดทำที่มีจำนวนเป็นที่รู้จักกันของกระต่ายกวางสีแดงหรือเนื้อวัวเนื้อหมู ในกรณีของหมูสายพันธุ์ผสมที่ได้รับการจัดทำขึ้นก่อนโดยการเพิ่มจำนวนเงินที่เป็นที่รู้จักกันของเนื้อหมูเนื้อสัตว์ปีก (Soares et al., 2010) ผสมไบนารีที่มีเนื้อกระต่ายในเนื้อหมูที่ได้จัดทำก่อนหน้านี้โดย Santos et al, (2012) สารสกัดจาก DNA ที่ได้จากการอ้างอิงผสมไบนารีถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการเงื่อนไขการขยายของแต่ละสายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจง-ทดสอบ PCR ปรับสภาพ PCR ได้รับอนุญาตให้บรรลุความไว 0.01% สำหรับกระต่ายวัว (รูปที่ 1A. และ C) และกระต่าย (ซาน et al., 2012) และ 0.1% สำหรับกวางแดง (รูปที่ 1B.) และหมู (Soares เอ al., 2010)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.1 . การวิเคราะห์ของการสกัดดีเอ็นเอ
คุณภาพสารสกัดดีเอ็นเอตรวจสอบโดยเจลอิเล็กเพื่อตรวจสอบความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ ( ข้อมูลไม่แสดง ) ตามที่คาดไว้ , การเปลี่ยนแปลงความยาวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่พบขึ้นอยู่กับวัสดุ ภายใต้การตรวจสอบตัวอย่างเนื้อดิบที่พบโดยทั่วไปของเข้มละเลงสั้น และ ยาว ชิ้นส่วนดีเอ็นเอตั้งแต่ 2000 , 000 BP ,ในขณะที่ดีเอ็นเอจากตัวอย่าง alheira และทดสอบวัสดุอาหาร ( เช่น ขนมปัง และเครื่องเทศบางชนิด ) คือเห็นได้ชัดมากขึ้นซึ่งแสดงตัดดีเอ็นเอของความยาวสั้น

ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้สูงโดยทั่วไปตั้งแต่ 1.6 กับ 1.8 ส่วนใหญ่อ้างอิงแบบเนื้อผสม มีความแปรปรวนสูงอัตราส่วนนี้พบใน alheira ตัวอย่าง ( 1.5 – 22 ) และส่วนใหญ่วัสดุที่ใช้ในการผลิต เช่น ขนมปัง กระเทียม และเครื่องเทศ ( 1.5 – 2.0 ) ดีเอ็นเอผลผลิตมีค่า 81 484 ของμ L − 1 สำหรับตัวอย่างจาก 62 ใน 954 ng μ L − 1 สำหรับส่วนผสมอาหาร และการเข้ามาของμจาก 179 L − 1 สำหรับชนิดแตกต่างกัน

เนื้อ .ความบริสุทธิ์สูงและผลผลิตของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากแหล่งต่าง ๆ ของสัตว์และพืชอาหารระบุความเหมาะสมของวิธีการเลือกตัวที่ก่อนหน้านี้แสดงให้เห็น ( มาฟรา ซิลวา โมไรร่า , แฟร์ไรร่า ดา ซิลวา และ โอลิเวียร่า , 2008 , ซานโตส , et al . , 2012 และ Soares et al . , 2010 ) .

. . ความจำเพาะและความไวของวิธี PCR )
เผ่าพันธุ์ - เฉพาะในงานนี้รหัสเฉพาะของวัว ขึ้นอยู่กับการออกแบบไพรเมอร์ใหม่ ( bos-f / bos-r ) เพื่อขยายขนาดเล็กลำดับดีเอ็นเอของยีน cytb ( 99 BP ) เป็นวิธีการที่เพียงพอที่จะทดสอบอาหารแปรรูป ตั้งแต่ alheira เป็นไส้กรอกหมักและผลิตภัณฑ์เนื้อรมควันที่ดีเอ็นเอสามารถย่อยสลาย มันเป็นโดยเฉพาะอย่างยิ่งควรตรวจหาลำดับให้สั้นแบบแยกส่วนดีเอ็นเอในการวิเคราะห์สำหรับการยืนยันความจำเพาะของการออกแบบไพรเมอร์เพื่อเลือก B . ราศีพฤษภดับ 100% ตัว

เพิ่มเติม ประเมินความจำเพาะของการออกแบบไพรเมอร์สำหรับ B . ราศีพฤษภ , รวมทั้งอื่น ๆทดสอบสายพันธุ์ แต่ละชุดของดีเอ็นเอซีรั่มโดยขยาย PCR กับชนิดอื่น ๆของสัตว์ที่ใช้เป็นอาหารรวมถึงเกมและเนื้อสัตว์ ( DNA ที่สกัดมาจากหมูป่า , เป็ด , นกกระทา , นกกระทา , ไก่ฟ้า , ไก่ , ไก่งวง , นกกระจอกเทศแพะและเนื้อแกะ ) และวัสดุที่ใช้โดยทั่วไปในการผลิต alheira ( DNA ที่สกัดจากขนมปัง , ขนมปังกระเทียม , ผักชีฝรั่ง , พริกหยวก , หัวหอม , พริกไทยขาว , ลอเรล , พริก ข้าวโพด และถั่วเหลือง ข้าวไรย์ข้าวสาลี )ผลอย่างชัดเจน พบว่าไพรเมอร์ เพียงสามารถผลิตชิ้นส่วนดีเอ็นเอ คาดว่าเมื่อที่ซึ่งพวกเขาถูกออกแบบมาเป็นปัจจุบัน แสดงให้เห็นถึงความจำเพาะของพวกเขา ( ข้อมูลไม่แสดง ) เพื่อยืนยันว่าสารสกัดทั้งหมดที่มีอยู่ amplifiable ดีเอ็นเอพวกเขาถูกส่งมาแบบ PCR โดยใช้ primers สากล ( 18seu-f / 18seu-r ) เป้าหมายนิวเคลียร์ 18S rRNA ยีนสำหรับดีเอ็นเอ eukaryotic ซึ่งผลิต amplifications บวกกับสารสกัดทั้งหมด ( ข้อมูลไม่แสดง ) .

สำหรับแต่ละชนิด ภายใต้การประเมินผสมรูปแบบไบนารีเตรียมที่มีรู้จักปริมาณของกระต่าย กวางแดง หรือเนื้อวัวใน เนื้อหมู ในกรณีของสายพันธุ์หมูผสมเตรียมโดยการเพิ่มที่รู้จักเดิมเป็นปริมาณเนื้อหมูเนื้อไก่ ( Soares et al . , 2010 ) ผสมไบนารีที่มีกระต่ายเนื้อ หมูก็เตรียมไว้ก่อนหน้านี้โดยซานโตส et al . ( 2012 ) สารสกัดที่ได้จากผลการอ้างอิงแบบผสมมาใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการเพิ่มเงื่อนไขของแต่ละเผ่าพันธุ์ - เฉพาะโดยการทดสอบวิธีที่ดีที่สุดบรรลุเงื่อนไขได้รับความไวของ 0.01 % สำหรับกระต่าย , วัว ( รูปที่ 1A และ C ) และกระต่ายป่า ( ซานโตส et al . , 2012 ) และ 0.1 % สำหรับกวางแดง ( รูปที่ 1A ) และหมู ( Soares et al . , 2010 )